一种水产品中孔雀石绿快速检测方法与流程

本发明总体涉及食品安全检测领域，具体涉及一种水产品中孔雀石绿快速检测方法。

背景技术：

孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，很早曾经作为杀菌剂、杀虫剂、消毒剂用于水产养殖业。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内也常使用孔雀石绿。但是，孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿具有潜在“三致”作用，对人类健康与环境造成危害。鉴于孔雀石绿的危害性，许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物(观赏鱼除外)。我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物。然而，由于孔雀石绿杀菌、防腐效果好，且价格低廉，所以一些生产者受利益驱动在水产品养殖、运输及贮存中违规使用的情况依然存在。

目前，检测孔雀石绿的方法主要有高效液相色谱法、薄层色谱法、分光光度法、拉曼光谱法、免疫学方法。其中，仪器确证方法虽然检测结果准确、灵敏度高，但其检测时间长、需要昂贵的仪器设备、对操作人员要求较高，不适合大量样本的快速检测。而现有的酶联免疫吸附试验和胶体金快速检测方法虽然检测时间较仪器方法提高较多，但前处理方法仍然较麻烦，或者检测灵敏度差。因而，需要一种新型水产品中孔雀石绿快速检测方法。

技术实现要素：

现有孔雀石绿快检技术中，样本前处理方法采用多种盐离子和有机试剂提取、净化、挥发、复溶，操作费时、费力，而该前处理方法配套的胶体金快速检测技术灵敏度与免疫荧光检测技术相比，灵敏度低。为了克服现有快检技术的不足，本发明的目的在于提供一种样本前处理简单、快速、特异性好、灵敏度高的水产品中孔雀石绿快速检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种水产品中孔雀石绿快速检测方法，鱼虾类水产品均质后，有机试剂提取，用萃取柱处理，收获洗脱液，免疫荧光卡检测。

具体包括以下步骤：

1)称取均质后鱼虾类水产样本至离心管，加入饱和氯化钠、盐酸羟胺和乙酸盐，混匀；加入乙腈后剧烈震荡，再加入中性氧化铝，震荡；离心，取上清液于离心管中待用；

2)活化柱子：乙腈乙酸铵混合液1加至萃取柱；

3)取步骤1)中上清液加入氧化剂，混匀，立即加入萃取柱；

4)用乙酸铵淋洗柱子，然后用乙腈乙酸铵混合液2洗脱，收集洗脱液；再加入pbs混匀即为待测液；

5)将待测液加至免疫荧光卡加样孔，反应后置于荧光读卡仪上判读结果；当检测区在激发光照射下，质控线(c线)和检测线(t线)同时显示橙色荧光，且所述t线比c线深或者显色一致，表明检测结果为阴性；所述t线比c线浅或者不显荧光，表明检测结果为阳性。

所述免疫荧光卡的制备方法，包括以下步骤：制备样品垫——制备结合垫——制备反应膜——制备吸水垫——组装检测卡。其中，在结合垫上涂荧光微球标记的孔雀石绿抗体，在反应膜上喷涂孔雀石绿偶联物抗原溶液，形成检测线(t线)，在所述反应膜上喷涂识别孔雀石绿抗体的二抗溶液，形成质控线(c线)。

在本发明中，首先利用有机试剂最大效率提取待测样本，然后利用强阳离子交换萃取柱纯化、浓缩样本中待测物，同时在洗脱柱前用盐离子液淋洗柱子，尽可能去除柱内残留的有机试剂，避免有机试剂对检测卡显色产生不良影响，洗脱柱后待测液也可快速进行检测。样本前处理过程使用强阳离子交换萃取柱，表面看和仪器检测前处理方法类似，但实际进行了大幅度的创新。仪器前处理使用多种有机试剂进行提取浓缩，但本发明中提取液无需浓缩、纯化。同时，为了保证洗脱液体中的有机试剂不影响检测卡显色，采用混合液活化柱子，然后使用盐离子和有机试剂混合液洗脱柱子达到较好提取效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、强阳离子交换柱子萃取柱取代传统繁琐的的有机试剂挥发、复溶过程，不需要仪器设备即可完成操作。

2、样本中孔雀石绿结合萃取柱淋洗后，不需要消耗较长时间挥发萃取柱上的有机试剂，直接洗脱即可。

3、免疫荧光检测卡取代免疫胶体金检测卡，大大提高了检测的灵敏度。与萃取柱的优势进行互补，发明一种前处理简单、灵敏度高、特异性好的水产品中孔雀石绿快速检测方法。

附图说明

图1为具体实施方式中孔雀石绿荧光检测试纸条的侧面图。

图2为具体实施方式中孔雀石绿荧光检测试纸条的俯视图。

其中，各标号分别代表：1.样品垫2.结合垫3.反应膜4.检测线5.质控线6.吸水垫.7.底板。

具体实施方式

下面通过具体实施例详细描述本发明的一种水产品中孔雀石绿快速检测方法。本领域技术人员应当理解，下面描述的实施例仅是对本发明的示例性说明，而非用于对其作出任何限制。

1、孔雀石绿提取

1.1鱼虾等水产品去皮(壳)后，取肉20-30g左右，用均质器均质后，称取3g至50ml离心管中。加入0.5ml饱和氯化钠、0.1ml盐酸羟胺和1ml乙酸盐，混匀1min。加入4ml乙腈后剧烈震荡3min，再加入1g中性氧化铝，震荡1min。4000rpm以上离心5min，取3ml上清液于10ml离心管中待用。

饱和氯化钠：称取氯化钠200g，加水500ml，超声使其充分溶解。

盐酸羟胺：称取2.5g盐酸羟胺，用水溶解并稀释至10ml，混匀。

乙酸盐：称取4.95g无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸溶解于950ml水中，用冰乙酸调节溶液ph为4.5，用水稀释至1l，混匀。

1.2过柱

1.2.1萃取柱的选择

选用prs固相萃取柱，厂家：德国simonaldrich，规格：质量100mg、体积1ml、平均粒径45μm，填料名称：丙基磺酸，以硅胶为基质的强阳离子交换萃取柱。该萃取柱结合孔雀石绿能力较强，非常适合孔雀石绿的提取。

1.2.2确定活化柱子条件

1.2.2.1确定最佳活化溶液

分别选取单一溶液活化：浓度为0.01mpbst、乙腈和ph7.2浓度为0.1m乙酸铵1000μl活化柱子；选取乙腈和浓度为0.1m的乙酸铵混合液1000μl活化柱子，乙腈和浓度为0.1m的乙酸铵体积比分别为0:1、1:1、1:2、1：3、3:1和2:1。确定柱子最佳活化溶液。

1.2.2.2确定活化溶液体积。最佳活化溶液分别设定250μl、500μl、1000μl和1500μl。通过检测活化前后液体滴加检测卡上阴性结果显色情况及活化时间，最终确定500μlph7.20.1m乙酸铵和乙腈等比例活化效果最好。

1.2.3确定过柱液体流速：取1ml浓度为1ppm孔雀石绿液体，流速按0.5滴/2s、1滴/2s、2滴/2s、3滴/2s过柱，结果1滴/2s过柱效果较好。

1.2.4确定洗脱过程：取1ml浓度为1ppm孔雀石绿液体，迅速按1滴/2s的速度过柱，接着用不同体积(250μl、500μl、1000μl和1500μl)ph7.20.1m乙酸铵淋洗柱子或者不经过淋洗直接洗脱，结果500μlph7.20.1m乙酸铵淋洗柱子效果最好，柱上绿色孔雀石绿洗脱最完全。

1.2.5确定洗脱液体积：分别用不同体积比(1：0、1：1、1：2、2：1、3：1)的500μlph7.00.1m乙酸铵和乙腈混合液洗脱，结果500μlph7.20.1m乙酸铵和乙腈按2:1体积比例混合洗脱效果最好。

1.2.6柱子按最优方式活化后，从1.1中获取上清液，加入100μl氧化剂混匀，立即按1滴/2s速度过柱，然后以最优方式淋洗去除有机试剂，500μlph7.20.1m乙酸铵和乙腈按2:1体积比例混合洗脱。

1.3免疫荧光卡检测

1.3.1荧光检测卡的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备样品垫1，裁取1.2cm×18cm的玻璃纤维素膜，将其均匀浸泡于封闭液中20min，真空干燥，得到样品垫1备用；

(2)制备结合垫2：裁取0.6cm×15cm的玻璃纤维膜，取适量的荧光微球标记的孔雀石绿抗体0.8ml涂在玻璃纤维膜上，37℃干燥2h，得到结合垫2；

(3)制备反应膜3：取宽20mm的反应膜3喷涂孔雀石绿偶联物抗原溶液，形成检测线4，在所述反应膜3上喷涂识别孔雀石绿抗体的二抗溶液，形成质控线5；

(4)制备吸水垫6：裁取1.4cm×18cm的吸水垫6；

(5)组装检测卡：取市场上购买的60mm底板7，在底板7上依次粘贴所述样品垫1、所述结合垫2、所述反应膜3和所述吸水垫6；

(6)装卡：把大板切成4mm宽荧光检测试纸条放入卡底，盖上卡盖，即成检测卡。

1.3.2待测液加样检测：洗脱液用ph7.20.01mpbs按1:3体积比例稀释即为待测液。将待测液加至免疫荧光卡加样孔，反应10min后置于荧光读卡仪上判读结果。当检测区在激发光照射下，质控线(c线)和检测线(t线)同时显示橙色荧光，且所述t线比c线深或者显色一致，表明检测结果为阴性；所述t线比c线浅或者不显荧光，表明检测结果为阳性。

1.4检测限确定

通过在阴性样本中分别添加终浓度为0、0.5、1、2、3和4μg/kg的孔雀石绿标准品，充分震荡混匀即为加标样本。然后按照1.1、1.2步骤进行样本提取，然后按照1.3.2步骤检测样本，孔雀石绿在2μg/kg及以上浓度，判定为阳性结果。因此，这种快检方法检测限为2μg/kg。