一种盐酸去甲乌药碱注射液有关物质检测方法与流程
本发明涉及一种盐酸去甲乌药碱注射液有关物质检验方法，属于药物分析技术领域。
背景技术：
盐酸去甲乌药碱，英文名：higenaminehydrochloride，化学名称为：1-(4-羟基-苄基)-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐，分子式为：c16h17no3.hcl，化学结构式如下：
对药物制备和存储过程中，对可能产生的杂质进行分析检测，对于最终产品的质量及药品的质量控制非常重要。
本公司原检测方法中关于盐酸去甲乌药碱有关物质的检测方法如下：
色谱柱：capcellpakc18mg(s-5)，型号为4.6mm×250mm；流速1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；检测波长：284nm；流动相a1：0.05mol/l乙酸铵溶液；流动相b1：乙腈，其中乙酸铵溶液用冰乙酸调节ph至3.5，进行梯度洗脱，洗脱过程如下：
待系统稳定后，分别进对照溶液、测试溶液、系统适用性对照品溶液，记录色谱图。
该方法公开了一种盐酸去甲乌药碱有关物质的测定方法，可测定盐酸去甲乌药碱及其中间体的杂质，但盐酸去甲乌药碱在碱、氧化条件下时可产生降解杂质，这些降解杂质峰与盐酸去甲乌药碱注射液中的辅料峰有重叠，原检测方法不能检测出盐酸去甲乌药碱注射液中与辅料峰有重叠的降解杂质。本发明提供一种能够排除辅料干扰的盐酸去甲乌药碱注射液有关物质的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种盐酸去甲乌药碱注射液有关物质检验方法，该方法便捷、高效、准确，在系统适用性、专属性、精密度、溶液稳定性和样品测定等方面完全符合中国药典方法验证的指导原则，可用于盐酸去甲乌药碱注射液的质量控制。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种盐酸去甲乌药碱注射液有关物质检验方法，包括以下步骤：
（1）配制溶液，分别配制空白溶液2、辅料空白溶液、参比溶液、灵敏度溶液和测试溶液，所述辅料空白溶液包括辅料储备溶液，所述测试溶液包括测试溶液s和测试溶液p。
（2）测定方法：待系统稳定后，分别将空白溶液2、辅料空白溶液、参比溶液、灵敏度溶液和测试溶液注入液相色谱仪，记录色谱图,色谱条件如下:色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0±0.1ml/min；柱温：30±5℃；进样量：10-20μl；检测波长：280-290nm；流动相为edta二钠：甲醇体系，进行梯度洗脱。
所述辅料空白溶液的配制步骤为：移取辅料储备溶液，置于容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
所述参比溶液：称取适量盐酸去甲乌药碱对照品，置于容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。再从上述溶液中移取适量于容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
所述灵敏度溶液：移取适量参比溶液，置于容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
所述测试溶液s：称取适量盐酸去甲乌药碱，置于容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
所述测试溶液p：量取适量盐酸去甲乌药碱注射液，置于容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
所述流动相为：
流动相a2：0.05%edta二钠溶液；
流动相b2：甲醇。
所述稀释液为0.05%edta二钠溶液。
所述空白溶液2为稀释液。
所述辅料储备溶液是用水溶解稀释edta二钠，用盐酸调节ph至3.5制得。
所述edta二钠为ar及以上。
所述甲醇为hplc级。
所述水为hplc级。
所述色谱柱为capcellpakc18mg(s-5)4.6×250。
所述流动相梯度过程如下：
更优选的，本发明所述的测定方法，包括以下步骤：
（1）配制溶液，分别配制空白溶液、辅料空白溶液、参比溶液、灵敏度溶液和测试溶液；
所述辅料空白溶液2的配制步骤为：精密量取辅料储备溶液4.0ml，置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
所述辅料储备溶液：取edta二钠25mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。用盐酸调节ph至3.5。
所述参比溶液：精密称取25mg盐酸去甲乌药碱对照品，置50ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
所述灵敏度溶液：精密量取参比溶液1.0ml，置20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
所述测试溶液s：精密称取25mg盐酸去甲乌药碱，置于50ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
所述测试溶液p：精密量取4.0ml盐酸去甲乌药碱注射液，置于10ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
所述空白溶液2：0.05%edta二钠溶液。
（2）测定方法：待系统稳定后，空白溶液2进1针，辅料空白溶液1针，灵敏度溶液，参比溶液1针，测试溶液1针，记录色谱图,色谱条件如下:色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；检测波长：284nm；流动相为edta二钠：甲醇体系，进行梯度洗脱。
所述色谱柱可为capcellpakc18mg(s-5)4.6×250；
所述流动相为：
流动相a2：0.05%edta二钠溶液；
流动相b2：甲醇；
所述流动相梯度过程如下：
所述的盐酸去甲乌药碱注射液有关物质检验方法还包括在检测之前的方法验证，该方法验证为按照正式检测的色谱条件，测定结果为：
有益效果
由以上技术方案可知，本发明所述的检测方法对添加了辅料的盐酸去甲乌药碱注射液有关物质的色谱峰分离度高、具有较高的系统适用性，同时在专属性、精密度和溶液稳定性都符合标准。本发明利用方便快捷的高效液相色谱法，对盐酸去甲乌药碱注射液有关物质的检测，可用于监测盐酸去甲乌药碱注射液的质量。本发明首次提出了能够排除辅料干扰的盐酸去甲乌药碱注射液有关物质的检测方法，具有准确度高、精密度高、重现性好、稳定性好、专属性强等特点，同时本发明的测定方法操作简单，所用时间比较短，成本低，耗时短。
附图说明
图1为对比例1盐酸去甲乌药碱注射液有关物质空白溶液1的液相色谱图；
图2为对比例1盐酸去甲乌药碱注射液有关物质辅料对照溶液的液相色谱图；
图3为对比例1盐酸去甲乌药碱注射液有关物质测试溶液的液相色谱图；
图4为盐酸去甲乌药碱注射液有关物质灵敏度溶液的液相色谱图；
图5为盐酸去甲乌药碱注射液有关物质辅料空白溶液2的液相色谱图；
图6为盐酸去甲乌药碱注射液有关物质灵敏度溶液的液相色谱图；
图7为盐酸去甲乌药碱注射液有关物质参比溶液的液相色谱图；
图8为盐酸去甲乌药碱注射液有关物质测试溶液的液相色谱图；
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步解释和说明本发明，但并不以任何方式限制本发明的范围。
对比例1
（1）实验材料与仪器条件
仪器：高效液相色谱仪agilent1260；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（指定：capcellpakc18mg(s-5)4.6x250mm）；流动相：流动相a1为0.05mol/l乙酸铵溶液（用冰醋酸调节ph至3.5），流动相b1为乙腈；流速：1.0ml/min；检测波长：284nm；进样量：20ul；洗脱方式：按下表进行梯度洗脱：
（2）实验步骤
溶液配制：
空白溶液1：流动相a1-流动相b1（93:7）的混合液
系统适用性对照品溶液：取盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品（含杂质a，杂质b）约25mg，精密称定，置50mg量瓶中，加流动相a1-流动相b1（93:7）的混合液溶解并稀释至刻度，摇匀；制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为系统适用性对照品溶液。
供试品溶液：精密移取系统适用性对照品溶液4.0ml，置10mg量瓶中，加流动相a1-流动相b1（93:7）的混合液溶解并稀释至刻度，摇匀；制成每1ml中含0.5mg的供试品溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相a1-流动相b1（93:7）的混合液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
辅料对照溶液：取乙二酸四乙酸二钠约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取4.0ml，置10mg量瓶中，加流动相a1-流动相b1（93:7）的混合液稀释至刻度，摇匀；作为辅料对照溶液。
（3）测定方法
待系统稳定之后，分别将空白溶液1，辅料对照溶液，对照溶液，供试品溶液，系统适用性对照溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，根据色谱图计算有关物质的含量。
理论板数：按盐酸去甲乌药碱计算不低于5000。
结果：
实施例1
(1)实验材料与仪器条件
仪器：高效液相色谱仪：agilent1260；色谱柱：capcellpakc18mg(s-5)4.6mm×250mm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；检测波长：284nm，流动相：a2：0.05%edta二钠溶液；流动相b2：甲醇；
（2）实验步骤
稀释液：0.05%edta二钠溶液；
空白溶液2：稀释液；
参比溶液：精密称取25mg盐酸去甲乌药碱对照品，置50ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
灵敏度溶液：精密量取参比溶液1.0ml，置20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
杂质a参比溶液：取杂质a对照品适量，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质b参比溶液：取杂质b对照品适量，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
辅料储备溶液：取edta二钠25mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。用盐酸调节ph至3.5。
辅料空白溶液：精密量取辅料储备溶液4.0ml，置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
混合参比溶液：取参比溶液、杂质a参比溶液、杂质b参比溶液各适量，加稀释液稀释使各成分峰面积均为1/10参比溶液中主成分的峰面积。
测试溶液s：精密称取盐酸去甲乌药碱约25mg，置于50ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
测试溶液p：精密量取4.0ml盐酸去甲乌药碱注射液，置于10ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
分别于0天、1天、2天配制测试溶液s及测试溶液p各1份。
氧化降解空白溶液s：量取30%h2o22ml，置于50ml容量瓶中，室温放置30min，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
氧化降解测试溶液s：精密称取25mg盐酸去甲乌药碱，置50ml量瓶中，加30%h2o22ml，室温放置30min，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
氧化降解空白溶液p：精密量取辅料储备溶液4.0ml，置于10ml容量瓶中，加30%h2o22ml，室温放置30min，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
氧化降解测试溶液p：精密量取盐酸去甲乌药碱注射液4.0ml，置10ml量瓶中，加30%h2o22ml，室温放置30min，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
碱降解空白溶液s：量取0.1mol/l的naoh溶液2ml，置50ml量瓶中，室温放置10min，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
碱降解测试溶液s：精密称取25mg盐酸去甲乌药碱，置50ml量瓶中，加0.1mol/l的naoh溶液2ml，室温放置10min，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
碱降解空白溶液p：精密量取辅料储备溶液4.0ml，置于10ml容量瓶中，加0.1mol/l的naoh溶液2ml，室温放置10min，加稀释液稀释至刻度，摇匀。
碱降解测试溶液p：精密量取盐酸去甲乌药碱注射液4.0ml，置10ml量瓶中，加0.1mol/l的naoh溶液2ml，室温放置10min，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
待系统稳定后，进1针空白溶液2，辅料空白溶液1针，参比溶液1针，灵敏度溶液1针，测试溶液1针，记录色谱图。
rs：参比溶液中盐酸去甲乌药碱的峰面积；
cs：对照溶液中盐酸去甲乌药碱的浓度；
cu：测试溶液中盐酸去甲乌药碱的浓度。
实施例2本发明所述检测方法系统适用性试验
在序列的开始考察系统适用性；系统适用性是通过测定参比溶液的重复性而实现的，参比溶液中盐酸去甲乌药碱峰面积的rsd%≤10.0%。同时要求灵敏度溶液主峰信噪比s/n≥10。如实施例1所述配制空白溶液2、辅料空白溶液、参比溶液和灵敏度溶液，待系统稳定后，先运行系统梯度空白1次，再空白溶液2进1针，辅料空白溶液1针，参比溶液5针，灵敏度溶液1针，记录色谱图。
实施例3本发明所述检测方法专属性试验
方法的专属性研究考察峰鉴别和选择性，要求主峰与相邻杂质峰之间的分离度≥1.5，灵敏度溶液信噪比（s/n）≥10，空白溶剂对检测无明显干扰。待系统平衡后，空白溶液2进1针、参比溶液1针，辅料空白溶液1针，杂质a参比溶液1针，杂质b参比溶液1针，混合参比溶液1针，测试溶液s1针，测试溶液p1针，记录色谱图，得出专属性检测结果如下。
实施例4本发明所述检测方法重复性试验
（1）重复性：重复性是通过测定6份测试溶液(原料及注射液)而实现的，要求6次测定结果之间的rsd符合可接受标准。如实施例1所述配制测试溶液；待系统平衡后，空白溶液2进1针，参比溶液1针，6份测试溶液s，6份测试溶液p各1针，记录色谱图。
实施例5本发明所述检测方法的溶液稳定性
考察测试溶液在测试期间内检测结果随时间变化的规律，为检测时供试品溶液的放置时间提供依据。要求测试溶液单个杂质的偏差低于限度的50%，总杂质的偏差低于限度的10%；主峰纯度≥990。主峰含量rsd%≤2.0%。如实施例1所述配制空白溶液2、参比溶液、测试溶液s0天、测试溶液s1天，测试溶液s2天、测试溶液p0天、测试溶液p1天、测试溶液p2天，待系统稳定后，进空白溶液2、参比溶液、测试溶液0天、测试溶液1天、测试溶液2天各1针，记录色谱图，得出如下结果：
实施例6本发明所述检测方法的强降解试验
强制降解试验是在各种强度较大的环境因素下对样品进行破坏，目的是通过考察样品的降解产物和主峰以及已知杂质的分离情况，从而来评估分析方法的有效性和适用性。同时，为该药品的包装、运输及贮存条件等提供参考依据。要求主峰纯度≧990，质量平衡：95.0%~105.0%。如实施例1所述配制空白溶液2、参比溶液、辅料空白溶液、测试溶液s、测试溶液p、氧化降解空白溶液s、氧化降解测试溶液s、氧化降解空白溶液p、氧化降解测试溶液p、碱降解空白溶液s、碱降解测试溶液s、碱降解空白溶液p、碱降解测试溶液p；
待系统稳定后，进各浓度溶液各1针，记录色谱图，得出如下结果：
实施例7本发明所述检测方法的样品测定
通过测定多个批次盐酸去甲乌药碱及盐酸去甲乌药碱注射液中的杂质含量，来对比各相应批次原料药和制剂产品的杂质谱和含量，评定所述检测方法能准确检测与辅料峰重叠，可能存在于产品中的潜在降解杂质。
如实施例1所述配制空白溶液2、参比溶液、辅料空白溶液、灵敏度溶液、各个批次的测试溶液s、测试溶液p。
待系统稳定后，进各浓度溶液各1针，记录色谱图，得出如下结果：
以上实施例仅为本发明的优选实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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