本发明涉及生物医药
技术领域：
，尤其涉及一种精氨酸异构体的检测方法。
背景技术：
：精氨酸有l-型和d-型，天然存在的为l-精氨酸，l-精氨酸的生产方法主要为微生物发酵法，在生产过程中d-精氨酸的产生是难以避免的。为了提高和保证l-精氨酸产品质量，必须要严格控制d-精氨酸的含量。目前，关于精氨酸中异构体的含量的检测方法鲜有报道，且精氨酸为一种α-氨基酸，紫外波长下为末端吸收，导致在l-精氨酸生产过程中，无法灵敏、准确的控制d-精氨酸含量。技术实现要素：针对现有l-精氨酸生产工艺中d-精氨酸的含量难以被灵敏、准确的测定而影响l-精氨酸产品质量等问题，本发明提供一种精氨酸异构体的检测方法。为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：一种精氨酸异构体的检测方法，包括如下步骤：(1)取d-精氨酸对照品制备对照品水溶液，将对照品水溶液与衍生试剂配制成对照品溶液；(2)取待测品制备待测品水溶液，将待测品水溶液与衍生试剂配制成待测品溶液；(3)分别取所述对照品溶液及待测品溶液，用液相色谱法进行检测，采用外标法计算待测品中d-精氨酸的含量；所述液相色谱的色谱条件为：波长225～235nm；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为25～35℃；流动相：流动相a为0.05mol/l乙酸铵溶液-乙腈，流动相b为乙腈；进样温度为2-8℃，进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如下：0min：100％a+0％b；20min：100％a+0％b；35min：80％a+20％b；37min：80％a+20％b；37.1min：100％a+0％b；45min：100％a+0％b。相对于现有技术，本发明提供的精氨酸异构体的检测方法，将同时含有l-精氨酸和d-精氨酸的待测品水溶液与衍生试剂混合配制成待测品溶液，使精氨酸与衍生试剂发生衍生反应，在精氨酸分子上引入具有强紫外吸收的基团，使检测波长变为225～235nm(对应有较强的紫外吸收)，克服了因精氨酸末端吸收导致的液相条件无法有效检出的难点，提高检测的灵敏度；同时，采用衍生的方法，使l-精氨酸和d-精氨酸的衍生物可有效分离，通过检测精氨酸衍生物改善了精氨酸异构体在色谱条件下的分离度，提升检测的准确度；此外，在2-8℃条件下，采用线性梯度洗脱，保证峰面积的稳定性的同时，进一步地改善精氨酸异构体的分离度，提升检测的准确度。采用该方法能够有效控制l-精氨酸中的d-精氨酸含量，保障l-精氨酸产品质量。进一步地，所述衍生试剂由摩尔比为1-1.05:1的邻苯二醛和n-乙酰-l-半胱氨酸的混合物与硼酸缓冲液配制而成。其中，邻苯二醛与n-乙酰-l-半胱氨酸以摩尔比1:1和精氨酸发生衍生反应，为保证反应彻底，又避免过量衍生试剂带来的杂质干扰，使邻苯二醛稍过量，提高检测的灵敏度度和准确度。进一步地，所述对照品溶液中d-精氨酸与n-乙酰-l-半胱氨酸摩尔比为0.001:1-1.5；所述待测品溶液中精氨酸与n-乙酰-l-半胱氨酸摩尔比为1:1-1.5。选择适当过量的衍生试剂，保证衍生反应的有效进行，且不易产生明显的空白(衍生试剂)干扰。进一步地，所述梯度检测的检测波长为230nm。精氨酸衍生物在此处有最大吸收，以230nm为检测波长，有较强的紫外吸收，既可以避免精氨酸的末端吸收，又可以提高检测的灵敏度。进一步地，所述流动相a中0.05mol/l乙酸铵溶液与乙腈体积比为85-95:5-15。由于0.05mol/l的乙酸铵溶液，在测定溶液ph接近6时，色谱柱容易长菌而导致色谱柱损坏，将流动相a调整为0.05mol/l乙酸铵溶液-乙腈，能够有效避免因流动相原因造成的色谱柱及设备的损坏，有助于检测的正常进行和降低成本。进一步地，检测过程中进样体积为10-20μl，流速为0.5-2ml/min。保证精氨酸异构体在线性梯度洗脱过程中有效分离，有助于改善精氨酸异构体检测的准确度。进一步地，检测过程中进样温度为5℃。在5℃条件下，对照品溶液峰面积的变化情况如表1所示，5℃时检测峰稳定性优异，在15h内可稳定存在。表1进一步地，所述硼酸缓冲液为硼酸-氢氧化钠缓冲液，ph为8-10。硼酸-氢氧化钠缓冲液由0.2mol/l的硼酸溶液与氢氧化钠配制而成。用于调节体系ph，防止样品解离，便于精氨酸异构体的分离，改善检测的准确度。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种精氨酸异构体的检测方法，包括如下步骤：(1)精密称取邻苯二醛80mg，n-乙酰-l-半胱氨酸93mg，置于同一25ml容量瓶中，加入2.5ml乙醇溶解，再加入ph为9.8的硼酸缓冲液稀释至刻度，定容，得到衍生试剂；(2)精密称取d-精氨酸对照品适量，并配制浓度为1μg/ml的对照品水溶液。精密量取上述对照品水溶液2ml和衍生试剂0.6ml置于同一5ml容量瓶中，并加入硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，定容，得到对照品溶液；(3)精密称取待测品10mg，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀、定容并过滤，得到待测品水溶液。精密量取上述待测品水溶液2ml和衍生试剂0.6ml置于同一5ml容量瓶中，并加入硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，定容，得到待测品溶液；(4)分别取上述对照品溶液及待测品溶液，用液相色谱法进行梯度检测。梯度检测的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为30℃；流动相：流动相a为0.05mol/l乙酸铵溶液-乙腈(90:10)，流动相b为乙腈；进样温度为5℃，进样体积为15μl，流速为lml/min，进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如表2所示：表2时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0100020100035802037802037.11000451000记录色谱图数据，采用外标法计算待测品中d-精氨酸的含量(cx)。其中，cr为对照品含量；ar为对照品峰面积；ax为待测品中d-精氨酸峰面积。实施例2一种精氨酸异构体的检测方法，包括如下步骤：(1)精密称取邻苯二醛80mg，n-乙酰-l-半胱氨酸93mg，置于同一25ml容量瓶中，加入2.5ml乙醇溶解，再加入ph为8的硼酸缓冲液稀释至刻度，定容，得到衍生试剂；(2)精密称取d-精氨酸对照品适量，并配制浓度为1μg/ml的对照品水溶液。精密量取上述对照品水溶液2ml和衍生试剂0.5ml置于同一5ml容量瓶中，并加入硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，定容，得到对照品溶液；(3)精密称取待测品10mg，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀、定容并过滤，得到待测品水溶液。精密量取上述待测品水溶液2ml和衍生试剂0.5ml置于同一5ml容量瓶中，并加入硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，定容，得到待测品溶液；(4)分别取上述对照品溶液及待测品溶液，用液相色谱法进行梯度检测。梯度检测的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为25℃；流动相：流动相a为0.05mol/l乙酸铵溶液-乙腈(95:5)，流动相b为乙腈；进样温度为2℃，进样体积为10μl，流速为0.5ml/min，进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如表3所示：表3时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0100020100035802037802037.11000451000记录色谱图数据，采用外标法计算待测品中d-精氨酸的含量(cx)。实施例3一种精氨酸异构体的检测方法，包括如下步骤：(1)精密称取邻苯二醛80mg，n-乙酰-l-半胱氨酸93mg，置于同一25ml容量瓶中，加入2.5ml乙醇溶解，再加入ph为10的硼酸缓冲液稀释至刻度，定容，得到衍生试剂；(2)精密称取d-精氨酸对照品适量，并配制浓度为1μg/ml的对照品水溶液。精密量取上述对照品水溶液2ml和衍生试剂0.75ml置于同一5ml容量瓶中，并加入硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，定容，得到对照品溶液；(3)精密称取待测品10mg，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀、定容并过滤，得到待测品水溶液。精密量取上述待测品水溶液2ml和衍生试剂0.75ml置于同一5ml容量瓶中，并加入硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，定容，得到待测品溶液；(4)分别取上述对照品溶液及待测品溶液，用液相色谱法进行梯度检测。梯度检测的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温为35℃；流动相：流动相a为0.05mol/l乙酸铵溶液-乙腈(85:15)，流动相b为乙腈；进样温度为8℃，进样体积为20μl，流速为2ml/min，进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如表4所示：表4时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0100020100035802037802037.11000451000记录色谱图数据，采用外标法计算待测品中d-精氨酸的含量(cx)。为了更好的说明本发明实施例提供的精氨酸异构体的检测方法的特性，下面采用实施例1中的检测方法对9组待测品(工艺批号为c011707048、c011707049、c011707050，c011707051、c011707052、c011707053、c011707096、c011707097、c011707098)进行测试，结果如表5所示。表5批号异构体(d-精氨酸)含量c0117070480.026c0117070490.021c0117070500.014c0117070510.039c0117070520.057c0117070530.045c0117070960.018c0117070970.029c0117070980.025由以上数据可知，9组待测品中的异构体含量均＜0.1％，批次间差异较小，本发明实施例提供的检测方法能够灵敏、准确的检测出精氨酸中的异构体，能够有效控制l-精氨酸产品质量。本发明实施例2、3中的检测方法能够达到与实施例1中检测方法相当的效果。为了更好的说明本发明实施例提供的精氨酸异构体的检测方法的特性，下面对本发明实施例提供的检测方法的专属性、灵敏度、准确度及d-精氨酸含量与峰面积线性关系进行验证。检测方法的专属性：精密称取邻苯二醛80mg，n-乙酰-l-半胱氨酸93mg，置于同一25ml容量瓶中，加入2.5ml乙醇溶解，再加入ph为9.8的硼酸缓冲液稀释至刻度，定容，得到衍生试剂。取d-精氨酸对照品与l-精氨酸各适量，加水溶解并稀释制成每lml中分别约含d-精氨酸1μg、l-精氨酸1mg的混合溶液，精密量取上述混合溶液2ml与衍生试剂0.6ml置于同一5ml容量瓶中，加ph为9.8的硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀并定容，作为系统适用性溶液。精密量取水2ml与衍生试剂0.6ml置于同一5ml容量瓶中，加ph为9.8的硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液。采用实施例1中色谱条件进行检测。结果如表6所示。表6结果表明，空白溶液对d-精氨酸测定无干扰，d-精氨酸衍生物峰与l-精氨酸衍生物峰可有效分离，说明该检测方法专属性较好。检测方法的灵敏度：配制d-精氨酸标准溶液，稀释制成一系列浓度的溶液。检测限是根据信噪比来确定的，把已知浓度的对照品溶液稀释至低浓度，以s/n＝3的浓度作为检测限溶液。经测试d-精氨酸检测限为0.021mg/l。说明本发明实施例提供的检测方法具有较高的灵敏度。检测方法的准确度：精密称取邻苯二醛80mg，n-乙酰-l-半胱氨酸93mg，置于同一25ml容量瓶中，加入2.5ml乙醇溶解，再加入ph为9.8的硼酸缓冲液(下同)稀释至刻度，定容，得到衍生试剂。精密称取d-精氨酸对照品适量，并配制浓度为1μg/ml的对照品水溶液。精密量取上述对照品水溶液2ml和衍生试剂0.6ml置于同一5ml容量瓶中，并加入硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，定容，得到对照品溶液。精密称取d-精氨酸对照品10mg，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为d-精氨酸对照品贮备液。精密称取待测品10mg，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀、定容并过滤，得到待测品水溶液。精密量取上述待测品水溶液2ml和衍生试剂0.6ml置于同一5ml容量瓶中，并加入硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，定容，得到待测品溶液。取待测品三份，每份10mg，分别精密称取，置于三个10ml容量瓶中，分别精密量取上述d-精氨酸对照品贮备液0.8ml置上述容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取上述溶液2ml与衍生试剂0.6ml置于同一5ml量瓶中，加硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得回收率80％的溶液。取待测品三份，每份10mg，分别精密称取，置于三个10ml容量瓶中，分别精密量取上述d-精氨酸对照品贮备液1ml置上述容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取上述溶液2ml与衍生试剂0.6ml置于同一5ml量瓶中，加硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得回收率100％的溶液。取待测品三份，每份10mg，分别精密称取，置于三个10ml容量瓶中，分别精密量取上述d-精氨酸对照品贮备液1.2ml置上述容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取上述溶液2ml与衍生试剂0.6ml置于同一5ml量瓶中，加硼酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得回收率120％的溶液。分别精密量取上述对照品溶液、待测品溶液、回收率溶液各15μl，注入液相色谱仪进行检测，记录色谱图。按外标法以峰面积计算d-精氨酸的含量。结果如表7所示。表7由以上数据可知，三个水平回收率范围为94.8％～101.4％，均在90％-108％之间，9个回收率样品数据的rsd为2.99％，小于3％，表明本发明提供的检测方法准确度良好。d-精氨酸含量与峰面积线性关系：分别精密量取上述d-精氨酸对照品贮备液0.5ml、0.8ml、1ml、1.5ml、2.0ml置于不同的10ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀定容。分别精密量取上述定容溶液各2ml置于不同的5ml的容量瓶中，分别加入衍生试剂0.6ml，用ph为9.8的硼酸缓冲溶液稀释至刻度，摇匀。作为线性50％、80％、100％、150％、200％的溶液。以d-精氨酸浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，做线性回归方程，结果如表8所示。表8由表中数据可知，d-精氨酸在浓度0.062μg/ml～0.821μg/ml范围内，线性关系良好，保证检测准确度和可信度。线性方程为y＝171.33x+1.1695，相关系数r为0.9998，y轴截距为1.1695，为100％响应值的1.6％，在25％以内，响应因子的rsd为3.94％，小于10％，符合要求。由以上数据可知，本发明提供的精氨酸异构体的检测方法，专属性好、灵敏度强、准确度高，能够有效控制l-精氨酸中的d-精氨酸含量，保障l-精氨酸产品质量。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12