一种超高效液相色谱测定儿童指画印泥中的苦味剂柚皮苷和苯甲酸地那铵的方法与流程

本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种超高效液相色谱测定儿童指画印泥中的苦味剂柚皮苷和苯甲酸地那铵的方法。

背景技术：

苦味剂(aversiveagent)又称厌恶剂、阻食剂，是一种添加于产品中，使其味道或气味带有苦味以防止人们尤其是儿童吸入或摄入有毒有害物质，啮齿类和鸟类破坏设施而广泛使用的化学制剂。苯甲酸地那铵，也称苦精(bitrex)，其结构由苯甲酸基团和地那铵基团组成，是目前已知的最苦的化合物，是苦味剂的典型代表。苦精具有化学性质稳定，价格低廉，易于获得，极易溶于水等特点，此外，其哺乳动物半数致死量(medianlethaldose，ld50)为841mg/kg体重，仅需极少量添加(0.00001％)即可起到阻食效果，在通常使用条件下安全无毒，是日常消费品中常用的苦味剂，例如为防止儿童摄入有毒但带有甜的防冻剂，在其中加入苦精。柚皮苷是从西柚皮中分离的一种双氢黄酮类化合物，有苦味，柚皮苷作苦味剂，具有可以食用，安全无毒，来源广泛等优点。所以为了尽可能降低幼儿潜在的有意或无意将指画颜料放入口中的风险，世界多标准均要求指画颜料中应添加的苦味剂为此两种化合物。欧盟标准en71-7:2014+a2:2018国际标准iso8124-7:2015和国家指画颜料产品标准gb6675.14-2014对苦味剂的要求一致。上述标准给出了参考添加浓度为：1％柚皮苷、0.0004％苯甲酸地那铵(4mg/kg)。

目前，国内和国际上有关消费品中的涉及柚皮苷和苯甲酸地那铵的检测标准包括：astmd7304-2014具体方法为冷却液样品采用浓度为0.1mol/l磷二氢酸钾溶液(ph4.6)稀释后，直接hplc分析，方法定量限为6.6mg/kg；en1214:1997具体方法为待测样品与草酸铵、二甲基甲酰胺混合均匀后，稀释，90℃下加热10min，冷却至室温，过滤后，hplc分析。国内外涉及苯甲酸地那铵的测定方法的文献数量较少，henderson等在analysisofdenatoniumbenzoateinoregonconsumerproductsbyhplc,chemosphere,1998,36(1):203中报道了一种高效液相色谱法分析俄勒冈消费品中的苯甲酸地那铵的方法，将样品用甲醇稀释，离心，过滤后，hplc测定，定量限为1.25mg/l。上述测定苯甲酸地那铵的标准和文献方法中样品前处理过程主要为固相萃取分离净化或直接用流动相稀释后，hplc分析。

国内外涉及柚皮苷的测定方法的文献主要集中在中药方面，国内文献报道了高效液相色谱法分析复方当归胶囊、通宣理肺颗粒、衢枳壳和去滞散中柚皮苷的方法。weon等在simultaneousdeterminationof14bioactivecompoundsinsamchulkunbi-tangusinghplc-dadandlc-ms,anal.methods,2014,6:6023中报道了一种hplc-dad和hplc-ms同时测定参术健脾汤中14种生物活性化合物的方法。上述测定柚皮苷的文献方法中样品前处理过程主要为粉碎样品，采用甲醇溶剂超声提取，hplc或/和hplc-ms分析。

而儿童指画印泥基质复杂，为避免干扰，需要加入高稀释倍数的萃取溶剂进行提取，而标准推荐的苯甲酸地那铵的添加浓度为4mg/kg，这对仪器和方法的灵敏度是一个挑战，上述苯甲酸地那铵的仪器和测定方法的灵敏度不能满足要求。

儿童指画印泥为指画颜料的其中一种，儿童用手指在印泥上蘸取颜料进行创作，儿童意识薄弱，若儿童印泥产品无添加苦味剂或添加量不符合标准要求，易于通过舔食儿童的身心健康造成严重危害。超高效液相色谱具有分析速度快，分离效率高等优点，目前，尚未见超高效液相色谱法分析儿童指画印泥中苦味剂柚皮苷和苯甲酸地那铵的报道。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种超高效液相色谱测定儿童指画印泥中的苦味剂柚皮苷和苯甲酸地那铵的方法。

本发明的技术方案如下：

一种超高效液相色谱测定儿童指画印泥中的苦味剂柚皮苷和苯甲酸地那铵的方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液配制：精密称定待测样品于具塞锥形瓶中，加入甲醇-0.02mol/lkh2po4萃取溶剂，萃取溶剂体积为50倍样品质量，超声萃取，取清液过用过滤膜过滤后得到滤液，作为供试品溶液，用于超高效液相色谱分析；

(2)标准溶液配制:配置不同浓度梯度的柚皮苷和苯甲酸地那铵的混合标准溶液；

(3)采用超高效液相色谱进行测定，色谱条件为：

色谱柱：c18；

柱温：30-40℃；

流动相：流动相a为乙腈；流动相b为0.02mol/lkh2po4，ph≥4.3；

流速：0.2-0.5ml/min；

(4)定量分析：分别取等体积的标准溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱中，采用外标法定量。

优选的，步骤(4)还包括，供试品溶液注入超高效液相色谱，二极管阵列检测器扫描柚皮苷、苯甲酸和地那铵离子的紫外吸收光谱，选择不同检测波长进行定性，定性分析后，定量分析。

优选的，柚皮苷的检测波长为282nm，苯甲酸离子的检测波长为230nm，地那铵离子的检测波长为210nm。

优选的，流动相梯度：0min，10％流动相a；2min时，升至30％流动相a，保持3min；5.01min时，降至10％流动相a，保持2min。

优选的，步骤(2)配制的标准溶液浓度分别为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l和5mg/l。

优选的，萃取溶剂中甲醇体积含量为30％。

优选的，流动相ph为4.3。

优选的，流动相流速为0.3ml/min。

优选的，色谱柱的柱温为40℃。

优选的，c18采用2.1mm×50mm，1.7μm的色谱柱。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本申请采用50倍样品质量的萃取溶剂体积进行萃取，以消除基质的干扰；

针对苯甲酸地那铵为水溶性化合物，在水中解离为苯甲酸离子和地那铵离子，而柚皮苷需要溶解在有机溶剂中的问题，通过优化样品萃取溶剂中甲醇的比例，综合考虑萃取效率和流动相的洗脱能力，同时实现柚皮苷和苯甲酸地那铵的90％的回收率；

通过优化流动相组成和梯度、流动相流速和柱温以满足分离，获得较高灵敏度。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为本发明的实施例的柚皮苷、苯甲酸和地那铵的紫外光谱图；

图2为本发明的实施例的不同流动相ph值下柚皮苷、苯甲酸和地那铵的色谱图；

图3为本发明的实施例的不同流动相流速对柚皮苷、苯甲酸和地那铵的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例

一种超高效液相色谱测定儿童指画印泥中的苦味剂柚皮苷和苯甲酸地那铵的方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液配制：精密称定待测样品于具塞锥形瓶中，加入甲醇-0.02mol/lkh2po4萃取溶剂，萃取溶剂体积为50倍样品质量，超声萃取，取清液过用过滤膜过滤后得到滤液，作为供试品溶液，用于超高效液相色谱分析；

(2)标准溶液配制:配置不同浓度梯度的柚皮苷和苯甲酸地那铵的混合标准溶液；

(3)采用超高效液相色谱进行测定，色谱条件为：

色谱柱：c18；

柱温：30-40℃；

流动相：流动相a为乙腈；流动相b为0.02mol/lkh2po4，ph≥4.3；

流速：0.2-0.5ml/min；

(4)定量分析：分别取等体积的标准溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱中，采用外标法定量。

步骤(4)还包括，供试品溶液注入超高效液相色谱，二极管阵列检测器扫描柚皮苷、苯甲酸和地那铵离子的紫外吸收光谱，选择不同检测波长进行定性，定性分析后，定量分析。

采用本方法进行分析实验

1实验部分

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱仪(waters公司)；离心机(德国eppendorf公司)；超声仪(德国elma公司)。

甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，anpel)；柚皮苷(cas：10236-47-2)(纯度≥97％，m/m，上海梯希爱化成工业发展有限公司)、苯甲酸地那铵(cas：3734-33-6)(纯度≥95％，m/m，德国dr.ehrenstorfer公司)；kh2po4(millipore)；水(millipore)；0.22μm有机系过滤膜(millipore)。

1.2uplc分析条件

色谱条件：色谱柱：c18(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温：40℃；流速：0.3ml/min；进样量：10μl；流动相a为乙腈，流动相b为0.02mol/lkh2po4(ph＝4.3)：流动相梯度：0min，10％流动相a，2min时，升至30％流动相a，保持3min，5.01min时，将至10％流动相a，保持2min。

1.3样品前处理

称取约0.2g(精确至0.1mg)样品于具塞锥形瓶中，加入10ml甲醇-0.02mol/lkh2po4(30：70，v/v)水溶液萃取溶剂，震荡1min使试样充分浸润，超声萃取20min，冷却至室温，于16000g下离心15min，取清液过0.22μm过滤膜过滤后，用于uplc分析。

2结果与讨论

2.1uplc条件的建立

2.1.1检测波长的选择

在色谱条件下，二极管阵列检测器(dad)扫描柚皮苷、苯甲酸和地那铵离子的紫外吸收光谱图见图1，柚皮苷的最大吸收波长为282nm，苯甲酸离子的最大吸收波长230nm，地那铵离子的最大吸收波长在210nm附近，但在210nm附近有紫外吸收的物质较多，易产生干扰，282nm处其余目标物的灵敏度太低，因此选择不同检测波长进行定性和定量。柚皮苷的检测波长为282nm，苯甲酸离子的检测波长为230nm，地那铵离子的检测波长为210nm。2.1.2流动相的选择

实验比较了甲醇-kh2po4水溶液、乙腈-kh2po4水溶液、乙腈-醋酸铵水溶液3种流动相的洗脱效果的影响。对于柚皮苷和地那铵离子，上述3种流动相对柚皮苷和地那铵离子保留时间的影响较小，响应强度则是在乙腈-kh2po4水溶液流动相体系下优于甲醇-kh2po4水溶液和乙腈-醋酸铵水溶液流动相体系。使用甲醇-kh2po4水溶液和乙腈-醋酸铵水溶液体系洗脱，无苯甲酸离子色谱峰出现，因此综合考虑选择乙腈-kh2po4水溶液为流动相体系。

流动相的ph值对柚皮苷、苯甲酸和地那铵离子的色谱行为有影响，因此通过调节流动相的ph以达到更好的分离目的。根据色谱柱适用的ph范围(1～12)和苯甲酸地那铵化合物的pka值(4.05)结合文献使用流动相kh2po4的ph值，固定柚皮苷和苯甲酸地那铵的浓度为10mg/l，按照1.2节进行梯度洗脱，分别考察了流动相ph为3.0、4.3、4.6和6.0时对柚皮苷、苯甲酸和地那铵离子的保留时间和峰面积的影响见图2，其中，a：ph＝3.0，b：ph＝4.3，c：ph＝4.6，d：ph＝6.0。试验结果显示，流动相ph为3.0，苯甲酸离子未出峰；流动相ph为4.3及以上时，苯甲酸离子出现色谱峰。推测产生上述现象的原因：苯甲酸色谱行为的变化与其pka值相关。在强酸性条件下，苯甲酸离子被质子化，在200nm以上均没有吸收；苯甲酸地那铵化合物的pka值为4.05，在流动相ph为4.3及以上时，主要以离子状态存在，随着ph的逐渐增大，离子型的含量增多，峰面积增大，极性增强，与反相色谱柱的保留能力减弱，保留时间减小。在流动相ph为4.3以上时，柚皮苷和地那铵离子的色谱峰随着流动相ph增大，峰高降低，峰形变宽，对称性变差。综合考虑灵敏度、重现性和色谱峰的对称性，选择流动相ph为4.3，用地那铵离子来定性和定量苯甲酸地那铵。

2.1.3流动相流速的选择

实验考察了流动相流速分别为0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min和0.5ml/min时对色谱分离效率的影响，结果见图3，其中，a：0.2ml/min，b：0.3ml/min，c：0.4ml/min，d：0.5ml/min。当流动相流速从0.2ml/min提高至0.5ml/min时，柚皮苷和地那铵离子的分析时间由6.3min减少至3.2min，但同时地那铵离子色谱峰拖尾现象严重。综合考虑分析效率和色谱峰的对称性，选择流动相流速为0.3ml/min。

2.1.4柱温的选择

本试验中，在流速为0.3ml/min的条件下，综合考虑分离和色谱柱耐受性的因素，选择柱温分别为30℃、35℃和40℃进行对比。随着柱温从30℃升至40℃，柚皮苷和地那铵离子的分析时间有所减少，并且在柱温为40℃时，地那铵的色谱峰形尖而对称性好，主要考虑分析效率和色谱柱的耐受性选择色谱柱柱温为40℃。

2.2标准曲线和检出限

配制柚皮苷和苯甲酸地那铵的混合标准溶液，浓度分别为0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l和5mg/l，在前面所述的最优的试验条件下进行测定。采用外标法定量，得到化合物的峰面积(纵坐标)和质量浓度(横坐标)的线性关系见表1。

表1柚皮苷和地那铵的线性方程、保留时间、相关系数和检出限

y：峰面积；x：质量浓度，mg/l；线性范围：0.1-5mg/l.

线性相关系数均在0.99以上，表明线性关系良好。每个浓度标准样品进样7次，其相对标准偏差为2.14％～3.32％。本方法进行6次试剂空白测试，将信噪比大于3时的质量浓度作为该化合物的检出限(lod)，柚皮苷和苯甲酸地那铵的检出限(s/n>3)分别为0.75和1.15mg/kg。uplc方法对柚皮苷和苯甲酸地那铵的定量下限分别为2.5和4mg/kg。

2.3萃取溶剂

实验比较了体积分数为10％、20％和30％甲醇等不同比例甲醇-0.02mol/lkh2po4萃取溶剂对回收率的影响。使用空白样品加标，当萃取溶剂中甲醇含量为10％时，柚皮苷和苯甲酸地那铵的回收率分别为25.0％和101％，当萃取溶剂中甲醇含量为20％时，柚皮苷和苯甲酸地那铵的回收率分别为68.3％和99.7％，当萃取溶剂中甲醇含量为30％时，柚皮苷和苯甲酸地那铵的回收率分别为93.2％和101％。随着萃取溶剂中甲醇比例增加，柚皮苷的萃取效率增加，苯甲酸地那铵的萃取效率保持稳定，综合考虑萃取效率和流动相的洗脱能力，选择萃取溶剂为甲醇-0.02mol/lkh2po4(30：70，v/v)。因流动相a为乙腈，流动相b为0.02mol/lkh2po4(ph＝4.3)：流动相梯度：0min，10％流动相a，2min时，升至30％流动相a，保持3min，5.01min时，将至10％流动相a，保持2min。尝试萃取溶剂中加入更高比例的甲醇(如40％、50％)，实验结果标明，会产生流动相洗脱不充分，杂质峰较多，干扰测定的现象。

2.4回收率与精密度

对空白样品分别添加3个浓度水平(定容后浓度为0.5mg/l、1mg/l、5mg/l)，平行测5次，上述添加浓度对应平均加标回收率范围为86.7％～108.4％，平均相对标准偏差(rsd，n＝6)小于5.0％，能够满足定量分析的要求。

2.5实际样品检测

在上述优化的色谱条件下测定了网购所得10种指画印泥样品中的柚皮苷和苯甲酸地那铵。根据1.3节所述对其进行前处理。在最优的1.2节色谱条件下进行测定，均未检测到柚皮苷和苯甲酸地那铵，不符合国家强制性标准gb6675.14-2014《玩具安全第14部分：指画颜料技术要求及测试方法》的要求。产生上述现象的原因可能是虽然国内外指画颜料标准强制要求添加苦味剂以避免儿童误事，但是并无相应检测方法标准发布，相关管理部门和标委会应加快相应标准出台的进度以使生产企业依据规范的标准进行设计和生产，保护我国未成年人合法权益保护我国儿童健康。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。