一种枸橼酸钠原料和/或含枸橼酸钠的药物中杂质的检测方法与流程

本发明属于化学中的分析检测领域，具体涉及一种枸橼酸钠原料和/或含枸橼酸钠的药物中杂质的检测方法。
背景技术：
：药物中的杂质是影响药物纯度的主要因素，如果药物中所含杂质超过质量标准规定的限量要求，极有可能造成药物的外观性状、理化参数发生改变，甚至影响药物的稳定性，使药物活性降低而毒副作用增加，严重危害药物的产品质量和患者的用药安全；同时，药物中杂质的来源非常广泛，既可能来源于生产过程引入，也可能来源于贮藏过程的降解，其中，生产过程中的原料不纯以及制剂产品的稳定性是很重要的一个来源。连续性肾脏替代治疗(crrt)主要用于危重症患者并发，急性肾衰竭时的抢救，为采用每天连续24或接近24h的一种连续性血液净化疗法以替代肾脏功能的技术。在血液净化过程中，体外循环的良好抗凝时保证治疗顺利进行的关键，枸橼酸钠抗凝具有良好的体外循环抗凝作用，又可避免出血并发症的发生，还具有改善滤过膜生物相容性等优，在肾替代治疗领域的应用日趋广泛。由于在crrt治疗时需补充大量的置换液，枸橼酸钠抗凝置换液需要大量的使用，因此枸橼酸钠制剂中的杂质控制是产品使用安全的重要保证。枸橼酸钠具有生物降解性，枸橼酸钠经自然界大量的水稀释后，部分变成枸橼酸，二者共存于同一体系中。枸橼酸在水中经氧、热、光、细菌以及微生物的作用，很容易发生降解，降解为乌头酸(顺-乌头酸、反-乌头酸)，乌头酸二次降解为衣康酸、宁康酸酐。枸橼酸钠生产原料的制备方法主要有：柠檬酸+氢氧化钠法、柠檬酸+纯碱法、柠檬酸+小苏打法等方法，而生产用起始原料柠檬酸多采用发酵工艺生产，柠檬酸存在失去一个h2o而成顺乌头酸，再结合一个h2o转化为异柠檬酸的转化过程。因此，无论是原料引入还是制剂的降解，枸橼酸钠原料及其产品中均存在异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸等多种杂质。然而，目前未见有枸橼酸钠中杂质含量的相关报道，自然也就无法从原料开始控制枸橼酸钠中杂质的引入以及储存过程中枸橼酸钠杂质的产生。为了进一步保证含枸橼酸钠的产品质量和患者的用药安全，有必要对枸橼酸钠原料以及生产的制剂产品质量进行监控，特别是，需要发明一种新方法，对枸橼酸钠原料以及产品中的杂质含量进行检测。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种枸橼酸钠原料和/或含枸橼酸钠的药物中杂质的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：1)对照品溶液的制备：取枸橼酸钠杂质对照品，加水溶液溶解，即得；2)供试品溶液的制备：取待测样品，加水溶液溶解，即得；3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以磷酸二氢钾溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，a：b的体积比为(90～100)：(10：0)。进一步地，步骤1)所述枸橼酸杂质对照品为异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐和/或衣康酸，所述对照品溶液中每1ml含对照品各5～25μg，优选10μg。进一步地，步骤2)所述待测样品为枸橼酸钠原料或含枸橼酸钠的药物，待测样品与水溶液的质量体积比为5～15mg：1ml，优选10mg：1ml。进一步地，所述水溶液为流动相或水。进一步地，步骤3)所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.1～1.0mol/l，优选0.5mol/l；所述磷酸二氢钾溶液用磷酸调ph值至1.0～3.0，优选2.0。进一步地，步骤3)所述色谱条件中色谱柱规格为250mm*4.6mm，5μm，优选色谱柱：wondasilc18-wr，250mm*4.6mm，5μm。进一步地，所述色谱条件中波长200～220nm，优选210nm；流速0.5～1.5ml/min，优选1.0ml/min；柱温25～35℃；进样量10～50μl，优选20μl。进一步地，步骤3)所述a：b的体积比为95：5。本发明还提供了一种含枸橼酸钠的原料和/或药物中杂质的含量测定方法，它是采用外标法计算，以前述方法检测得到的色谱图中色谱峰峰面积计算供试品中杂质的含量。进一步地，它是以一个浓度的对照品溶液色谱图中峰面积计算供试品中相应杂质的含量；或：先绘制系列浓度的对照品溶液色谱图中峰面积与其浓度之间的标准曲线，再用标准曲线计算供试品中相应杂质的含量。本发明提供了一种枸橼酸钠原料及其产品中杂质含量的新检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以同时实现对异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸的准确检测，而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，回收率高，检测结果准确、可靠，为监控含枸橼酸钠药物中杂质的含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了含枸橼酸钠产品质量和患者的用药安全。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1本发明检测条件下异柠檬酸钠对照品溶液的hplc图图2本发明检测条件下顺-乌头酸对照品溶液的hplc图图3本发明检测条件下反-乌头酸对照品溶液的hplc图图4本发明检测条件下柠康酸酐对照品溶液的hplc图图5本发明检测条件下衣康酸对照品溶液的hplc图图6本发明检测条件下枸橼酸钠和异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸混合溶液的hplc图图7本发明检测条件下枸橼酸钠供试品溶液的hplc图图8异柠檬酸钠线性曲线图图9枸橼酸钠线性曲线图图10顺-乌头酸线性曲线图图11反-乌头酸线性曲线图图12柠康酸酐酸线性曲线图图13衣康酸酐酸线性曲线图具体实施方式1、材料、试剂与仪器bs110s型电子天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；ultimate3000型高效液相色谱仪购自赛默飞公司，wondasilc18-wr(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱可购自岛津公司。1.2试剂及试药枸橼酸钠的批号为lrab3326，来源于sigma-alorich；杂质异柠檬酸钠的批号为a0391392，来源于acros；顺-乌头酸的批号为2-jlm-53-1，来源于torontoresearchchemicals；反-乌头酸的批号为bcbs9279v，来源于sigma-alorich；柠康酸酐的批号为105-12-4，来源于catoresearchchemicalsinc.；衣康酸的批号为bcbs8239v，来源于sigma-alorich。实施例1本发明检测枸橼酸钠中杂质的高效液相色谱方法1)对照品溶液的制备：取异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸对照品，用水溶解，配制成每1ml含对照品各10μg的对照品溶液；2)供试品溶液的制备：取枸橼酸钠原料，用水溶解后，并稀释配制成每1ml含10mg原料的供试品溶液；3)分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色谱图；色谱条件如下：色谱柱：wondasilc18-wr色谱柱，4.6mm×250mm，5μm流动相：0.5mol/l磷酸二氢钾溶液(磷酸调ph至2.0)-甲醇(95：5)柱温：30℃；流速：1.0ml/min；uv检测器(检测波长210nm)。进样体积：20μl。4)含量测定根据异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐和衣康酸质量浓度和峰面积计算枸橼酸钠原料中相应各杂质的含量。实施例2本发明检测枸橼酸钠中杂质的高效液相色谱方法1)对照品溶液的制备：取异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸对照品，用流动相溶解，配制成每1ml含对照品各10μg的对照品溶液，进一步用流动相稀释配制成系列浓度的对照品溶液；2)供试品溶液的制备：取枸橼酸钠置换液，用流动相溶解后，并稀释配制成每1ml含枸橼酸钠10mg的供试品溶液；3)分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色谱图；色谱条件如下：色谱柱：wondasilc18-wr色谱柱，4.6mm×250mm，5μm流动相：0.5mol/l磷酸二氢钾溶液(磷酸调ph至2.0)-甲醇(95：5)柱温：30℃；流速：1.0ml/min；uv检测器(检测波长210nm)。进样体积：20μl。4)含量测定以异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐和衣康酸质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，根据标准曲线计算制剂中各杂质的含量。实施例3本发明检测枸橼酸钠中杂质的高效液相色谱方法色谱柱：wondasilc18-wr色谱柱，4.6mm×250mm，5μm流动相：0.5mol/l磷酸二氢钾溶液(磷酸调ph至2.0)-甲醇(95：5)柱温：30℃；流速：1.0ml/min；uv检测器(检测波长210nm)。进样体积：20μl。检测步骤：取杂质异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸对照品，用水溶解，配制成每1ml含对照品10μg的对照品溶液。取枸橼酸钠样品，用水溶解后，并稀释配制成每1ml含10mg样品的供试品溶液。取枸橼酸钠供试品溶液，加入异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸对照品溶液，用水稀释，配制成混合溶液。测定法：取上述溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1～图7。由图可见，枸橼酸钠主峰与其相邻的顺-乌头酸峰之间的分离度为4.46，其他个杂质之间的最小分离度为3.13，均大于1.5。结果表明，本发明的色谱条件下，枸橼酸钠与杂质之间的分离度高，可以实现枸橼酸钠中多种杂质含量的同时检测。为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。试验例1、本发明检测方法的方法学研究本试验例中各种试验均采用如下条件：仪器：thermoultimate3000高效液相色谱仪、ultimate3000检测器液相色谱仪、bs110s电子天平色谱柱：wondasilc18-wr色谱柱，4.6mm×250mm，5μm流动相：0.5mol/l磷酸二氢钾溶液(磷酸调ph至2.0)-甲醇(95：5)检测波长：210nm流速：1.0ml/min进样量：20μl柱温：30℃1、专属性1.1系统适用性分别精密称取枸橼酸钠、异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸对照品，加水溶解并稀释制成每1ml中约含枸橼酸钠10mg、异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸各0.01mg的溶液，作为系统适用性溶液，在系统适用性溶液中，枸橼酸钠主峰与其相邻的顺-乌头酸峰之间的分离度为4.46大于1.5，各杂质之间的最小分离度为3.13大于1.5；系统适用性符合要求。为了进一步验证色谱条件对降解杂质和主峰的分离能力，按2015年版中国药典第四部通则9101“药品质量标准分析方法验证指导原则”，进行酸、碱、氧化、强光、高温等强制降解试验，同时采用二极管阵列检测，对主峰纯度进行检查。专属性破坏的典型图谱数据如下表1：表1专属性破坏数据结果汇总[注]:物料平衡(％)＝破坏样品峰面积/破坏样品浓度/未破坏样品峰面积×未破坏样品浓度结论：专属性破坏结果显示，主峰与相邻杂质峰之间、各杂质峰之间的分离度均大于1.5；主峰dad的峰匹配度指数均大于990，无杂质在主峰位置洗脱；物料平衡在90％～110％范围内。所以，方法专属性良好。2、检测限和定量限分别取枸橼酸钠、异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸对照品适量用水作溶剂逐步稀释，当s/n为3时，其浓度为检测限；当s/n为10时，其浓度为定量限。具体见表2-表3。表2检测限验证结果表3定量限验证结果名称噪音峰高样品峰高s/n定量限(μg)异柠檬酸钠0.0090.11112.3330.017枸橼酸钠0.0090.11112.3330.017顺-乌头酸0.0090.0788.6670.00036反-乌头酸0.0110.1089.8180.00042柠康酸酐0.0090.10411.5560.00031衣康酸0.0090.10611.7780.00057结果表明本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足杂质定量测定的要求。3、线性范围分别精密称取异柠檬酸钠对照品、枸橼酸钠对照品、顺-乌头酸对照品、反-乌头酸对照品、柠康酸酐对照品、衣康酸对照品适量，用纯化水稀释制成以一系列的杂质混合对照品溶液，分别精密取不同浓度的对照品溶液各20μl进入色谱仪(每个线性溶液进样3针)，并记录色谱图。分别以各组分浓度为横坐标，各组分峰面积为纵坐标拟合曲线，并对该曲线的线性回归，计算线性方程、相关系数，结果见下表4-9和图8-图13。表4异柠檬酸钠线性验证数据汇总结论：异柠檬酸钠在0.001034mg/ml-0.020674mg/ml范围内线性良好，相关系数r2为0.9999，线性曲线为y＝10.6716x-0.0002，y轴截距/100％浓度峰面积：0.19％。证明本发明方法线性范围广，准确度高。表5枸橼酸钠线性验证数据汇总结论：枸橼酸钠在0.001024mg/ml-0.020489mg/ml范围内线性良好，相关系数r2为0.9991，线性曲线为y＝15.1328x-0.0025，y轴截距/100％浓度峰面积：1.68％。证明本发明方法线性范围广，准确度高。表6顺-乌头酸线性验证数据汇总结论：顺-乌头酸在0.000969mg/ml-0.019381mg/ml范围内线性良好，相关系数r2为0.9999，线性曲线为y＝1218.2154x+0.0380，y轴截距/100％浓度峰面积：0.31％。证明本发明方法线性范围广，准确度高。表7反-乌头酸线性验证数据汇总结论：反-乌头酸在0.001000mg/ml-0.020000mg/ml范围内线性良好，相关系数r2为1.0000，线性曲线为y＝1237.2963x-0.0261，y轴截距/100％浓度峰面积：0.21％。证明本发明方法线性范围广，准确度高。表8柠康酸酐线性验证数据汇总结论：柠康酸酐在0.001034mg/ml-0.020686mg/ml范围内线性良好，相关系数r2为1.0000，线性曲线为y＝1620.4409x-0.0215，y轴截距/100％浓度峰面积：0.13％。证明本发明方法线性范围广，准确度高。表9衣康酸线性验证数据汇总结论：衣康酸在0.000987mg/ml-0.019736mg/ml范围内线性良好，相关系数r2为1.0000，线性曲线为y＝1016.5215x+0.0243，y轴截距/100％浓度峰面积：0.24％。证明本发明方法线性范围广，准确度高。此外，从标准曲线方程和图可以看出，斜率远远大于截距，标准曲线接近原点，说明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法。3、回收率试验在样品中分别加入限度浓度的50％、100％、150％各杂质对照品，每个浓度分别各配置三份，并进样检测，按外标法计算样品中杂质的含量，扣除本低含量后计算各杂质的回收率。回收率结果见下表10-表14。表10异柠檬酸钠回收率验证结果汇总结论；50％-150％的异柠檬酸钠回收率均在90％-110％之间，平均回收率为97.73％，9个样品回收率rsd为1.10％小于10％，检测方法的准确度符合验证要求。表11顺-乌头酸回收率验证结果汇总结论；50％-150％的顺-乌头酸回收率均在90％-110％之间，平均回收率为102.05％，9个样品回收率rsd为0.05％小于10％，检测方法准确度符合验证要求。表12反-乌头酸回收率验证结果汇总结论；50％-150％的反-乌头酸回收率均在90％-110％之间，平均回收率为102.55％，9个样品回收率rsd为0.47％小于10％，检测方法准确度符合验证要求。表13柠康酸酐回收率验证结果汇总结论；50％-150％的柠康酸酐回收率均在90％-110％之间，平均回收率为101.63％，9个样品回收率rsd为0.48％小于10％，检测方法准确度符合验证要求。表14衣康酸回收率验证结果汇总结论；50％-150％的衣康酸回收率均在90％-110％之间，平均回收率为101.19％，9个样品回收率rsd为0.54％小于10％，检测方法准确度符合验证要求。4、精密度验证4.1重复性配置6份不同的加标样品，分别用外标法测定各杂质的含量。并对结果进行统计分析，结果见下表15。表15供试品溶液中各杂质含量编号异柠檬酸钠顺-乌头酸反-乌头酸柠康酸酐衣康酸其他杂质总杂10.12％0.10％0.10％0.10％0.10％未检出0.52％20.12％0.10％0.10％0.10％0.10％未检出0.52％30.12％0.10％0.10％0.10％0.10％未检出0.52％40.12％0.10％0.10％0.10％0.10％未检出0.52％50.12％0.10％0.10％0.10％0.10％未检出0.52％60.12％0.10％0.10％0.10％0.10％未检出0.52％平均值0.12％0.10％0.10％0.10％0.10％未检出0.52％rsd0.00％0.00％0.00％0.00％0.00％-0.00％结论：其杂质异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸的含量分别为0.12％、0.10％、0.10％、0.10％、0.10％，未检出其它杂质，总杂含量为0.53％，所有检出杂质的rsd均不超过10％，满足验证要求。4.2中间精密度不同人员在不同日期，配置6份不同的加标样品，分别用外标法测定各杂质的含量。并对结果进行统计分析，并对结果进行统计分析，结果见下表16。表16试品溶液中各杂质含量结论：重复测定6个供试品，其杂质异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸的分别为0.12％、0.10％、0.11％、0.10％、0.10％，未检出其它杂质，总杂为0.53％，所有检出杂质的rsd均不超过10％；两人12个样品中杂质柠檬酸三钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸的分别为0.12％、0.10％、0.10％、0.10％、0.10％，未检出其它杂质，总杂为0.52％，所有检出杂质的rsd均不超过10％，满足验证要求。5、稳定性验证取对照品溶液、自身对照溶液和供试品溶液分别在不同时间点进样，并将各时间点杂质峰面积和0小时峰面积进行比较，并计算其相对0小时峰面积的百分比。数据结果见下表17～18。表17对照品溶液稳定性验证数据结果时间0小时4小时8小时12小时24小时平均值rsd枸橼酸钠峰面积0.1460.1520.1520.1530.1500.1511.85％异柠檬酸钠峰面积0.1090.1100.1090.1100.1090.1090.50％顺-乌头酸峰面积11.32111.51111.45111.40111.28811.3940.80％反-乌头酸峰面积12.33812.58312.58112.55412.55112.5210.83％柠康酸酐峰面积16.36116.65416.58416.54216.44616.5170.70％衣康酸峰面积9.88910.01110.0099.9879.9739.9740.50％结论；对照品溶液在已考察的24小时内，各杂质峰面积的rsd小于5％，故对照品溶液中各组分在24小时内稳定性良好。表18供试品溶液及自身对照溶液稳定性验证数据结果结论；供试品溶液在已考察的24小时内，峰面积的rsd小于5％，故在24小时内稳定性良好。6、耐用性验证通过对色谱条件中各个条件微小变化对系统适应性和检测结果的影响。分别对色谱柱柱温±5℃、流动相流速±0.2ml/min、检测波长±2nm、流动相水相ph±0.2和选用其它色谱柱进行验证。分别取系统适应性溶液、对照品溶液、自身对照溶液、供试品溶液各20μl在各个条件下进入色谱仪，并记录色谱图。统计系统适应性溶液中各组分的各个参数，计算各个条件下个杂质的含量，并对结果进行统计分析，结果见下表19-20。表19各条件下系统适应性溶液中各杂质分离度考察结果表20各条件下供试品溶液中各杂质含量数据统计结论：在检测方法的色谱柱柱温±5℃、流动相流速±0.2ml/min、检测波长±2nm、流动相水相ph±0.2和选用thermohypersilgold色谱柱进行验证的结果显示，各条件下系统适应性符合验证要求，供试品中杂质异柠檬酸钠、顺-乌头酸、反-乌头酸、柠康酸酐、衣康酸的含量分别为0.11％、0.10％、0.10％、0.10％、0.10％，未检出其它杂质，总杂含量为0.51％，所有检出杂质的rsd均不超过10％，因此，该检测方法用于测定枸橼酸钠及其制剂中各杂质含量耐用性良好。综上所述，本发明提供了一种枸橼酸钠杂质含量的检测方法，枸橼酸钠色谱峰与各杂质色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控枸橼酸钠产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了枸橼酸钠制剂产品质量和患者的用药安全。当前第1页12