一种SiO2/漆酚酯高分子微球、制备方法及其在天麻素及其衍生物的分离中的应用与流程

本发明属于高效液相色谱技术领域，尤其涉及一种sio2/漆酚酯高分子微球、制备方法及其在天麻素及其衍生物的分离中的应用。

背景技术：

天麻素及衍生物苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的化学结构式分别为：

天麻素：苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷：4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷：

天麻素为传统中药材天麻的主要活性成分，具有镇静催眠，抗惊厥、镇痛、抗癫痫，保护神经细胞等作用。在临床上多用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、惊痫抽搐及高血压的辅助治疗，具有效果显著。苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷是重要的药物合成中间体，与天麻素结构极为相似，且极性相差较小，因此将天麻素衍生物与天麻素分离开具有重要意义。

目前，关于天麻素及其衍生物高效液相色谱分离法的报道，有如下现有技术：

1.申请号：201710710292.1，发明名称：一种弱极性松香基高分子微球及其制备方法和应用的中国发明专利，其使用弱极性松香基高分子微球分离天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，流动相：甲醇，检测波长：265nm，温度28℃，流速为0.35ml/min，分离度为1.6。

2.王雯静，松香基高效液相色谱固定相的制备及对天麻素的分离研究[d]，2017。该现有技术中采用松香高分子微球为色谱柱固定相分离分离天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，流动相：甲醇，检测波长：220nm，温度25℃，流速为0.3ml/min，分离度为1.54。

3.刘玉红，易进海，陈燕,黄志芳，刘云华。rp-hplc法同时测定天麻中游离天麻素、巴利森苷和总天麻素[j]。中成药，2012，34(01):182-184。其中色谱柱为lunac18(4.6mm×150mm)，流动相为甲醇-1％冰醋酸，梯度洗脱，流速0.8ml/min，柱温35℃，检测波长270nm。

4.沈肖晶，金传山，许凤清等。高效液相色谱法测定不同加工工艺天麻中天麻素和天麻苷元含量[j]。安徽中医药大学学报，2014，33(6):70-73。其中色谱柱为spursilc18-ep(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-0.1％磷酸水(5∶95)，流速为1ml/min，柱温40℃，检测波长220nm。

但是，上述现有技术均存在对天麻素及其衍生物的分离效果不够理想的问题，因此有必要探索一种更为高效的分离天麻素及其衍生物的方法。

目前还没有关于分离天麻素和4-硝基苯基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种sio2/漆酚酯高分子微球、制备方法及其在天麻素及其衍生物的分离中的应用。

本发明是这样实现的，一种sio2/漆酚酯高分子微球的制备方法，包括以下步骤：

s1：将单体甲基丙烯酸漆酚酯与交联剂及自由基引发剂混合均匀；

s2：将步骤s1中得到的混合物涂覆到硅胶表面；

s3：将步骤s2中得到的硅胶复合物至于表面活性剂的水溶液中，进行自由基聚合反应；

s4：用无水乙醇对步骤s3得到的产物进行索氏提取，并真空干燥，即可得sio2/漆酚酯高分子微球。

进一步地，步骤s1中，所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯。

进一步地，步骤s1中，所述自由基引发剂为偶氮类自由基引发剂或有机过氧化物类自由基引发剂。

进一步地，所述偶氮类自由基引发剂为偶氮二异丁腈。

进一步地，所述有机过氧化物类自由基引发剂为过氧化苯甲酰。

进一步地，所述单体、交联剂与自由基引发剂的用量质量比为0.1-1.5:0.5-15:0.004-0.1。

一种利用上述的sio2/漆酚酯高分子微球的制备方法制备的sio2/漆酚酯高分子微球。

一种如上述的sio2/漆酚酯高分子微球在天麻素及其衍生物的分离中的应用。

进一步地，应用方法为将sio2/漆酚酯高分子微球作为固定相填料填充于色谱柱中，并应用于液相色谱仪中，对天麻素及其衍生物进行分离。

进一步地，所述天麻素的衍生物包括苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷。

进一步地，将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3-1.0ml/min，检测波长220nm，柱温箱25±5℃；启动进样阀使流动相将天麻素及其衍生物带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，实现天麻素及其衍生物的分离。

进一步地，所述sio2/漆酚酯高分子微球粒径分布为3-15μm，孔径分布5-10nm，比表面积225-350m²/g。

进一步地，采用湿法装柱用恒压泵将sio2/漆酚酯高分子微球填充于空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min，装填完毕后拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱。

sio2/漆酚酯高分子微球分离两种物质的机理：本发明使用的色谱柱的固定相填料sio2/漆酚酯高分子微球既保持了二氧化硅微球粒径均一，球形度良好的特点，同时又兼顾了漆酚高分子微球孔结构规整，表面官能团丰富的优势，所以以该微球作为固定相制备得到的sio2/漆酚酯高分子色谱柱对天麻素及其衍生物具有更优异的分离性能。

进一步地，所述自由基聚合的反应温度为70-90℃，时间为8-10h。

进一步地，所述单体及交联剂与硅胶的质量比为1:1-100。

进一步地，所述表面活性剂是为十二烷基硫酸钠或者十二烷基苯磺酸钠，水相中表面活性剂的质量分数为0.3-5％。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1.本发明使用的色谱柱的固定相填料sio2/漆酚酯高分子微球形状规则，粒径分布均匀，孔结构丰富且规整，色谱柱通透性好，背压低。在较高的流速和压力下，没有出现压塌的现象。并且稳定性好，可重复使用，长时间使用后，色谱柱里的填料没有破坏、溶解。

2.本发明使用的色谱柱的固定相填料sio2/漆酚酯高分子微球既保持了二氧化硅微球粒径均一，球形度高的良好特点，同时又兼顾了漆酚聚合物，孔结构规整，表面官能团丰富的优势，其中侧链上c15-c17的饱和烷基对分离的物质也具有筛分作用。理论塔板数高达60000，对天麻素及其衍生物有较好的分离效果。

3.本发明的方法对天麻素及其衍生物具有很好的分离效果。申请号为201710710292.1的专利申请中对天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离度为1.60，而在本发明的分离度可达9.55以上。此外，本发明还很好地实现了极性与天麻素更为接近的4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，分离度可达17.01以上。苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离度可达8.25以上。

4.申请号为201710710292.1的现有技术，其松香基高分子色谱柱用有机溶剂作为流动相，而本发明的sio2/漆酚高分子色谱柱采用水做流动相，污染小，更环保。

5.本发明使用的色谱柱的固定相填料sio2/漆酚酯高分子微球的制备工艺简单，成本较低，具有较好的应用前景。

6.本发明使用的原料为我国特有的优质天然植物可再生资源生漆，这对拓展生漆的应用领域具有重要意义。

7.本发明的应用sio2/漆酚酯高分子色谱柱高效分离天麻素及其衍生物的方法灵敏度高，操作简单，快速高效。

附图说明

图1为本发明应用实施例1对天麻素与苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在0.3ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图2为本发明应用实施例2对天麻素与苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在0.5ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图3为本发明应用实施例3对天麻素与4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在0.3ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图4为本发明应用实施例4对天麻素与4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在0.5ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图5为本发明应用实施例5对天麻素与苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在0.7ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图6为本发明应用实施例6对天麻素与4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在0.7ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图7为本发明应用实施例7对苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷与4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在0.3ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图8为本发明应用实施例8对苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷与4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在0.7ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图9为本发明应用实施例9对天麻素、对苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液在1.0ml/min流速下的高效液相色谱谱图；

图10为本发明对比实施例1对天麻素与苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液的高效液相色谱谱图；

图11为本发明对比实施例2对天麻素与苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液的高效液相色谱谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，如无特殊说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均市售可得。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种sio2/漆酚酯高分子微球、制备方法及其在天麻素及其衍生物的分离中的应用，具体如下各实施例所示。

sio2/漆酚酯高分子微球的制备

制备实施例1

将0.35g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，0.75g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与3mg偶氮二异丁腈充分混合后，均匀涂覆到5.00g硅胶表面。本实施例中偶氮二异丁腈作为偶氮类自由基引发剂使用，其他实施例中也可以使用有机过氧化物类自由基引发剂如过氧化苯甲酰等。然后置于250ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为0.1％的水溶液中，于90℃进行自由基聚合反应8h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为3-10μm，平均孔径为6.36nm，比表面积为275m²/g。

制备实施例2

将1.50g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，3.35g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与15mg偶氮二异丁腈充分混合后，均匀涂覆到50.00g硅胶表面，然后置于1000ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为1％水溶液中于75℃进行自由基聚合反应8h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为5-10μm，平均孔径为6.59nm，比表面积为295m²/g。

制备实施例3

将1.5g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，6.5g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与100mg过氧化苯甲酰充分混合后，均匀涂覆到90.00g硅胶表面，然后置于1000ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为3％水溶液中于85℃进行自由基聚合反应8h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为10-15μm，平均孔径为7.23nm，比表面积为300.65m²/g。

制备实施例4

将1.0g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，5.0g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与50mg过氧化苯甲酰充分混合后，均匀涂覆到600.0g硅胶表面，然后置于1000ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为3％水溶液中于85℃进行自由基聚合反应10h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为5-15μm，平均孔径为10.05nm，比表面积为350.15m²/g。

制备实施例5

将0.1g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，8.0g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与40mg过氧化苯甲酰充分混合后，均匀涂覆到90.00g硅胶表面，然后置于1000ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为3％水溶液中于70℃进行自由基聚合反应8h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为3-10μm，平均孔径为9.56nm，比表面积为320.50m²/g。

制备实施例6

将0.1g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，15.0g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与15mg过氧化苯甲酰充分混合后，均匀涂覆到80.00g硅胶表面，然后置于1000ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为3％水溶液中于85℃进行自由基聚合反应8h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为3-5μm，平均孔径为10.56nm，比表面积为340.00m²/g。

制备实施例7

将1.5g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，0.5g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与4mg偶氮二异丁腈充分混合后，均匀涂覆到100.00g硅胶表面，然后置于1000ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为3％水溶液中于90℃进行自由基聚合反应8h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为5-10μm，平均孔径为9.47nm，比表面积为305m²/g。

制备实施例8

将1.5g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，10.0g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与70mg偶氮二异丁腈充分混合后，均匀涂覆到11.50g硅胶表面，然后置于1000ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为3％水溶液中于85℃进行自由基聚合反应8h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为5-15μm，平均孔径为5.05nm，比表面积为225.00m²/g。

制备实施例9

将1.5g甲基丙烯酸漆酚酯作为单体，15.0g二甲基丙烯酸乙二醇酯作交联剂与100mg偶氮二异丁腈充分混合后，均匀涂覆到90.00g硅胶表面，然后置于1000ml十二烷基硫酸钠作表面活性剂的质量分数为3％水溶液中于90℃进行自由基聚合反应10h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可得到sio2/漆酚酯高分子微球。

采用激光粒度仪对微球的粒径分布进行测定，采用比表面积及微孔介孔物理吸附仪对微球的比表面积及孔结构进行测定。经检测分析，微球粒径分布为3-10μm，平均孔径为6.86nm，比表面积为265m²/g。

应用sio2/漆酚酯高分子色谱柱分离天麻素及其衍生物

应用实施例1

将制备实施例1所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱。然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取适量天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的天麻素、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现天麻素、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图1所示，在保留时间13.28min时出现天麻素峰，在保留时间18.76min时出现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为11.47。

应用实施例2

用恒压泵将制备实施例2所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱，然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取适量天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的天麻素、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.5ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现天麻素、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图2所示，在保留时间7.97min时出现天麻素峰，在保留时间11.16min时出现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为10.89。

应用实施例3

用恒压泵将制备实施例3所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱，然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取适量天麻素和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的天麻素、4-硝基苯基-β-d吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现天麻素、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图3所示，在保留时间13.12min时出现天麻素峰，在保留时间25.33min时出现4-硝基苯基-β-d吡喃葡萄糖苷峰，分离度为20.71。

应用实施例4

用恒压泵将制备实施例4所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱，然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取适量天麻素和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的天麻素、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.5ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现天麻素、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图4所示，在保留时间为7.97min时出现天麻素峰，在保留时间为15.30min时出现4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为19.59。

应用实施例5

用恒压泵将制备实施例5所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱，然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取适量天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的天麻素、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.7ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图5所示，在保留时间为5.72min时出现天麻素峰，在保留时间为7.98min时出现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为10.11。

应用实施例6

用恒压泵将制备实施例6所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱，然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取适量天麻素和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的天麻素、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.7ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现天麻素和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图6所示，在保留时间为5.72min时出现天麻素峰，在保留时间为10.93min时出现4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为18.33。

应用实施例7

用恒压泵将制备实施例7所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱，然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取适量苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图7所示，在保留时间为18.32min时出现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，在保留时间为25.20时出现4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为10.09。

应用实施例8

用恒压泵将制备实施例8所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱，然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.7ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图8所示，在保留时间为7.97min时出现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，在保留时间为10.89min时出现4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为8.92。

应用实施例9

用恒压泵将制备实施例9所得的sio2/漆酚酯高分子微球填充于不锈钢空色谱柱中，在6000psi的压力下装柱10min，在4500psi的压力下装柱10min，在3000psi的压力下装柱5min，在1500psi的压力下装柱5min装填完毕后，拆下色谱柱装上筛板及柱头，即得到sio2/漆酚酯高分子色谱柱，然后将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入高效液相色谱仪，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液冲洗至基线平衡后即可进样。

检测方法如下：

(1)制备样品溶液：取适量天麻素、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用乙腈-0.05％磷酸水(3:97，v/v)溶液溶解，配制成每1l含5×10^-4mol的天麻素、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将sio2/漆酚酯高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.0ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈-磷酸水溶液将样品带入sio2/漆酚酯高分子色谱柱中，进样量为4μl，实现天麻素、苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的分离，所得结果如图9所示，在保留时间为4.01min时出现天麻素峰，在保留时间为5.59min时出现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，在保留时间为7.65min时出现4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为9.45和8.30。

对比应用实施例1应用松香基高分子色谱柱分离天麻素及衍生物苯基-β-d吡喃葡萄糖苷的方法

松香基高分子色谱柱，按照申请号为201710710292.1的发明专利申请公布的方法制备得到。

(1)制备样品溶液：取适量天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用甲醇溶解，配制成每1l含天麻素2.5×10^-4mol的天麻素与苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将酯化修饰的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3ml/min，检测波长254nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入酯化修饰的松香基高分子色谱柱中，实现天麻素的分离，所得结果如10所示，在保留时间9.97min时出现天麻素峰，在保留时间10.94min时出现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为1.60。

对比应用实施例2应用松香高分子色谱柱分离天麻素及衍生物苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷的方法

松香高分子色谱柱，按照王雯静，松香基高效液相色谱固定相的制备及对天麻素的分离研究[d]，论文公布的方法制备得到。

(1)制备样品溶液：取适量天麻素和苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，用甲醇溶解，配制成每1l含天麻素2.5×10^-4mol的天麻素与苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将酯化修饰的松香高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3ml/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入酯化修饰的松香高分子色谱柱中，实现天麻素的分离，所得结果如图11所示，在保留时间11.16min时出现天麻素峰，在保留时间12.39min时出现苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为1.54。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。