药物组合物的制备方法及其HPLC指纹图谱建立方法与流程

本申请涉及中药领域，具体而言，涉及一种药物组合物的制备方法及其hplc指纹图谱建立方法。

背景技术：

经典名方在我国有着悠久、丰富的人用历史，是我国祖先留下来的宝贵财富，为了发展中医药事业，国家对来源于国家公布目录中的古代经典名方的中药复方制剂申请上市实施简化审批，同时中药制剂知识产权受国家保护，相继颁布了一系列法规和技术要求对经典名方遴选、申报、简化注册审批等进行了规定和要求。

保元汤出自明代孙志宏《简明医彀》，用于治疗元气虚弱，精神倦怠，肌肉柔慢，饮食少进，面青白，睡卧宁静等。方中包括黄芪、人参、甘草、肉桂、生姜五味药材。现有技术研究主要针对保元汤传统汤剂临床疗效方面，如心气不足、冠心病、控缺氧等。

传统的保元汤各个药材的有效物质不能确保各个药材的有效物质均得到充分提取和利用。

技术实现要素：

本申请实施例的目的在于提供一种药物组合物的制备方法及其hplc指纹图谱建立方法，其旨在改善目前药物组合物中不能确保各个药材的有效物质均得到充分提取和利用的问题。

第一方面，本申请提供一种技术方案：

一种药物组合物的制备方法，包括：

按照重量份计，将黄芪15-25份、人参8-12份、甘草3-8份、肉桂1-3份以及生姜1-3份混合后，提取2-4次后，合并提取液，于60-80℃浓缩提取液为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏。

通过将黄芪、人参、甘草、肉桂以及生姜混合后，提取2-4次后，合并提取液，于60-80℃浓缩提取液为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏。能够保证最终获得的药物组合物浸膏中包含了黄芪、人参、甘草、肉桂以及生姜各个原料的有效物质，且保证各个有效物质的充分利用。

在本申请的其他实施例中，上述每次的提取时间均为0.5-3小时。

提取时间0.5-3小时，能够有效地保证提取到各个药材的有效物质。

可选地，上述浓缩前还对提取液过110-140目筛除渣。

在110-140目，能够有效去除提取液中的残渣、固体杂质。

在本申请的其他实施例中，上述于60-80℃浓缩提取液为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏后还对浸膏在进风温度150-170℃条件进行喷雾干燥，直至将浸膏干燥为粉末。

该条件下，能够保证将浸膏干燥为粉末。

在本申请的其他实施例中，上述对浸膏进行干燥后，还向干燥后的粉末中加入辅料；

辅料包括麦芽糊精、糊精、糖粉、聚维酮、聚乙二醇、木糖醇、β-环糊精中的一种或多种的组合。

加入辅料，便于制成药剂。

可选地，上述药物组合物的药剂形式包括：片剂、丸剂、颗粒、胶囊或者液态饮品中的任意一种。

制成药剂，方便使用者服用。

在本申请的其他实施例中，上述提取的方式是采用加水提取。

加水提取，操作简单，能够保证各个药材的有效物质。

可选地，上述加水提取的次数为2次，包括：

于药材混合物中加入第一份水浸泡25-35分钟后，沸煮1-2小时；然后加入第二份水，沸煮0.5-1.5小时，合并两次提取液；

其中，第一份水的质量为药材混合物质量的7-9倍，第二份水的质量为药材混合物质量的5.5-6.6倍。

提取两次，保证了各个药材原料的有效成分。

在本申请的其他实施例中，上述于60-80℃浓缩为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏的步骤包括：

将提取液在温度为60-80℃，真空度为-0.06～0.08mpa条件下减压干燥至相对密度为1.05～1.30g/cm³的浸膏。

在该条件下，能够保证将滤液干燥为浸膏。

第二方面，本申请提供一种技术方案：

一种药物组合物的制备方法，包括：

按照重量份计，将黄芪15-25份、人参8-12份、甘草3-8份以及生姜1-3份混合后，加水提取2-4次后，合并提取液，于60-80℃浓缩提取液为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏；

然后按照重量份计，将肉桂1-3份，采用水蒸气蒸馏方法提取肉桂挥发油1-3次，收集所得挥发油，采用辅料包合挥发油得包合物，将包合物与浸膏混合。

采用该方法制得的充分利用了药物组合物各个药材的有效成分。

第三方面，本申请提供一种技术方案：

采用上述药物组合物的制备方法制得的药物组合物的hplc指纹图谱建立方法，按照高效液相色谱法建立指纹图谱，包括：

高效液相色谱法的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，流动相中乙腈水溶液的体积比分别为：0-10min，乙腈5％；10-60min，乙腈10-50％，检测波长为230nm，柱温30℃；

制备供试品溶液：取药物组合物干膏0.9-1.1g，加入水饱和的正丁醇溶液50ml，密塞，放置过夜，超声处理28-33分钟，滤过，弃去初滤液，取续滤液25ml，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液；

用高效液相色谱法测定供试品溶液：分别吸取不同批次的供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪测定；

分别记录不同批次的供试品溶液的色谱图，并将各色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，以中位数法建立hplc指纹图谱，生成包含共有峰的对照特征图谱。

在本申请的其他实施例中，对照特征图谱包括16个共有峰；

待检测药物组合物的高效液相色谱图谱中的每一个色谱峰与每一个共有峰的相似度应当≥95％。

在本申请的其他实施例中，hplc指纹图谱建立方法适用于药物组合物在提取、浓缩、干燥以及成品制剂全过程。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请实施例1、2、4提供的样品中黄芪薄层鉴别图，其中，图中1表示样品1；2表示样品2；3表示样品3；4表示黄芪对照药材；

图2为本申请实施例1、2、4提供的样品中人参薄层鉴别图；其中，图中1表示样品1；2表示样品2；3表示样品3；4表示人参对照药材；5表示人参皂苷rb1、re、rf、rg1对照品；

图3为本申请实施例1、2、4提供的样品中甘草薄层鉴别图；其中，图中1表示样品1；2表示样品2；3表示样品3；4表示甘草对照药材；

图4为本申请实施例1、2、4提供的10个样品干膏粉的16个共有峰构成的对照特征图谱；

图5为本申请实施例1提供的工艺条件下的提取液、浓缩液、干膏粉、颗粒剂样品的各色谱图的相应位置均有相同的16个色谱峰。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

目前保元汤常见的服用方法是将黄芪、人参、甘草、肉桂加水煮成中药汤汁后服用。但是这种方法在沸煮的过程中，挥发量大，而且各个原料中的有效物质的挥发温度也不相同，有些原料中的有效物质已经挥发的所剩无几，有些原料中的有效物质还没有有效溶入到中药汤剂中，因此很难保证最终煮好的中药汤汁中的有效物质，质量无法充分保证。

本申请实施方式提供了一种药物组合物的制备方法，包括：

按照重量份计，将黄芪15-25份、人参8-12份、甘草3-8份、肉桂1-3份以及生姜1-3份混合后，提取2-4次后，合并提取液，于60-80℃浓缩为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏。

通过将黄芪、人参、甘草、肉桂以及生姜混合后，提取2-4次后，合并提取液，于60-80℃浓缩为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏。能够保证最终获得的药物组合物浸膏中包含了黄芪、人参、甘草、肉桂以及生姜各个原料的有效物质，且保证各个有效物质的充分利用。采用该方法制得的药物组合物，可以用于改善元气虚弱，精神倦怠，肌肉柔慢，饮食少进等。

进一步地，在本申请一些实施方式中，上述的药物组合物的制备方法包括以下步骤：

s1、按照配方黄芪15-25份、人参8-12份、甘草3-8份、肉桂1-3份以及生姜1-3份，分别称取各个药材。

在上述的配比范围内，能够保证后续提取各个药材中的有效物质后，最终获得的药物组合物浸膏中的各个有效物质在恰当的范围内，保证最终获得的药物组合物浸膏中各个药材的有效物质的配比关系。

进一步可选地，按照配方黄芪20-24份、人参9-10份、甘草4-6份、肉桂1.5-2.5份以及生姜1.5-2份，分别称取各个药材。

在上述的配比范围内，也能够保证后续提取各个药材中的有效物质后，最终获得的药物组合物浸膏中的各个有效物质在恰当的范围内。

s2、将步骤s1中称量的各个药材混合后提取2-4次。

通过将各个药材混合后提取2-4次，能够有效地保证最终获得的药物组合物浸膏中的各个药材的有效物质的含量在恰当的范围内。

进一步可选地，在本申请其他可选的实施方式中，上述将各个药材混合后提取的次数可以选择提取2-3次。

进一步可选地，在本申请其他可选的实施方式中，上述将各个药材混合后提取的次数可以选择提取2-3次。

进一步可选地，在本申请其他可选的实施方式中，上述将各个药材混合后提取的次数可以选择提取2次。

进一步地，上述提取的方式可以选择采用加水提取的方式。

在本申请其他可选的实施方式中，上述提取的方式可以选择采用其他的提取方式，例如乙醇、酯等其他溶剂提取。

进一步地，上述加水提取时，每次的加水量可以选择添加为药材混合物质量的6-8倍。

进一步可选地，上述加水提取时，每次的加水量可以选择添加为药材混合物质量的6.5-7.5倍。

示例性地，以加水提取的提取方式，提取2次，包括：

于步骤s1中称量的药材混合物中加入第一份水浸泡25-35分钟后，沸煮1-2小时；然后加入第二份水，沸煮0.5-1.5小时，合并两次提取液；

其中，第一份水的质量为混合物质量的7-9倍，第二份水的质量为混合物质量的5.5-6.6倍。

s3、对步骤s2中合并的提取液进行过滤。

通过对步骤s2中合并的提取液进行过滤能够去除合并的提取液中的残渣、杂质，进一步地提高提取液质量，提高提取液中的有效物质的提取效率，以及提取率。

进一步地，过滤时选择110-140目筛。

通过选择110-140目筛，能够去除绝大多数的杂质、残渣，提高提取液的质量，保证后续制得的药物组合物中有效物质的含量。

进一步可选地，过滤时选择120-130目筛。

s4、于60-80℃浓缩步骤s3中制得的经过过滤后的提取液，并将提取液浓缩为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏。

通过对步骤s3中制得的提取液进行浓缩，能够提高各个药材中的有效物质的相对含量，提高整个药物组合物浸膏的效力。

进一步可选地，于60-80℃浓缩为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏的步骤包括：

将步骤s3中制得的提取液在温度为60-80℃，真空度为-0.06～0.08mpa条件下减压干燥至相对密度为1.05～1.30g/cm³的浸膏。

进一步可选地，于60-80℃浓缩为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏的步骤包括：

将步骤s3中制得的提取液在温度为65-75℃，真空度为-0.065～0.075mpa条件下减压干燥至相对密度为1.1～1.2g/cm³的浸膏。

s5、对步骤s4中制得的浸膏进行干燥。

进一步地，对浸膏进行干燥是在进风温度150-170℃条件进行喷雾干燥，直至将浸膏干燥为粉末。

进一步可选地，对浸膏进行干燥是在进风温度155-165℃条件进行喷雾干燥，直至将浸膏干燥为粉末。

示例性地，在引风机频率40hz～50hz，雾化器频率40hz～50hz，进风温度150-170℃条件下进行喷雾干燥得干膏粉，干膏粉得率为25-40％，干膏粉含水量≤6％。

s6、将步骤s5中制得的浸膏粉末制备成药剂。

进一步地，药物组合物的药剂形式包括：片剂、丸剂、颗粒、胶囊或者液态饮品中的任意一种。

在本申请一些实施方式中，将步骤s5中制得的浸膏粉末制备成药剂的步骤包括：

向干燥后的粉末中加入辅料；

辅料包括麦芽糊精、糊精、糖粉、聚维酮、聚乙二醇、木糖醇、β-环糊精中的一种或多种的组合。

示例性地，向步骤s5中制得的浸膏粉末中加入5％-15％的麦芽糊精进行湿法制粒。

本申请的一些实施方式还提供了一种药物组合物的制备方法，包括：

按照重量份计，将黄芪15-25份、人参8-12份、甘草3-8份以及生姜1-3份混合后，加水提取2-4次后，合并提取液，于60-80℃浓缩为相对密度1.05～1.20g/cm³的浸膏；

然后按照重量份计，将肉桂1-3份，采用水蒸气蒸馏方法提取肉桂挥发油1-3次，收集所得挥发油，采用辅料包合挥发油得包合物，将包合物与浸膏混合。

采用该方法制得的药物组合物充分利用了各个药材的有效成分。

本申请的一些实施方式还提供了一种如上述实施方式提供的药物组合物的制备方法制得的药物组合物的hplc指纹图谱建立方法，按照高效液相色谱法建立指纹图谱，包括：

高效液相色谱法的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，流动相中乙腈水溶液的体积比分别为：0-10min，乙腈5％；10-60min，乙腈10-50％，检测波长为230nm，柱温30℃；

制备供试品溶液：取药物组合物干膏0.9-1.1g，加入水饱和的正丁醇溶液50ml，密塞，放置过夜，超声处理28-33分钟，滤过，弃去初滤液，取续滤液25ml，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液；

用高效液相色谱法测定供试品溶液：分别吸取不同批次的供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪测定；

分别记录不同批次的供试品溶液的色谱图，并将各色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，以中位数法建立hplc指纹图谱，生成包含共有峰的对照特征图谱。

进一步地，上述生成的对照特征图谱包括16个共有峰；

待检测药物组合物的高效液相色谱图谱中的每一个色谱峰与每一个共有峰的相似度应当≥95％。

进一步地，该hplc指纹图谱建立方法适用于药物组合物在提取、浓缩、干燥以及成品制剂全过程。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种药物组合物，是这样制得的：

分别称取处方药材黄芪2kg，人参1kg，甘草0.5kg，肉桂0.2kg，生姜0.2kg，加水提取两次，第一次加8倍量水，先浸泡30分钟，再加热煮沸，保持微沸提取1.5小时，第二次加6倍量水，加热保持微沸提取1小时，合并两次提取液，120目滤过。滤液在温度为70℃、真空度为-0.06～0.08mpa条件下减压干燥至相对密度为1.10(70℃)的浸膏。在引风机频率40hz～50hz，雾化器频率40hz～50hz，进风温度150-170℃条件下进行喷雾干燥得干膏粉1.26kg，干膏粉含水量≤4.5％。将干膏粉加入10％麦芽糊精进行湿法制粒，即得本实施例的药物组合物的颗粒制剂。

实施例2

本实施例提供一种药物组合物，是这样制得的：

分别称取处方药材黄芪2kg，人参1kg，甘草0.5kg，生姜0.2kg，加水提取三次，第一次加8倍量水，先浸泡30分钟，再加热煮沸，保持微沸提取1.5小时，第二次加6倍量水，加热保持微沸提取1小时，第三次加6倍量水，加热保持微沸提取1小时，合并三次提取液，120目滤过。滤液在温度为70℃、真空度为-0.06～0.08mpa条件下减压干燥至相对密度为1.25(70℃)的浸膏。干膏在70℃条件下减压干燥得干膏粉1.42kg，干膏粉含水量≤4.5％。另取肉桂药材1kg，进行水蒸气蒸馏方法提取肉桂挥发油二次，每次3小时，收集所得挥发油，取总油量1/5用β-环糊精进行充分包合，将包合物与干膏粉充分混合均匀，再加入5％糊精进行干法制粒，装胶囊，即得本实施例的药物组合物的胶囊制剂。

实施例3

本实施例提供一种药物组合物，与实施例1提供的药物组合物的制备方法相同，所不同之处在于，加入2％木糖醇和3％聚维酮充分混合后压片，即得本实施例的药物组合物的片剂。

实施例4

本实施例提供一种药物组合物，是这样制得的：

分别称取处方药材黄芪20g，人参10g，甘草5g，肉桂2g，生姜2g，加水提取两次，第一次加10倍量水，提取1.5小时，第二次加8倍量水，提取1小时，合并两次提取液，120目滤过滤。滤液在温度为70℃、真空度为-0.06～0.08mpa条件下减压干燥至相对密度为1.25(70℃)的浸膏。干膏在70℃条件下减压干燥得干膏粉，将干膏粉加入50倍量水充分溶解，加入木糖醇、牛磺酸、柠檬酸等配料，放置过夜后进行离心、超滤，消毒，灌装，即得本申请实施例的药物组合物的液体饮品。

实施例5

在本申请实施例1、2、4中制得的药物组合物干膏粉取样，共取10个批次的样品，采用高效液相色谱仪，建立药物组合物的hplc指纹图谱。

具体的实验条件：

1)色谱条件。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，流动相中乙腈水溶液的体积比分别为：0-10min，乙腈5％；10-60min，乙腈10-50％，检测波长为230nm，柱温30℃。

2)供试品溶液的制备。取样品，按干膏折算1g，精密称定，放入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)测定法。精密吸取供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

将各色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012.130723版本)，以中位数法建立hplc指纹图谱，生成由16个共有峰构成的对照特征图谱(见附图4)。

下面对实施例1-4提供的药物组合物中的有效物质进行考察。

实验例1

分别取实施例1、2、4中制得的干膏粉，编号为样品1、样品2、样品3，参照2015年版《中国药典》黄芪、人参、甘草薄层鉴别方法和样品处理方法，同时同法制备对照药材进行薄层鉴别。详细鉴别方法如下：

1)黄芪薄层鉴别。取本品干膏粉末样品1-3各1g，分别加乙醇30ml，加热回流20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3％氢氧化钠溶液15ml使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节ph值至5～6，用乙酸乙酯15ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干。残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液3μl，对照药材溶液20μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(10:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点(见附图1)。

2)人参薄层鉴别。取本品干膏粉末样品1-3各1g，分别加三氯甲烷40ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水0.5ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇10ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷rb1对照品、人参皂苷re对照品、人参皂苷rf对照品及人参皂苷rg1对照品，加甲醇制成每1ml各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取供试品和对照药材溶液各5μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点(见附图2)。

3)甘草薄层鉴别。取本品干膏粉末样品1-3各1g，分别加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取甘草酸单铵盐对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各1～2μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点(见附图3)。

从附图1-附图3的结果表明，样品1-3与各对照药材在相同位置显示相同斑点。说明本申请实施例1、2、4制备得到的药物组合物中均包含了黄芪、人参和甘草的有效成分，保证了制得的药物组合物有效性。

实验例2

取本申请实施例1工艺条件下的提取液(s1)、浓缩液(s2)、干膏粉(s3)、颗粒剂(s4)样品，测定指纹图谱，并与实施例5得到的对照特征图谱(附图4)对比，计算相似度。结果表明，实施例1中的提取液、浓缩液、干膏粉以及颗粒剂样品的各色谱图的相应位置均有相同的16个色谱峰，且相似度≥95％(见表1、附图5)。

表1指纹图谱相似度计算表

由表1和附图5的结构说明，本申请实施例制备方法制得的药物组合中的各药材的有效物质均得到充分提取和利用，质量得到了保证。

综上表明，本申请实施例所提供的药物组合物的制备方法及其hplc指纹图谱建立方法符合中药现代化发展方向，对中药古方进行了传承与发展，适合开发成补益类大品种，且质量能够得到充分保证。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。