基于Ti-MOF的光电化学传感器检测N1-甲基腺嘌呤的方法与流程

本发明属于光电化学分析领域，具体涉及一种检测m¹atp的光电化学传感器及其制备方法。

背景技术：

rna甲基化是一种重要的表观遗传事件，在基因表达的转录后调控中发挥重要作用，直接影响蛋白质的产生。rna的甲基化主要发生在环外的胺基、嘌呤和嘧啶的一些特定的氮和碳的位置以及2ˊ-oh位置的氧原子上。

n¹-甲基腺嘌呤(n¹-methyladenosine，m¹a)是一种在非编码rna(ncrna)和信使rna(mrna)中普遍存在的甲基化修饰，其发生在从酵母到哺乳动物的真核细胞的数千个不同的基因转录物上，由于m¹a在沃森克里克界面n¹位置的甲基，m¹a会干扰正常碱基配对。另外，m¹a在trna三级结构、核糖体的生物发生和翻译中也发挥着重要作用。但是，对于m¹a的检测，目前的测序技术还没有达到单碱基分辨率，这阻碍了m¹a的功能研究，因此对其生物学功能知之甚少，并且对于m¹a，目前尚不清楚哪种甲基转移酶可以催化mrna中m¹a的形成。因此，m¹a的检测对研究其生物学影响、作用机制等具有重要意义。到目前为止，已经有人陆续研究出了一些m¹a的检测方法，比如目前主要有薄层色谱、气相色谱、柱液相色谱、液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等。然而，这些方法存在需要昂贵的大型仪器，样品前处理繁琐，需要专业的操作人员，检测灵敏性较低和特异性不强等缺点。因此，建立简单、快捷、具有高灵敏性和高选择性的方法，用于m¹a的检测，是至关重要的。

光电化学(pec)传感是一种相对较新的、动态发展的用于进行各种生物检测(如核酸、蛋白质和细胞)的技术，与传统的电化学方法相比，它具有更高的灵敏度和简单性。此外，光电化学分析方法还具有装置简单、设备易操作、响应速度快、易于微型化等优点。光电化学分析的这些优点，使它在生物分析和环境检测等领域引起了人们广泛的关注。光活性材料是光电化学传感器中最重要的一部分，如何建立光活性材料与待检测物质之间的作用关系，以提高光活性材料的光电活性的灵敏度是光电化学检测的难点所在。目前还未见基于ti-mof的光电化学免疫传感器检测n¹-甲基腺嘌呤的制备方法。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供基于ti-mof的光电化学免疫传感器检测n¹-甲基腺嘌呤的制备方法，利用石墨相氮化碳和钒酸铋的异质结的良好的光电活性和生物兼容性，抗体对抗原的特异性识别性能，以及tio2@nh2-mil-125(ti)作为信号扩大单元，实现对n1-甲基腺嘌呤的高灵敏性和高特异性检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种检测n¹-甲基腺嘌呤的光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)以ito电极为基础电极，对基础电极进行预处理；利用ito电极表面的含氧集团与bivo4-g-c3n4之间的静电吸附力，将bivo4-g-c3n4修饰于处理后的电极表面；

(2)利用bivo4-g-c3n4与pamam之间的物理吸附作用，将pamam修饰于步骤(1)处理后的电极表面；

(3)通过cpba的羧基与pamam的氨基之间的相互作用，将cpba修饰于步骤(2)处理后的电极表面；

(4)利用cpba的硼酸基团与m¹a抗体中的糖苷反应，将m¹a抗体修饰于步骤(3)处理后的电极表面；

(5)通过抗原与抗体的特异性识别作用识别m¹atp，将m¹atp修饰于步骤(4)处理后的电极表面；

(6)利用tio2@nh2-mil-125(ti)中的ti⁴⁺识别m¹atp中的磷酸根同时进行信号放大，将tio2@nh2-mil-125(ti)修饰于步骤(5)处理后的电极表面。

优选的，基础电极的预处理方法为：将基础电极先用乙醇和氢氧化钠的混合液超声清洗30分钟，再去离子水清洗，然后用丙酮超声清洗30分钟，最后用去离子水清洗，晾干。未经预处理的电极上一般会有较大的过电势，从而导致反应迟钝、能耗升高。为了发挥电极的优势，提高电极的活性，需要对电极表面进行预处理。采用本发明的电极预处理方法可以降低的电极过电势，从而有效提高电极的活性。

优选的，将bivo4-g-c3n4修饰于处理后的电极表面的方法为：将bivo4-g-c3n4用去离子水制成bivo4-g-c3n4分散液，将bivo4-g-c3n4分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯照射下干燥，然后清洗3-5次，氮气吹干。

更为优选的，所述bivo4-g-c3n4分散液的浓度为0.1-8mg/ml。

优选的，将pamam修饰于步骤(1)处理后的电极表面的方法为：将pamama溶液滴加到修饰有bivo4-g-c3n4的电极表面，红外灯照射下干燥，然后清洗3-5次，氮气吹干。

优选的，将cpba修饰于步骤(2)处理后的电极表面：将cpba溶液滴加到修饰有pamam的电极表面，在室温和潮湿条件下反应1.5-4h，然后清洗3-5次，氮气吹干。

优选的，将m¹a抗体修饰于步骤(3)处理后的电极表面：将m¹a抗体溶液滴加到修饰有cpba的电极表面，在室温和潮湿条件下反应5-15h，然后清洗2-6次。

优选的，将m¹atp修饰于步骤(4)处理后的电极表面：将m¹atp溶液滴加到修饰有m¹a抗体的电极表面，25-45℃和潮湿条件下反应0.5-4h，然后清洗3-5次，氮气吹干。

优选的，将tio2@nh2-mil-125(ti)修饰于步骤(5)处理后的电极表面的方法为：将含有0.01-10mg/mltio2@nh2-mil-125(ti)溶液滴加到修饰有m¹atp的电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5-3h，然后清洗3-5次，氮气吹干。

本发明的第二方面，提供一种检测n¹-甲基腺嘌呤的光电化学生物传感器。

上述光电化学生物传感器在检测m¹atp中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供一种利用上述光电化学传感器检测m¹atp的方法，包括以下步骤：

以电化学工作站为信号采集仪器，500w氙灯为可见光光源，以光电化学传感器的tio2@nh2-mil-125(ti)/m¹atp/ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有0.1m抗坏血酸的0.1m磷酸盐(ph7.4)缓冲液为检测液，建立电流与m¹atp浓度之间的关系，对m¹atp含量进行检测。

本发明的有益效果：

(1)本发明的检测方法简单，仅在ito电极表面进行6次简单的修饰，即可进行m¹atp的检测。

(2)本发明的光电化学传感器实现了仪器小型化，且易于操作，检测费用低。

(3)本发明的检测具有非常高的检测灵敏性，检测限可达16.667pm；而且，本发明是基于m¹atp和其抗体的特异性识别作用，具有很高的检测选择性。

附图说明

图1：本发明的光电化学传感器组装示意图。

图2：光电流与m¹atp浓度的线性拟合曲线。

图3：不同核苷酸条件下的光电化学响应变化的柱状图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明中的“室温”的范围为20-30℃。

本发明中的“潮湿条件”为湿度大于90％；优选湿度为95-99％。

本发明中所使用的清洗液的成分为：0.01-0.1mtris-hcl和20-60mmkcl，ph7.4。

本发明中所使用的m¹a抗体缓冲液的成分为：0.01-0.1mpbs，ph6.0-8.5。

本发明中所使用的检测液为：0.01-0.1mnah2po4和0.05-0.2maa,ph为5.4-8.5。

本发明中的石墨相氮化碳和钒酸铋的异质结用bivo4-g-c3n4表示，4.0代聚酰胺-胺用pamam表示，对羧基苯硼酸用cpba表示。本发明所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

正如背景技术部分所介绍的，m¹a在trna三级结构、核糖体的生物发生和翻译中也发挥着重要作用。因此对m¹a含量的检测分析有助于诊断免疫系统、内分泌系统、神经系统等方面的疾病的研究，有助于研究干细胞分化、基因组衰老、减数分裂、昼夜节律等生物发育过程。但是由于m¹atp的常规的检测方法存在需要放射性元素标记和精密复杂的仪器等缺点，因此需要开发一种新的检测方法。

本申请发明人在前期研究中基于g-c3n4-cdsqds、ru@sio2、ru@uio-66以及bivo4@tio2等材料制备了4种pec生物传感器，实现了对甲基化rna和m⁶atp快速灵敏的检测。光活性材料是光电化学传感器中最重要的一部分，如何建立光活性材料与待检测物质之间的作用关系，以提高光活性材料的光电活性的灵敏度是光电化学检测的难点所在。因此，开发新的光活性材料以及建立新的光活性材料与待检测物质之间的作用关系具有十分重要的意义。

本发明首次提出了一种基于ti-mof的光电化学免疫传感器检测n¹-甲基腺嘌呤的方法，实现了对m¹atp的高特异性和高灵敏性检测。本发明采用具有合适能带结构位置的bivo4和g-c3n4，bivo4导带中的光激发电子可以很容易地迁移到g-c3n4价带中相邻的光生空穴，从而抑制g-c3n4的光生电子-空穴对的复合速率，使其能进行高效的电子空穴转移和分离，因此bivo4-g-c3n4复合材料具有很好光电性能。并且nh2-mil-125(ti)具有可调节的孔隙度，可容纳功能客体，具有独特的协同效应，本发明采用nh2-mil-125(ti)封装无定形二氧化钛得到的tio2@nh2-mil-125(ti)来改善光子产生的载流子转移，减少电子-空穴对的复合，从而达到增强光电流的目的。根据光电流与m¹atp的浓度的线性关系，可实现对m¹atp的检测。

本发明检测m¹atp的光电化学传感器的构建及检测原理如图1所示，以ito电极为基体电极，利用ito电极表面的含氧集团与bivo4-g-c3n4之间的静电吸附力，将bivo4-g-c3n4修饰到电极表面。再利用bivo4-g-c3n4与pamam之间的物理吸附作用，将pamam修饰到电极表面。然后，通过cpba的羧基与pamam的氨基之间的相互作用，将cpba修饰到电极表面。接着利用硼酸基团与m¹a抗体中的糖苷反应连接抗体。通过抗原与抗体的特异性识别作用识别m¹atp。最后，利用tio2@nh2-mil-125(ti)中的ti⁴⁺识别m¹atp中的磷酸根同时进行信号放大。tio2@nh2-mil-125(ti)可明显提高传感器的光电响应，从而提高检测灵敏度。因此，利用m¹atp的浓度与光电流的线性关系，可实现对m¹atp的检测。

在本发明的一种实施方案中，给出的光电化学传感器的构建方法如下：

(1)bivo4-g-c3n4分散液的制备：称取3～24mgbivo4-g-c3n4，加入到去离子水中，超声分散1～3小时，制成浓度为0.1～8mg/ml的bivo4-g-c3n4分散液。

其中bivo4-g-c3n4由如下方法制备：

(a)制备g-c3n4：将三聚氰胺放入瓷舟，在管式炉中以550℃煅烧3～5h，冷却至室温后，取出样品，研磨后称取500mg的g-c3n4加入到200ml异丙醇中超声8h，随后在10000rpm下离心10min，放入60℃烘箱中干燥，得到剥离的g-c3n4。

(b)制备片状bivo4：1.225gbi(no3)3·5h2o溶于5ml4.0mol/lhno3；0.29gnh4vo3溶于5ml2.0mol/lnaoh。分别称取0.125g十二烷基苯磺酸钠(sdbs)加入到上面两个溶液，剧烈搅拌0.5h，将两溶液混合，用2.0mol/l的naoh调节ph＝7.0，搅拌0.5h，将溶液放入反应釜中，再将反应釜放入200℃烘箱中，反应3～5h，冷却至室温后，在10000rpm下离心10min，将固体用去离子水洗涤三次后，在100℃下干燥4h，得到黄色固体，放入研钵中研磨后待用。

(c)制备bivo4-g-c3n4复合材料：按质量比3：1分别称取bivo4和剥离后的g-c3n4，放入研钵中研磨，使其混合均匀，随后放入瓷舟中利用管式炉在400℃下通氮气煅烧0.5～2h，冷却至室温后取出样品，放入研钵中研磨后即得bivo4-g-c3n4。

(2)ito电极预处理：将ito导电玻璃分割成5×1cm²，然后用乙醇/naoh混合液(体积比例为1:1～1:6)超声清洗30-60分钟，最后再用丙酮和二次水再分别清洗30-60分钟，并在室温下晾干，待用。

其中tio2@nh2-mil-125(ti)由如下方法制备：

(a)制备nh2-mil-125(ti)：将2-氨基对苯二甲酸(1.36g,7.5mmol)、钛酸四丁酯(1.8ml，5.3mmol)加入含有9mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)和1ml甲醇的溶液中，搅拌60min，随后放入50ml反应釜中，在150℃条件下反应24～72h，冷却至室温后，在10000rpm下离心10min，将固体用dmf和甲醇各洗三次，在60℃条件下干燥得到黄色固体，将固体放入研钵中研磨成粉末状后待用。

(b)制备tio2@nh2-mil-125(ti)：称取0.40gnh2-mil-125(ti)加入到40ml甲醇中，超声20min，再搅拌0.5～2h，向其中缓慢滴加500μl钛酸四丁酯，随后迅速升温至85℃，回流12h，冷却至室温后，在10000rpm下离心10min，用甲醇洗涤3次，放入60℃烘箱中干燥后取出研磨即得tio2@nh2-mil-125(ti)。

(3)bivo4-g-c3n4的固定：将25～76μlbivo4-g-c3n4分散液滴加到预处理的ito电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3～5次。氮气吹干。制备的电极标记为bivo4-g-c3n4/ito。

(4)pamam的修饰：将16～55μlpamam溶液滴加到bivo4-g-c3n4/ito电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3～5次。氮气吹干。制备的电极标记为pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

(5)cpba固定：将23～54μl浓度为2.3～6.8mmcpba溶液滴加到pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极表面，室温和潮湿条件下反应1.5～4小时。然后，将电极用清洗液清洗3～5次。氮气吹干。制备的电极标记为cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

(6)m¹a抗体的固定：将5～25μl含有5μg/mlm¹a抗体的缓冲液滴加到cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极表面，室温和潮湿条件下反应5～15小时，用清洗液清洗2～6次。电极标记为ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

(7)m¹atp的修饰：将12～47μl含有不同浓度的m¹atp溶液滴加到ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极表面，25～45℃和潮湿条件下反应0.5～4小时。然后，将电极用清洗液清洗3～5次。氮气吹干。制备的电极标记为m¹atp/ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

(8)tio2@nh2-mil-125(ti)的修饰：将含有0.01～10mg/mltio2@nh2-mil-125(ti)溶液滴加到m¹atp/ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极表面，室温和潮湿条件下反应0.5～3h，然后清洗3～5次，氮气吹干。制备的电极标记为tio2@nh2-mil-125(ti)/m¹atp/ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

上述光电化学生物传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败，各步骤间具有协同促进作用。本发明利用bivo4-g-c3n4良好的光电活性和生物兼容性，抗体对抗原的特异性识别性能，以及利用tio2@nh2-mil-125(ti)中的ti⁴⁺识别m¹atp中的磷酸根同时进行信号放大。实现对m¹atp的高灵敏性和高特异性检测。

在本发明的另一种实施方案中，给出了利用上述光电化学传感器检测m¹atp的方法，包括以下步骤：

(1)将不同浓度的m¹atp滴加到ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4修饰的ito电极表面，孵育，利用抗原与抗体的特异性识别作用识别m¹atp，再利用tio2@nh2-mil-125(ti)进行信号放大；

(2)通过建立光电流和m¹atp浓度的关系曲线对m¹atp进行检测。

需要说明的是，上述检测方法为非疾病诊断方法。在非疾病诊断方面，可以通过检测m¹atp的含量，发现相关的靶向药物，为新药物的开发提供新的方法。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

实施例1：检测m¹atp的光电化学传感器的构建

(1)bivo4-g-c3n4分散液的制备：称取bivo4-g-c3n4加入到去离子水中，超声分散2小时，制成浓度为2.5mg/ml的bivo4-g-c3n4分散液。

(2)ito电极预处理：将ito导电玻璃分割成5×1cm²，然后用乙醇/naoh混合液(体积比例为1:3)超声清洗60分钟，最后再用丙酮和二次水再分别清洗30分钟，并在室温下晾干，待用。

(3)bivo4-g-c3n4的固定：将50μlbivo4-g-c3n4分散液滴加到预处理的ito电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗4次。氮气吹干。制备的电极标记为bivo4-g-c3n4/ito。

(4)pamam的修饰：将16-55mlpamam溶液滴加到bivo4-g-c3n4/ito电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗4次。氮气吹干。制备的电极标记为pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

(5)对羧基苯硼酸固定：将30μl浓度为5.0mmcpba溶液滴加到pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极表面，室温和潮湿条件下反应2.5小时。然后，将电极用清洗液清洗4次。氮气吹干。制备的电极标记为cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

(6)m¹a抗体的固定：将15μl含有5μg/ml的抗体溶液滴加到cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极表面，室温和潮湿条件下反应12小时，用清洗液清洗5次。电极标记为：ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

(7)m¹atp的修饰：将30μl含有不同浓度的m¹atp溶液滴加到ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极表面，35℃和潮湿条件下反应2.5小时。然后，将电极用清洗液清洗4次，氮气吹干。制备的电极标记为m¹atp/ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

(8)tio2@nh2-mil-125(ti)的修饰：将30μl含4mg/mltio2@nh2-mil-125(ti)溶液滴加到m¹atp/ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极表面，室温和潮湿条件下反应6h，然后清洗4次，氮气吹干。制备的电极标记为tio2@nh2-mil-125(ti)/m¹atp/ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito。

实施例2：光电化学检测

以电化学工作站为信号采集仪器，500w氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)，tio2@nh2-mil-125(ti)/m¹atp/ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有0.1mnah2po4和0.1maa(ph7.4)的缓冲液为检测液，以-0.3v电压为工作电压，采用i-t技术进行待测物的检测研究，建立光电流与m¹atp浓度之间的关系，线性范围为0.05-35nm，校正曲线为i(na)＝145.63logc(nm)+688.94(r＝0.9958)，检出限为16.7pm(图2)。

实施例3：检测选择性实验

为了研究构建的传感器的特异性，选择amp、cmp、gmp、ump、5-甲基胞嘧啶(5mc)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)、5-甲酰基胞嘧啶(5fc)、5-羧基胞嘧啶(5cac)、和5-甲基尿嘧啶(5mu)作为对比试剂。并对不同对比试剂参与构建的传感器的光电流变化值(δi＝i1-i2，i1是ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito经过不同核苷酸处理后的电极继续经tio2@nh2-mil-125(ti)处理后的电极的光电流流值，i2是ab/cpba/pamam/bivo4-g-c3n4/ito的电流值，对比试剂和m¹atp的浓度均为1nm进行了对比。结果表明(图3)，对比试剂参与构建传感器电流值变化明显低于m¹atp参与反应构建传感器的电流值大小，表明构建的传感器具有很好的特异性。

实施例4：稳定性实验

采用实施例1制备的光化学传感器(m¹atp浓度为1nm)，在检测液中检测光电流。得到光电流的标准相对偏差为0.18％，说明该方法有很好的稳定性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。