检测免疫功能指标的试剂的应用与复发性流产检测试剂盒和方法与流程

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及检测免疫功能指标的试剂的应用与复发性流产检测试剂盒和方法。

背景技术：

人体免疫细胞的免疫功能不仅与各类疾病(如癌症、自身免疫病)直接相关，还与女性生殖健康密切相关。一般认为妊娠是一种同种异体移植，胚胎的正常生长有赖于其在母体内免疫耐受状态的维持，一旦这种状态被打破，则会导致流产。机体免疫耐受状态决定于体内免疫细胞的功能状态，所以免疫细胞功能是母体能否正常妊娠、是否会反复流产的重要决定因素。

复发性流产(rsa)一般是指连续2次或2次以上自然流产者，其危害性极大，不仅严重损害家庭和睦，还会对母体的身体和精神造成不可逆的损伤，甚至导致终生不孕。按病因分析，rsa主要分为非免疫型rsa和免疫型rsa；非免疫型rsa病因多已明确，主要包括：解剖因素、感染因素、内分泌因素、遗传因素等。而目前的研究表明30％-40％的rsa与免疫因素有关，免疫型rsa的致病原理非常复杂，其中少部分是由抗磷脂抗体引起，但大部分免疫型rsa患者，病因不明，难以检测和治疗。

目前国内外关于复发性流产的诊断与检测一般集中于体态检查、妇科检查、相关微生物检查、易感基因以及相关染色体检查、血清microrna标志物检测。这些检测虽然能够从遗传、体态、外部感染等方面对母体进行检查，但无法给与全方位的评估。

复发性流产的免疫学诊断相对落后，主要是检测自身抗体，如抗磷脂抗体、抗核抗体、抗dna抗体、抗精子抗体、封闭抗体；另外还有少数学者或机构已经开始对母体淋巴细胞进行研究。现有的研究表明夫妻间hla-ⅰ、ⅱ类分子相容性增加，胎儿受到母体的免疫攻击，最终可能导致流产；另外子宫nk细胞比例失调也会导致rsa的发生；蜕膜上cd4⁺cd25⁺treg(调节性t细胞)细胞在保护胎儿免遭母胎界面同种异体免疫攻击中发挥重要作用。

但这些检测只是评估某一个或某一小类免疫因素，评估也不够深入，所获信息非常片面，无法给与母体全面的免疫功能评估。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供检测免疫功能指标的试剂的应用与复发性流产检测试剂盒和方法，以全面快速对复发性流产疾病作出相应的诊断或患病风险进行预判。

本发明是这样实现的：

针对现有技术存在的问题，本发明的发明人认为只有对母体与生殖相关的免疫细胞进行全面综合的功能评估，才能给予rsa患者恢复平衡免疫功能的专业指导，才能从根本上预防复发性流产。

那么，如何知道患者的免疫功能是否得到提升或恢复，这就需要一种精确、定量、快速、低费用的免疫功能检测方法。目前文献报道的能检测免疫功能的方法有：1、通过免疫细胞受体(tcr)的多样性分析免疫功能，这种方法属于间接的方法，方法复杂，需要专门仪器设备，对分析人员要求极高，数据分析难度大，成本高，不利于推广应用；2、通过分析血液的血清中细胞因子水平，间接分析免疫功能，这种方法成本极高，需要专门仪器设备，操作难度高，对人员的技术水平要求高，不利于临床推广应用。

本发明的发明人通过对比分析多例未生育样本、多例已生育样本、多例复发性流产样本的外周免疫功能，发现了多项免疫功能指标与该疾病具有高度相关性，因此，通过检测这些免疫功能指标可以对复发性流产疾病作出相应的诊断或患病风险进行预判。

第一方面，本发明提供了检测免疫功能指标的试剂在制备复发性流产检测试剂盒中的应用，所述免疫功能指标包括如下指标：总的t细胞、双阳性t细胞、外围辅助tfh细胞、终末分化cd4⁺t细胞、中心记忆cd4⁺t细胞、tc2亚群cd8⁺t细胞、潜在功能性cd8⁺t细胞、活化的nk细胞、未成熟的nk细胞、成熟的nk细胞、未成熟/成熟的nk细胞比值以及nkp30阳性的vδ2亚群γδt细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂为抗体，所述抗体包括抗如下蛋白的单克隆抗体：

cd3、cd4、cd8、cd45ra、ccr7、cd28、cd56、nkg2d、nkp30、vδ2和γδ。

即上述抗体包括如下单克隆抗体：抗cd3单克隆抗体、抗cd4单克隆抗体、抗cd8单克隆抗体、抗cd28单克隆抗体、抗cd45ra单克隆抗体、抗ccr7单克隆抗体、抗γδ单克隆抗体、抗cd56单克隆抗体、抗nkg2d单克隆抗体、抗nkp30单克隆抗体和抗vd2单克隆抗体。

使用这些抗体通过流式细胞仪检测技术可以容易检测出cd3、cd4、cd8、cd45ra、ccr7、cd28、cd56、nkg2d、nkp30、vδ2或γδ表达阳性的t细胞，进而得到上述各项免疫功能指标。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述单克隆抗体带有荧光染料；所述荧光染料选自：apc-cy7，apc-r700，af647，bv510，pe，bv421，bb515，bv605，pe-cy7，bb700，alexafluor350-790，cy3，cy5，dylight488-680，pe-alexafluor，pe-cy5，pe-cy7中的任意一种，或其他同类型的荧光染料。

需要说明的是，每种克隆抗体的荧光染料根据检测需要进行选择，只要能够区分各抗体即可。

第二方面，本发明提供了一种复发性流产检测试剂盒，其包括检测免疫功能指标的试剂，所述免疫功能指标包括如下指标：总的t细胞、双阳性t细胞、外围辅助tfh细胞、终末分化cd4⁺t细胞、中心记忆cd4⁺t细胞、tc2亚群cd8⁺t细胞、潜在功能性cd8⁺t细胞、活化的nk细胞、未成熟的nk细胞、成熟的nk细胞、未成熟/成熟的nk细胞比值以及nkp30阳性的vδ2亚群γδt细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂为抗体，所述抗体包括抗如下蛋白的单克隆抗体：

cd3、cd4、cd8、cd45ra、ccr7、cd28、cd56、nkg2d、nkp30、vδ2和γδ。

即上述抗体包括如下单克隆抗体：抗cd3单克隆抗体、抗cd4单克隆抗体、抗cd8单克隆抗体、抗cd28单克隆抗体、抗cd45ra单克隆抗体、抗ccr7单克隆抗体、抗γδ单克隆抗体、抗cd56单克隆抗体、抗nkg2d单克隆抗体、抗nkp30单克隆抗体和抗vd2单克隆抗体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述单克隆抗体带有荧光染料；所述荧光染料选自：apc-cy7、apc-r700、af647、bv510、pe、bv421、bb515、bv605、pe-cy7、bb700、alexafluor350-790、cy3、cy5、dylight488-680、pe-alexafluor、pe-cy5和pe-cy7中的任意一种、或其他同类型的荧光染料。

第三方面，本发明提供了一种检测免疫功能指标的方法，其包括：将检测免疫功能指标的试剂与样品混合；所述免疫功能指标包括如下指标：总的t细胞、双阳性t细胞、外围辅助tfh细胞、终末分化cd4⁺t细胞、中心记忆cd4⁺t细胞、tc2亚群cd8⁺t细胞、潜在功能性cd8⁺t细胞、活化的nk细胞、未成熟的nk细胞、成熟的nk细胞、未成熟/成熟的nk细胞比值以及nkp30阳性的vδ2亚群γδt细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂为抗体，所述抗体包括抗如下蛋白的单克隆抗体：

cd3、cd4、cd8、cd45ra、ccr7、cd28、cd56、nkg2d、nkp30、vδ2和γδ。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述单克隆抗体带有荧光染料；所述荧光染料选自：apc-cy7、apc-r700、af647、bv510、pe、bv421、bb515、bv605、pe-cy7、bb700、alexafluor350-790、cy3、cy5、dylight488-680、pe-alexafluor、pe-cy5和pe-cy7中的任意一种，或其他同类型的荧光染料；

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述样品为人外周血单核细胞。

本发明具有以下有益效果：

本发明的研究显示，通过多项免疫功能指标如总的t细胞、双阳性t细胞、外围辅助tfh细胞、终末分化cd4⁺t细胞、中心记忆cd4⁺t细胞、tc2亚群cd8⁺t细胞、潜在功能性cd8⁺t细胞、活化的nk细胞、未成熟的nk细胞、成熟的nk细胞、未成熟/成熟的nk细胞比值以及nkp30阳性的vδ2亚群γδt细胞等12项指标可以全面反映复发性流产疾病的患病可能性，进而通过检测这些免疫功能指标可以对复发性流产疾病作出相应的诊断或患病风险进行预判，因此，检测免疫功能指标的试剂可以在制备复发性流产检测试剂盒中进行应用，利用制备的制剂盒检测这些免疫功能指标，这为复发性流产疾病的诊断或预判提供了一种新的思路或策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为总的t细胞、双阳性t细胞、外围辅助tfh细胞、终末分化cd4⁺t细胞、中心记忆cd4⁺t细胞、tc2亚群cd8⁺t细胞和潜在功能性cd8⁺t细胞在不同人群(未生育人群、已生育人群和复发性流产人群)中的比例，图中：“*”代表差异显著，p<0.05；“**”代表差异极显著，p<0.01；ns代表没有显著性差异。

图2为活化的nk细胞、未成熟的nk细胞、成熟的nk细胞和未成熟/成熟的nk细胞比值在不同人群(未生育人群、已生育人群和复发性流产人群)中的比例；图中：“*”代表差异显著，p<0.05；“**”代表差异极显著，p<0.01；ns代表没有显著性差异。

图3为nkp30阳性的vδ2亚群γδt细胞在不同人群(未生育人群、已生育人群和复发性流产人群)中的比例；图中：“*”代表差异显著，p<0.05；“**”代表差异极显著，p<0.01；ns代表没有显著性差异。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例分析了62例未生育人群的外周血样本、60例已生育人群的外周血样本、34例复发性流产人群的外周血样本(这些样本均来自医院，由临床医生提供)的外周免疫功能，主要是对外周血中的免疫细胞cd4⁺、cd8⁺t细胞，nk细胞和γδt细胞的各项功能指标进行分析。

结果：我们通过对大量临床样本的检测和分析，发现了12个免疫指标与复发性流产的发生风险具有高度相关性，12个免疫指标分别是：总的t细胞、双阳性t细胞、外围辅助tfh细胞、终末分化cd4⁺t细胞、中心记忆cd4⁺t细胞、tc2亚群cd8⁺t细胞、潜在功能性cd8⁺t细胞、活化的nk细胞、未成熟的nk细胞、成熟的nk细胞、未成熟/成熟的nk细胞比值以及nkp30阳性的vδ2亚群γδt细胞在正常人群以及复发性流产患者中存在显著差异(见图1-图3)。

基于上述结果，可以通过检测上述的12个免疫指标，可以为辅助临床诊断、干预提供依据，比如，怀孕前免疫调理/干预过程中，如果使这些显著增大或减小的参数回归正常，说明所采用的治疗方案能恢复患者的免疫功能，具有临床疗效。同时，如果通过检测发现干预不能使患者的免疫功能恢复正常，也可以提示医生应该及时更换治疗方案。而在免疫功能恢复正常后，则提示可以开始受孕。

实施例2

本实施例提供了复发性流产检测试剂盒，其包括如下单克隆抗体：抗cd3单克隆抗体、抗cd4单克隆抗体、抗cd8单克隆抗体、抗cd28单克隆抗体、抗cd45ra单克隆抗体、抗ccr7单克隆抗体、抗γδ单克隆抗体、抗cd56单克隆抗体、抗nkg2d单克隆抗体、抗nkp30单克隆抗体和抗vd2单克隆抗体。上述的每种单克隆抗体都带有荧光染料。

荧光染料选自：apc-cy7、apc-r700、af647、bv510、pe、bv421、bb515、bv605、pe-cy7、bb700、alexafluor350-790、cy3、cy5、dylight488-680、pe-alexafluor、pe-cy5和pe-cy7中的任意一种。每种抗体都可以通过市面上购得，其带有荧光染料可根据检测需要选择，不同的抗体所带有的荧光染料不同。

上述试剂盒的制备方法：提供上述单克隆抗体，在洁净环境下，按使用次数(50-500次)用不透光棕色塑料小管(标准抗体试剂管)分装，每管一种单克隆抗体，每管分装抗体的剂量与使用次数匹配。抗体试剂管规格为0.5ml-2ml。分装好后于4摄氏度条件保存，若为粉剂则可-20摄氏度保存，且使用前按使用者需求加入适量磷酸盐缓冲液(pbs)溶解，获得需要的浓度即可。若为液体制剂，则不需溶解，直接使用。

上述试剂盒的使用方法：每次对分离的人外周血单核细胞(pbmc)进行染色标记时，打开试剂盒，从每个抗体管中吸取1-5微升(μl)抗体，与200微升含pbmc的缓冲液混合，在4摄氏度条件下避光孵育10-30分钟后，即可进行后续上机检测和分析。

后续的检测和分析须用流式细胞仪进行，且使用及分析人员须谙熟并严格遵守流式细胞仪的使用规则。比如分析上述的12种免疫指标，在进行样本分析前，须按需求调整流式分析软件的模板(关于流式细胞仪的相关技术不在本试剂盒的论述范围内，相关技术操作可根据相应仪器说明进行，这些操作对本领域技术人员是常规的)，样本分析后所获得的流式结果，从操作软件即可获取各细胞群的比例，进而可计算出12种免疫功能指标的比例：总的t细胞、双阳性t细胞、外围辅助tfh细胞、终末分化cd4⁺t细胞、中心记忆cd4⁺t细胞、tc2亚群cd8⁺t细胞、潜在功能性cd8⁺t细胞、活化的nk细胞、未成熟的nk细胞、成熟的nk细胞、未成熟/成熟的nk细胞比值以及nkp30阳性的vδ2亚群γδt细胞。

结果判断：

参考下表1所给数值为各细胞亚群在健康人群中的变化范围。

表1

通过对免疫细胞功能表1中的12项指标与疾病发生、发展和临床治疗疗效的相关性分析，根据患者与正常人之间各参数差异的明显程度进行打分：

如果差异可靠性低于或等于95％(p≥0.05)，用“ns”表示，记0分；如果差异可靠性超过95％(p<0.05)，用“*”表示，记1分；如果差异可靠性超过99％(p<0.01)，记2分；如果差异可靠性超过99.9％(p<0.001)，记3分。

将各参数的打分求和，得到总得分，用s表示。s的取值范围为0到36。根据总得分，参考如下分级标准对患者进行评价：

s＝0：正常；

0﹤s≤10：基本正常，可适度调理；

11≤s≤20：免疫功能不正常，再次发生流产的风险较高，需调理或治疗干预；

21≤s≤36：免疫功能严重失调，再次发生流产的风险极高。须强化免疫调理或治疗、更换治疗方案等以纠正免疫功能。

育龄女性发生复发性流产，在临床上认为与机体的免疫功能具有密切的关系，需要通过对免疫功能的调理或干预，实现育龄女性的顺利怀孕。但目前，临床上检测、分析免疫功能的方法有限，特别是如何精准的诊断复发性流产女性的免疫功能究竟发生了哪些改变，目前在临床上还有困难。因此，基于本发明的研究结果，将有利于解决该问题。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。