一种传染性法氏囊病病毒抗体竞争ELISA检测方法及试剂盒与流程

一、技术领域

本发明涉及一种传染性法氏囊病病毒抗体竞争elisa检测方法及试剂盒，属于生物技术领域。

二、

背景技术：

传染性法氏囊病(ibd)是由传染性法氏囊病病毒(ibdv)引起的以侵害幼禽法氏囊为主要特征的传染病，该病是引起我国及世界养禽业经济损失严重的主要传染病之一。该病不仅引起患病动物死亡，而且还导致机体免疫抑制，使机体的免疫防御能力降低和对多种疫苗免疫接种失败。对易感鸡群实施疫苗接种是预防该病最有效的方法，但由于各地流行的ibdv毒株的毒力与抗原性的差异，每年由于ibd免疫失败或免疫抑制造成的经济损失巨大。鉴于此，进一步分析当前ibdv的分子流行病学，研制经济快捷的检测方法仍是当前ibd防控工作中亟待解决的重要课题。

检测鸡ibdv抗体的主要方法有：中和试验、琼扩、间接免疫荧光(ifa)及间接elisa(现有商品化试剂盒包被抗原为全病毒)。中和试验虽然是评价鸡群抗体的金标准，但因其操作繁琐，耗时较长，且需要培养细胞，不适合普通养殖场的使用。琼扩实验虽然操作不复杂，但不够灵敏且耗时较长，达不到快速和灵敏的目的。ifa操作也比较繁琐，需要培养细胞，且观察需要用的荧光显微镜价格昂贵。而elisa具备特异、简便、快速的特点。因此，目前普遍使用间接eilsa来评价鸡群内的ibdv抗体水平。但现有的商品化ibdv抗体elisa检测试剂盒均采用的是间接elisa，检测样品需要两步，耗时近2个小时，且价格昂贵。针对此，本研究采用竞争elisa来检测ibdv抗体。该方法只需一步就可以对血清样品进行检测，且耗时只需30min，相比间接elisa，更加快速高效。

三、

技术实现要素：

技术问题

传染性法氏囊病(ibd)是由传染性法氏囊病病毒(ibdv)引起的鸡和火鸡的一种急性、热性、高度接触性传染病，是引起我国及世界养禽业经济损失严重的主要传染病之一。

目前普遍使用间接eilsa来评价鸡群内的ibdv抗体水平。但现有的进口的商品化ibdv抗体间接elisa检测试剂盒价格昂贵，不利于推广应用；而国产的ibdv抗体间接elisa检测试剂盒其包被抗原为纯化的ibdv全病毒，而ibdv全病毒的培养需要细胞或者鸡，培养成本较高，且ibdv纯化需要比较昂贵的超速离心机，耗时较长。而本研究研制的ibdv抗体竞争elisa检测试剂盒，采用原核表达的重组vp2蛋白(rvp2)作为包被抗原，hrp-标记的vp2单抗为竞争抗体，可在30min内检测出样品的结果。比国内外现有的ibdv抗体间接elisa检测试剂盒有4大优点：耗时更短、特异性更好、检测样品范围更广、成本更低廉和生产更方便等优势，具有巨大的生产应用价值。

技术方案

一种传染性法氏囊病病毒抗体竞争elisa检测方法，其特征在于，以保藏编号为cctccno：c201966的抗传染性法氏囊病毒vp2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株1h6单克隆抗体为竞争抗体。

以rvp2重组vp2蛋白为包被抗原，其制备方法为：将ibdvvp2基因优化设计，根据genbank已登录的ibdvvp2序列eu417824.1和大肠杆菌密码子的偏爱性优化设计vp2基因，将vp2基因的atg去掉，全基因合成，定向克隆入原核表达载体pet-28a(+)中，构建原核表达质粒pet28+vp2，转化大肠杆菌rosetta(de3)；经iptg诱导后，离心收集细菌，然后按照histraphp说明书纯化rvp2。

该检测方法的具体步骤为，将纯化的rvp2重组蛋白用ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5μg/l，加入到酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜，用含10％fbs的pbst封闭液满孔封闭，37℃，2h，pbst洗涤3次，每次3min，拍干；加入1:500稀释的临床样本50μl/孔96份，同时加入hrp-vp2单抗50μl/孔，hrp-vp2单抗1:20000稀释，37℃，1h，pbst洗涤5次，每次3min，拍干；加入tmb显色剂100μl/孔，暗盒显色；2mh2so4终止，测a450值，判定结果。判定标准：pi＝100-样品od值/阴性平均od值x100，当pi＞50时，判为阳性；当pi≤50时，判为阴性。

所述的传染性法氏囊病病毒抗体竞争elisa检测方法可以直接应用。用所述的传染性法氏囊病病毒抗体竞争elisa检测方法也可以构建试剂盒应用。

有益效果

本发明建立的传染性法氏囊病病毒抗体竞争elisa检测方法，与现有的商品化的ibdv抗体检测试剂盒相比：耗时更短、特异性更好、检测样品范围更广、成本更低廉和生产更方便等优势，具有巨大的生产应用价值。

本发明的特点和优点如下：

本发明采用原核表达的重组vp2蛋白(rvp2)作为包被抗原，hrp-标记的vp2单抗为竞争抗体，可在30min内检测出样品的结果。比国内外现有的ibdv抗体间接elisa检测试剂盒有4大优点；

1、特异性更好：本试剂盒采用hrp-标记的vp2单抗为竞争抗体，而现有的间接elisa试剂盒采用ibdv多克隆抗体，众所周知，单抗比多抗具有更好的特异性。

2、检测样品范围更广：本试剂盒采用hrp-标记的vp2单抗为竞争抗体，可以不受检测样品来源的限制，可以检测各种动物来源或非动物来源的样品；而现有的间接elisa试剂盒其酶标二抗是针对鸡的血清样品，因此，其检测范围只能是来源于鸡的血清样品。

3、耗时更短：本试剂盒在检测样品时，只需将待检样品和hrp-标记的vp2单抗竞争抗体同时加入，只需一步，检测时间在30min左右；而现有的间接elisa试剂盒，需要2步，需要在待检血清与包被抗原反应后(需时：1h左右)，然后再加入酶标二抗反应(需时：1h左右)，总时间在2h以上。

4、成本更低廉和生产更方便：从包被抗原上来说，本研究研制的ibdv抗体竞争elisa检测试剂盒，采用原核表达的重组vp2蛋白(rvp2)作为包被抗原，只需普通的摇床就可以大量生产我们需要的包被抗原(rvp2)，而现有的商品化间接elisa试剂盒包被抗原为ibdv，ibdv的培养需要用到细胞或者鸡，生产成本高，还不方便。此外，本试剂盒使用的竞争抗体为vp2单克隆抗体，只需将杂交瘤细胞通过小鼠制备腹水就可以，1只小鼠可制备15ml左右的腹水，而1ml腹水就可获得4mlhrp-标记的vp2单抗，在检测样品时，还需将hrp-标记的vp2单抗稀释20000以上，综上，1只小鼠制备的腹水可获得hrp-标记的vp2单抗工作液总量为：15ml腹水×4mhrp-标记的vp2单抗×20000＝1.2×10⁶ml，1个试剂盒需要的hrp-标记的vp2单抗工作液为100ml左右，所以，1只小鼠制备的腹水就可满足10000个以上试剂盒的需求，其成本远低于多抗的生产成本。

四、附图说明

图110％sds-page分析vp2全长在大肠杆菌transsetta(de3)中的表达

图2westernblot分析hrp-vp2单抗与rvp2的反应性

生物保藏

该细胞株1h6于2019年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno：c201966，分类命名：抗传染性法氏囊病毒vp2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株1h6。

五、具体实施方式

1主要实验材料

传染性法氏囊病病毒(ibdv)b87中等毒力弱毒疫苗株购自南京天邦生物科技有限公司；e.colirosetta(de)3感受态细胞购自上海唯地生物科技有限公司；质粒纯化试剂盒购自omega公司；dna凝胶回收试剂盒购自全式金生物科技有限公司；限制性内切酶均购自takara公司。

2实验方法

2.1ibdvvp2基因在大肠杆菌中的表达

2.1.1ibdvvp2基因密码子的优化

根据genbank已登录的ibdvvp2序列(eu417824.1)和大肠杆菌密码子的偏爱性优化设计vp2基因，将vp2基因的atg去掉，使其融合pet28a(+)上的his标签，在大肠杆菌中进行融合表达。

2.1.2ibdvvp2基因重组表达质粒的构建

将优化设计的vp2基因，全基因合成，在其5′端和3′端添加bamhⅰ和xhoⅰ酶切位点，优化设计的vp2基因由通用生物系统(安徽)有限公司合成，并克隆于原核表达载体pet28a(+)中。用xhoi和mlui双酶切鉴定，并进行测序分析。获得的重组质粒命名为pet28-vp2(4-1350)。用含eb的1％琼脂糖凝胶电泳分析，可见2条长度分别约4.0kb和2.5kb的dna片段，与pet28a(+)和vp2基因片段的理论值相符合。

2.1.3ibdvvp2基因在大肠杆菌中的表达

将重组质粒pet28-vp2(4-1350)转化e.colirosetta(de)3感受态细胞，涂布在用lb配制的1.5％琼脂平皿上，37℃培养14h，挑单菌落接种入lb，振摇培养14h。次日以1％的量分别接种lb培养基(含卡拉霉素100μg/ml)中，振荡培养，在a600值为0.8时，分别加入终浓度为1.0mm的iptg，分别诱导4h。取诱导的细菌培养物，5000g离心5min，用12％sds-page分析菌体中vp2片段的表达情况。试验同步设立pet28a(+)空质粒转化的e.colirosetta(de)3为对照。经12％sds-page电泳，在分子量约50kda处有一条目的蛋白带，而pet28a(+)转化的e.colirosetta(de3)则无50kda大小的蛋白带。

2.1.4westernblot分析ibdvvp2蛋白的表达水平

将诱导表达的3ml重组菌5000g离心10min，去除上清液，加入160μl去离子水重悬，再加入40μl5×sds-loadingbuffer，按常规方法进行12％分离胶和5％浓缩胶的sds-page电泳分析，转印到硝酸纤维素膜上，转印完毕后，将硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，然后用一抗(his单抗或鸡抗ibdv高免血清)、二抗(hrp标记的羊抗鼠igg抗体或hrp标记的兔抗鸡igg抗体)分别与之作用，dab底物显色，观察特异蛋白条带。试验同步设立空质粒pet28a(+)转化的e.colirosetta(de3)为对照。经12％sds-page电泳、转印和dab显色后，重组vp2蛋白可与his单抗或鸡抗ibdv高免血清在分子量约50kda处有一条目的蛋白带，而pet28a(+)转化的e.colirosetta(de3)则无50kda大小的蛋白带。

2.1.5ibdvvp2蛋白的纯化

取200ml诱导表达的培养物，离心收集细菌，用30ml结合缓冲液重悬，并加入20μl100mmol/lpmsf，冰浴条件下超声破碎至细胞悬液清亮，4℃，10000g离心30min去除细胞碎片，取上清用0.45μm孔径滤膜过滤，然后按照histraphp说明书纯化重组vp2蛋白片段。超声沉淀中含有大量的重组vp2蛋白，表明重组vp2蛋白主要以包涵体形式存在。

2.2hrp标记ibdvvp2基因单克隆抗体

2.2.1ibdvvp2基因单克隆抗体的制备

用纯化的ibdv免疫6～8周龄雌性balb/c小鼠，每隔14d免疫1次，第4次免疫后，无菌取免疫balb/c鼠脾细胞，与对数生长期的sp2/0细胞融合。以rvp2蛋白作为包被抗原，用间接elisa法测融合细胞的培养上清，筛选到了8株ibdvvp2单抗。选择阳性的杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆。将克隆化的阳性杂交瘤细胞扩大培养，腹腔注射入8～10周龄balb/c雌性小鼠制备腹水。

2.2.2辣根过氧化物酶(hrp)标记ibdvvp2单抗

取0.5ml腹水加入等量的pbs稀释，3000r/min，10min，取上清用0.45μm孔径滤膜过滤，然后按照hitrapproteinahp说明书纯化vp2单抗。用辣根过氧化物酶(hrp)将纯化的vp2单抗用高碘酸钠法进行标记^[1]。

[1]骆加理,沈炳贵,宋光承,陈彩云,薛海筹.辣根过氧化物酶(hrp)标记抗体的简易方法[j].生物化学与生物物理学报,1981(01):1-8.

2.2.3westernblot分析ibdvvp2单抗与rvp2的反应性

将pet28-vp2(4-1350)转化e.colirosetta(de)3和空质粒pet28a(+)转化的e.colirosetta(de3)进行诱导表达，sds-page电泳分析，转印到硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，然后以hrp-vp2单克隆抗体作为一抗，dab底物显色，观察特异蛋白条带。

经10％sds-page电泳、转印和dab显色后，hrp-vp2单抗可与原核表达的重组vp2蛋白在分子量约50kda处有一条目的蛋白带，而pet28a(+)转化的e.colirosetta(de3)则无蛋白带。经筛选细胞株1h6的hrp-vp2单抗可与原核表达的重组vp2蛋白在分子量约50kda处有一条目的蛋白带。

2.3ibdv抗体竞争elisa检测方法的建立

将纯化的rvp2重组蛋白用ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5μg/l，加入到酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜，用封闭液(含10％fbs的pbst)满孔封闭，37℃，2h，pbst洗涤3次，每次3min，拍干；加入1:500稀释的临床样本50μl/孔(96份)，同时加入hrp-vp2单抗50μl/孔(hrp-vp2单抗1:20000稀释)，37℃，1h，pbst洗涤5次，每次3min，拍干；加入tmb显色剂100μl/孔，暗盒显色；2mh2so4终止，测a450值，判定结果。判定标准：pi＝100-样品od值/阴性平均od值x100，当pi＞50时，判为阳性；当pi≤50时，判为阴性。

2.4ibdv抗体竞争elisa检测方法的初步应用

2.4.1竞争elisa

将纯化的rvp2重组蛋白用ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5μg/l，加入到酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜，用封闭液(含10％fbs的pbst)满孔封闭，37℃，2h，pbst洗涤3次，每次3min，拍干；加入1:500稀释的临床样本50μl/孔(96份)，同时加入hrp-vp2单抗50μl/孔(hrp-vp2单抗1:20000稀释)，37℃，1h，pbst洗涤5次，每次3min，拍干；加入tmb显色剂100μl/孔，暗盒显色；2mh2so4终止，测a450值，判定结果。同时用idexxibdv抗体间接elisa试剂盒检测临床样品，作为商品化对照组。

2.4.2中和试验

将96份临床样本分别从1∶2开始进行2倍比连续稀释，稀释到1:64；各取100μl，分别与等体积的ibdvb87细胞适应毒稀释物(病毒含量200tcid50/0.1ml)混合，置37℃反应1h，接种于含有df-1单层的96孔培养板中，100μl/孔(病毒含量100tcid50/孔)，每份待检血清设4个重复；同时设立病毒对照、阳性血清对照、阴性血清对照、细胞对照。置37℃、5％co2培养，每天观察病变，记录结果，按reed-muench法计算出每个血清样品的病毒中和抗体效价，根据国标gb/t19167-2003，中和效价>1:32则判断为阳性，反之则判断为阴性。

用重组vp2蛋白建立的ibdv抗体竞争elisa、idexx-elisa(ibdv)及中和试验同时检测96份临床样本，结果：重组vp2蛋白建立的ibdv抗体celisa检测方法、idexx-elisa(ibdv)与中和试验比较，相对敏感性分别为94.12％和100％；相对特异性分别为95.16％和25.8％；符合率分别为94.79％和52.08％。具体结果如下(表1和表2)。

表1rvp2-celisa与中和试验的比较

相对敏感性：32/34×100％＝94.12％；

相对特异性：59/62×100％＝95.16％；

符合率：(32+59)/96×100％＝94.79％

表2idexx-elisa与中和试验的比较

相对敏感性：34/34×100％＝100％；

相对特异性：16/62×100％＝25.8％；

符合率：(34+16)/96×100％＝52.08％