一种诺如病毒GI型GII型联合检测试剂及其制备方法与流程

本发明涉及诺如病毒检测技术领域，具体为一种诺如病毒gi型gii型联合检测试剂及其制备方法。

背景技术：

诺如病毒，又称诺瓦克病毒是人类杯状病毒科中诺如病毒属的一种病毒，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒，诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发，发达国家每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60—90％是由诺如病毒引起，许多发达国家也都有类似结果，在我国五岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明我国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍，诺如病毒感染性腹泻属于自限性疾病，没有疫苗和特效药物，公众搞好个人卫生、食品卫生和饮水卫生、避免交叉污染是预防本病的关键，科学家在发达国家暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离出一种病毒病原，此后，世界各地陆续自胃肠炎患者粪便中分离出多种形态与之相似但抗原性略异的病毒样颗粒，先被称为小圆结构病毒，后称为诺瓦克样病毒，我国报道了首例诺如病毒感染，之后全国各地先后发生多起诺如病毒感染性腹泻暴发疫情，第八届国际病毒命名委员会批准该病毒名称为诺如病毒，诺如病毒分六个基因组(gⅰ—gvi)，其中只有gⅰ、gⅱ和gⅳ可以感染人，gⅳ中的gⅳ.1感染人，gⅳ.2感染猫和狗，而gⅲ、gⅴ、gvi分别感染牛、鼠和狗，我国目前最常见的诺如病毒为gⅱ、gⅰ型，诺如病毒传播途径包括人传人、经食物和经水传播，人传人可通过粪口途径(包括摄入粪便或呕吐物产生的气溶胶)、或间接接触被排泄物污染的环境而传播，食源性传播是通过食用被诺如病毒污染的食物进行传播，污染环节可出现在感染诺如病毒的餐饮从业人员在备餐和供餐中污染食物，也可出现食物在生产、运输和分发过程中被含有诺如病毒的人类排泄物或其它物质(如水等)所污染。

目前诺如病毒的主要检测技术有三类：电镜法，核酸检测(pcr)和抗原检测三类方法，其中电镜法的优点是快速简便直接，但其缺点是诺如病毒缺乏典型杯状病毒特征，不易观察，且需要病毒浓度达到一定程度才能观察到，并且电镜价格昂贵，技术要求高，不适合大规模流行病学调查，核酸检测程序繁琐，标本预处理工序多，受引物设计，核酸纯化，反应条件等限制，仅限于实验室操作，易受到实验室污染而出现假阳，必须在独立的空间进行样品处理和检验，抗原检测法，反应特异性强，方便快速，目前尚未发现盖病毒抗体与其他病毒之间存在交叉反应，但由于诺如病毒变异性强，一种遗传组型抗体不能识别其他遗传组型抗原。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种诺如病毒gi型gii型联合检测试剂及其制备方法，具备检测速度快，样本处理流程简单，操作方便而且灵敏度高的诺如病毒检测试剂条，能同时检测引起人类急性肠胃炎的两个主要基因群的诺如病毒的优点，以解决背景技术中所提出的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种诺如病毒gi型gii型联合检测装置，包括pvc底板，所述pvc底板顶部的左侧粘合连接有样品垫，所述pvc底板顶部的左侧并位于样品垫的右侧粘合连接有胶体金标记垫，所述胶体金标记垫顶部的左侧与样品垫底部的右侧粘合连接，所述pvc底板顶部的中心处粘合连接有nc膜，所述nc膜顶部的左侧与胶体金标记垫底部的右侧粘合连接，所述nc膜的顶部从左至右依次设置有gi检测线、gii检测线和质控线，所述gii检测线的左侧位于gi检测线的右侧，所述质控线的左侧位于gii检测线的右侧，所述pvc底板顶部的右侧粘合连接有吸水垫，所述吸水垫底部的左侧与nc膜顶部的右侧粘合连接。

优选的，所述胶体金标记垫上标记有鼠抗诺如病毒gi型单克隆抗体1和鼠抗诺如病毒gii型单克隆抗体2。

优选的，所述gi检测线和gii检测线的左侧均靠近胶体金标记垫的右侧，所述质控线的右侧靠近吸水垫的左侧。

优选的，所述nc膜的材质为硝酸纤维素膜，所述胶体金标记垫的材质为聚酯膜，所述样品垫的材质为聚酯膜或玻璃纤维素膜。

优选的，一种诺如病毒gi型gii型联合检测试剂制备方法，其制备方法包括以下步骤：

a、制备样品垫：将所述样品垫置于样品垫处理液中浸泡，然后将含有样品垫处理液的所述样品垫置于温度为18—24℃、相对湿度小于40％的环境中烘干16—24h，备用；其中，样品垫处理液为含0.5％吐温-20、1％bsa的ph为8.0的1mol/l磷酸盐缓冲液或tris—hcl缓冲液；

b、制备胶体金标记垫：a、胶体金溶液制备：用量筒量取980ml工艺用水到烧瓶中，加入制备量1％氯化金溶液，边搅拌，边加热至沸腾，一边搅拌，迅速加入制备量1％柠檬酸三钠溶液，颜色变成橙红色后，继续煮沸15分钟，关闭搅拌器，让胶体金溶液自然冷却，用工艺用水将胶体金溶液定容至1000ml，b、抗体标记及胶体金标记垫制备：最佳ph值的确定：取320ml上述胶体金溶液，取用0.1m的碳酸钾溶液调整胶体金溶液的ph值至合适ph值，将溶液放到磁力搅拌器上，调整转速为250rpm，搅拌状态下，加入所需量鼠抗诺如病毒gi型单克隆抗体1和鼠抗诺如病毒gii型单克隆抗体2，这两种抗体在此时溶液中的浓度控制在8—10ug/ml，静止15分钟后加入10％bsa，使bsa终浓度为0.1％，和0.32ml的1％geg20000，继续搅拌10分钟，离心：将标记好的溶液转移到离心管中，天平上调整平衡，2—8℃，10000rpm，离心30分钟，心吸出上清，收集沉淀，用金标结合物稀释液定容到原胶体金溶液体积的10％，涂布：取聚酯无纺布，设定涂布量为6—8ul/cm，干燥温度37℃，相对湿度≤40％，转动速度1.5米/分，将涂布好的胶体金转移到干燥间，干燥温度为37℃，干燥湿度为≤40％，时间16—24小时，胶体金垫干燥后，铝箔袋封存备用；

c、制备检测垫：按照配方要求配置好质控线c和gi检测线与gii检测线的抗体溶液，取nc膜(规格宽度25mm)，按照距离间隔一次性划出所述诺如病毒gi型gi检测线、所述诺如病毒gii型gii检测线和所述质控线c线，所述诺如病毒gi型gi检测线包被有鼠抗诺如病毒gi型单克隆抗体3，所述诺如病毒gii型gii检测线包被有鼠抗诺如病毒gii型单克隆抗体4，质控线(c线)处包被有羊抗鼠igg多克隆抗体，距离间隔设定如下：gi检测线离nc膜的底端距离为7mm，gii检测线离nc膜的底端距离为12mm，质控线离nc膜的底端距离为17mm，设定干燥温度为37℃，相对湿度≤40％的环境下干燥，时间16—24小时，包被好的nc膜经干燥塔干燥后，卷好备用；

d、贴板及切割：将所述样品垫、所述标记垫、所述检测垫、所述吸水垫顺序搭接所述pvc底板上，并按照规格要求切割成宽度3.3mm(条型)和4.0mm(卡型)，检查内包间温湿度，确保温度是18—24℃，湿度：≤40％才能开始工作，在台面上展开pvc板，两端粘在操作台上，撕掉中间部分宽度为25mm的离层纸，将划线nc膜对准直线贴在撕开离层纸的地方，再撕开pvc板下边的保护纸，将胶体金黏贴在pvc板上，让胶体金的上边缘与划线nc膜的下边缘重叠1.0—2.0毫米，将样品垫粘贴在胶体金的下方，让样品垫的上边缘与胶体金的下边缘重叠1.0—2.0毫米，撕开pvc板上边的离层纸，将吸水纸直线黏贴到pvc板上，让吸水纸与划线nc膜的上边缘重叠2毫米左右，贴透明胶带，让透明胶带完全覆盖胶体金垫，操作自动斩切机，按要求的宽度切割。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种诺如病毒gi型gii型联合检测试剂及其制备方法，具备以下有益效果：

1、本发明同时提供一种工艺简单、重复性好、成品结构稳定，使用性能佳的诺如病毒gi型/gii型联合检测试剂的其制备方法，由于能同时检查两种基因型(gi型/gii型)的诺如病毒，可以大大提高检出率，并且能对其进行分型，非常适合医院及防控单位的要求，来解决临床散发病例或疫情爆发时的诺如病毒感染患者的快速筛查和诊断。

2、通过流行病学调查：导致腹泻的原因很多，在流行病学调查时，通常需要首先确定是细菌还是病毒感染导致，本发明的试纸条可以联合检测粪便中的诺如病毒gi和gii亚型，防止分类错误，对治疗和用药给出诊断依据，同时诺如病毒感染呈散发和爆发两种形式，此试纸条在可快速对样本进行检测和分析的基础上，综合分析，区分散发和爆发。

3、通过疫情监测：及时发现疫情是采取有效防治措施的基础，病原学检测能为疫情防控提供重要的科学依据，此试剂盒能提供一种快速检测方法，供散发或爆发疫情的筛查。

4、通过对导致人体感染的诺如病毒主要亚型gi和gii联检，一次加样，可以同时获得两个结果，联合检测可以提高检出率。

5、本发明的所述诺如病毒gi型/gii型联合检测试纸，灵敏度高、特异性强，而且速度快(5—10分钟)、操作简便(样本前处理过程简单)，重复性好，而且用该方法制备的检测试纸条结构稳定，使用性能好无需专门设施，适用于临床检测或普查等多种场合。

附图说明

图1为本发明结构立体图。

图中：1、pvc底板；2、样品垫；3、胶体金标记垫；4、nc膜；5、gi检测线；6、gii检测线；7、质控线；8、吸水垫。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的所有部件均为通用的标准部件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本领域技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。

请参阅图1，一种诺如病毒gi型gii型联合检测装置，包括pvc底板1，pvc底板1顶部的左侧粘合连接有样品垫2，pvc底板1顶部的左侧并位于样品垫2的右侧粘合连接有胶体金标记垫3，胶体金标记垫3顶部的左侧与样品垫2底部的右侧粘合连接，pvc底板1顶部的中心处粘合连接有nc膜4，nc膜4顶部的左侧与胶体金标记垫3底部的右侧粘合连接，nc膜4的顶部从左至右依次设置有gi检测线5、gii检测线6和质控线7，gii检测线6的左侧位于gi检测线5的右侧，质控线7的左侧位于gii检测线6的右侧，pvc底板1顶部的右侧粘合连接有吸水垫8，吸水垫8底部的左侧与nc膜4顶部的右侧粘合连接，胶体金标记垫3上标记有鼠抗诺如病毒gi型单克隆抗体1和鼠抗诺如病毒gii型单克隆抗体2，gi检测线5和gii检测线6的左侧均靠近胶体金标记垫3的右侧，质控线7的右侧靠近吸水垫8的左侧，nc膜4的材质为硝酸纤维素膜，胶体金标记垫3的材质为聚酯膜，样品垫2的材质为聚酯膜或玻璃纤维素膜，本发明同时提供一种工艺简单、重复性好、成品结构稳定，使用性能佳的诺如病毒gi型/gii型联合检测试剂的其制备方法，由于能同时检查两种基因型gi型/gii型的诺如病毒，可以大大提高检出率，并且能对其进行分型，非常适合医院及防控单位的要求，来解决临床散发病例或疫情爆发时的诺如病毒感染患者的快速筛查和诊断。

一种诺如病毒gi型gii型联合检测试剂制备方法，其制备方法包括以下步骤：

a、制备样品垫2：将样品垫2置于样品垫2处理液中浸泡，然后将含有样品垫2处理液的样品垫2置于温度为18—24℃、相对湿度小于40％的环境中烘干16—24h，备用；其中，样品垫2处理液为含0.5％吐温-20、1％bsa的ph为8.0的1mol/l磷酸盐缓冲液或tris—hcl缓冲液；

b、制备胶体金标记垫3：a、胶体金溶液制备：用量筒量取980ml工艺用水到烧瓶中，加入制备量1％氯化金溶液，边搅拌，边加热至沸腾，一边搅拌，迅速加入制备量1％柠檬酸三钠溶液，颜色变成橙红色后，继续煮沸15分钟，关闭搅拌器，让胶体金溶液自然冷却，用工艺用水将胶体金溶液定容至1000ml，b、抗体标记及胶体金标记垫3制备：最佳ph值的确定：取320ml上述胶体金溶液，取用0.1m的碳酸钾溶液调整胶体金溶液的ph值至合适ph值，将溶液放到磁力搅拌器上，调整转速为250rpm，搅拌状态下，加入所需量鼠抗诺如病毒gi型单克隆抗体1和鼠抗诺如病毒gii型单克隆抗体2，这两种抗体在此时溶液中的浓度控制在8—10ug/ml，静止15分钟后加入10％bsa，使bsa终浓度为0.1％，和0.32ml的1％geg20000，继续搅拌10分钟，离心：将标记好的溶液转移到离心管中，天平上调整平衡，2—8℃，10000rpm，离心30分钟，心吸出上清，收集沉淀，用金标结合物稀释液定容到原胶体金溶液体积的10％，涂布：取聚酯无纺布，设定涂布量为6—8ul/cm，干燥温度37℃，相对湿度≤40％，转动速度1.5米/分，将涂布好的胶体金转移到干燥间，干燥温度为37℃，干燥湿度为≤40％，时间16—24小时，胶体金垫干燥后，铝箔袋封存备用；

c、制备检测垫：按照配方要求配置好质控线7c和gi检测线5与gii检测线6的抗体溶液，取nc膜4规格宽度25mm，按照距离间隔一次性划出诺如病毒gi型gi检测线5、诺如病毒gii型gii检测线6和质控线7c线，诺如病毒gi型gi检测线5包被有鼠抗诺如病毒gi型单克隆抗体3，诺如病毒gii型gii检测线6包被有鼠抗诺如病毒gii型单克隆抗体4，质控线7c线处包被有羊抗鼠igg多克隆抗体，距离间隔设定如下：gi检测线5离nc膜4的底端距离为7mm，gii检测线6离nc膜4的底端距离为12mm，质控线7离nc膜4的底端距离为17mm，设定干燥温度为37℃，相对湿度≤40％的环境下干燥，时间16—24小时，包被好的nc膜4经干燥塔干燥后，卷好备用；

d、贴板及切割：将样品垫2、标记垫、检测垫、吸水垫8顺序搭接pvc底板1上，并按照规格要求切割成宽度3.3mm条型和4.0mm卡型，检查内包间温湿度，确保温度是18—24℃，湿度：≤40％才能开始工作，在台面上展开pvc板，两端粘在操作台上，撕掉中间部分宽度为25mm的离层纸，将划线nc膜4对准直线贴在撕开离层纸的地方，再撕开pvc板下边的保护纸，将胶体金黏贴在pvc板上，让胶体金的上边缘与划线nc膜4的下边缘重叠1.0—2.0毫米，将样品垫2粘贴在胶体金的下方，让样品垫2的上边缘与胶体金的下边缘重叠1.0—2.0毫米，撕开pvc板上边的离层纸，将吸水纸直线黏贴到pvc板上，让吸水纸与划线nc膜4的上边缘重叠2毫米左右，贴透明胶带，让透明胶带完全覆盖胶体金垫，操作自动斩切机，按要求的宽度切割。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。