一种眼干症双联快速检测试剂及其制备方法与流程

本发明涉及医疗检测技术领域，具体为一种眼干症双联快速检测试剂及其制备方法。

背景技术：

泪液不仅有消毒杀菌的作用，它还可在眼球的表面形成泪膜，有润滑和使角膜光滑透亮、保持角膜屈光系统的重要功能，如果泪液分泌太少，角膜就得不到滋润，整个眼球干燥无光，即形成眼干症，眼干症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和/或眼表组织病变特征的多种疾病的总称，又称角结膜干燥症，常见症状包括眼睛干涩、容易疲倦、眼痒、有异物感、痛灼热感、分泌物黏稠、怕风、畏光、对外界刺激很敏感。

现有的检测方法过多依赖于检验人员的经验，不利于作出数据判断，根据《干眼临床诊断专家共识》-2013及《欧洲严重干眼诊断共识》，均表明眼干症患者与其泪液中乳铁蛋白含量及mmp9含量相关。

临床上眼干症的主要检查方法有泪液分泌实验、泪膜破裂时间、泪液蕨类试验、角结膜上皮染色、印迹细胞学检查、溶菌酶含量、乳铁蛋白含量等，其中，前两项检测是比较快速简便的方法，也是临床上最常用的检测方法，但这两种方法也有各自的缺点，泪液分泌实验将测试滤纸放入眼内穹窿部，难以避免一些外界的因素刺激，泪液分泌量不稳定，重复性差，由此判断干眼的标准很难确定，增加测试的特异性，敏感度就会降低，泪膜破裂时间敏感度很高，但它的特异性较低，因此，泪膜破裂时间也只作为诊断干眼的参考，为此，我们提出一种眼干症双联快速检测试剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种眼干症双联快速检测试剂及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种眼干症双联快速检测试剂，包括pvc底板，所述pvc底板的顶部从左到右依次设置有样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫，且硝酸纤维素膜检测垫的内表面从左到右依次设置有乳铁蛋白检测线、mmp9检测线和质控线，所述胶体金标记垫的左侧位于样品垫的内侧，且硝酸纤维素膜检测垫的左侧位于胶体金标记垫的内侧，硝酸纤维素膜检测垫的右侧位于吸水垫的内侧。

优选的，所述胶体金标记垫的材质为聚酯膜，样品垫材质为聚酯膜或玻璃纤维素膜。

一种眼干症双联快速检测试剂的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

a、制备样品垫：将样品垫置于处理液中浸泡，然后将含有处理液的样品垫置于温度为18-24℃、相对湿度小于40％的环境中烘干16-24h，备用；

b、制备胶体金标记垫：胶体金溶液、抗体标记及胶体金标记垫制备；

c、制备硝酸纤维素膜检测垫：①、按照配方要求配置好质控线、乳铁蛋白检测线和mmp9检测线的抗体溶液，且最终抗体溶液浓度为1.0-1.2mg/ml；②取硝酸纤维素膜(规格宽度25mm)，按照距离间隔一次性划出乳铁蛋白检测线、mmp9检测线和质控线，划膜时，抗体溶液的消耗量设定为1.0-1.2ul/cm，乳铁蛋白检测线包被有鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体3，mmp9检测线包被有鼠抗mmp9单克隆抗体4，质控线包被有羊抗鼠igg多克隆抗体；

d、贴板及切割：将样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫顺序搭接pvc底板上，并按照规格要求切割成宽度3.3mm(条型)和4mm(卡型)。

优选的，所述步骤a中，处理液为样品垫处理液，且处理液由0.5％吐温-20、1％bsa的ph为8.0的1mol/l磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液组成。

优选的，所述步骤b中，胶体金溶液的制备方法(以制备1000ml为例)包括以下步骤：①、用量筒量取980ml工艺用水到烧瓶中；②、加入制备量1％氯化金溶液，边搅拌边加热至沸腾；③、在搅拌过程中，迅速加入制备量1％柠檬酸三钠溶液；④、颜色变成橙红色后，继续煮沸15min；⑤、关闭搅拌器，让胶体金溶液自然冷却，用工艺用水将胶体金溶液定容至1000ml。

优选的，所述步骤b中，抗体标记及胶体金标记垫的制备方法(以制备40米胶体金标记垫为例)包括以下步骤：①、最佳ph值的确定：取320ml胶体金溶液，取用0.1m的碳酸钾溶液调整胶体金溶液的ph值至合适ph值；②、将溶液放到磁力搅拌器上，调整转速为250rpm；③搅拌状态下，加入所需量鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体1和鼠抗mmp9单克隆抗体2，这两种抗体在此溶液中的浓度控制在8-10ug/ml；④、静置15min后加入10％bsa，使bsa终浓度为0.1％，加入0.32ml的1％peg20000，继续搅拌10min；⑤、离心：将标记好的溶液转移到离心管中，天平上调整平衡，并控制温度为2-8℃，转速为10000rpm，离心时间为30min；⑥、小心吸出上清，收集沉淀，用金标结合物稀释液定容到原胶体金溶液体积的10％；⑦、涂布：取聚酯无纺布，设定涂布量为6-8ul/cm，干燥温度为37℃，相对湿度≤40％，转动速度1.5m/min，将涂布好的胶体金标记垫转移到干燥间；⑧、干燥温度为37℃，干燥湿度≤40％，干燥时间为16-24h；⑨、胶体金标记垫干燥后，用铝箔袋封存备用。

优选的，所述步骤b中的胶体金标记垫制备完成后，在其表面上标记有鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体1和鼠抗mmp9单克隆抗体2。

优选的，所述步骤c中还包括③、距离间隔设定：乳铁蛋白检测线离硝酸纤维素膜检测垫的底端距离为7mm，mmp9检测线离硝酸纤维素膜检测垫的底端距离为12mm，质控线离硝酸纤维素膜检测垫的底端距离为17mm；④、设定干燥温度为37℃，相对湿度≤40％的环境下干燥，干燥时间为16-24h；⑤、包被好的硝酸纤维素膜检测垫经干燥塔干燥后，卷好备用。

优选的，所述步骤d中还包括①、检查内包间温湿度，确保温度为18-24℃，湿度≤40％才能开始工作；②、在台面上展开pvc底板，两端粘在操作台上，撕掉中间部分宽度为25mm的离层纸；③、将硝酸纤维素膜检测垫对准直线贴在撕开离层纸的地方；④、再撕开pvc底板下边的保护纸，将胶体金标记垫黏贴在pvc底板上，让胶体金标记垫的上边缘与硝酸纤维素膜检测垫的下边缘重叠1-2mm，将样品垫粘贴在胶体金标记垫的下方，让样品垫的上边缘与胶体金标记垫的下边缘重叠1-2mm；⑤、撕开pvc底板上边的离层纸，将吸水垫直线黏贴到pvc底板上，让吸水垫与硝酸纤维素膜检测垫的上边缘重叠2mm左右；⑥、贴透明胶带，让透明胶带完全覆盖胶体金标记垫；⑦、操作自动斩切机，按要求的宽度切割。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过检测泪液中的乳铁蛋白和mmp9的含量，当出现乳铁蛋白阴性或mmp9阳性时，提示患者眼干症的可能，当乳铁蛋白检测阳性，提示患者泪腺功能正常，当mmp9阳性，提示患者眼部存在感染，以便将眼干症患者同其他早期眼疾患者区分，避免误诊，其泪液采取方便、工艺简单、重复性好、成品结构稳定、使用性能佳，且其能同时检查两种与眼干症相关的蛋白或酶，提高诊断效率、减少人工、检测速度快、灵敏度高、对患者基本没有任何伤害、耐受性好，非常适合医院来解决临床眼干症患者检测和诊断难题。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

图中：1pvc底板、2样品垫、3胶体金标记垫、4硝酸纤维素膜检测垫、5质控线、6吸水垫、7mmp9检测线、8乳铁蛋白检测线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。

本申请的pvc底板1、样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜检测垫4、质控线5、吸水垫6、mmp9检测线7和乳铁蛋白检测线8部件均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。

请参阅图1，一种眼干症双联快速检测试剂，包括pvc底板1，pvc底板1的顶部从左到右依次设置有样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜检测垫4和吸水垫6，胶体金标记垫3的材质为聚酯膜，样品垫2材质为聚酯膜或玻璃纤维素膜，且硝酸纤维素膜检测垫4的内表面从左到右依次设置有乳铁蛋白检测线8、mmp9检测线7和质控线5，胶体金标记垫3的左侧位于样品垫2的内侧，且硝酸纤维素膜检测垫4的左侧位于胶体金标记垫3的内侧，硝酸纤维素膜检测垫4的右侧位于吸水垫6的内侧，通过检测泪液中的乳铁蛋白和mmp9的含量，当出现乳铁蛋白阴性或mmp9阳性时，提示患者眼干症的可能，当乳铁蛋白检测阳性，提示患者泪腺功能正常，当mmp9阳性，提示患者眼部存在感染，以便将眼干症患者同其他早期眼疾患者区分，避免误诊，其泪液采取方便、工艺简单、重复性好、成品结构稳定、使用性能佳，且其能同时检查两种与眼干症相关的蛋白或酶，提高诊断效率、减少人工、检测速度快、灵敏度高、对患者基本没有任何伤害、耐受性好，非常适合医院来解决临床眼干症患者检测和诊断难题。

一种眼干症双联快速检测试剂的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

a、制备样品垫2：将样品垫2置于处理液中浸泡，然后将含有处理液的样品垫2置于温度为18-24℃、相对湿度小于40％的环境中烘干16-24h，备用；

b、制备胶体金标记垫3：胶体金溶液、抗体标记及胶体金标记垫3制备；

c、制备硝酸纤维素膜检测垫4：①、按照配方要求配置好质控线5、乳铁蛋白检测线8和mmp9检测线7的抗体溶液，且最终抗体溶液浓度为1.0-1.2mg/ml；②取硝酸纤维素膜(规格宽度25mm)，按照距离间隔一次性划出乳铁蛋白检测线8、mmp9检测线7和质控线5，划膜时，抗体溶液的消耗量设定为1.0-1.2ul/cm，乳铁蛋白检测线8包被有鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体3，mmp9检测线7包被有鼠抗mmp9单克隆抗体4，质控线5包被有羊抗鼠igg多克隆抗体；

d、贴板及切割：将样品垫2、胶体金标记垫3、硝酸纤维素膜检测垫4和吸水垫6顺序搭接pvc底板1上，并按照规格要求切割成宽度3.3mm(条型)和4mm(卡型)。

步骤a中，处理液为样品垫处理液，且处理液由0.5％吐温-20、1％bsa的ph为8.0的1mol/l磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液组成。

步骤b中，胶体金溶液的制备方法(以制备1000ml为例)包括以下步骤：①、用量筒量取980ml工艺用水到烧瓶中；②、加入制备量1％氯化金溶液，边搅拌边加热至沸腾；③、在搅拌过程中，迅速加入制备量1％柠檬酸三钠溶液；④、颜色变成橙红色后，继续煮沸15min；⑤、关闭搅拌器，让胶体金溶液自然冷却，用工艺用水将胶体金溶液定容至1000ml。

步骤b中，抗体标记及胶体金标记垫3的制备方法(以制备40米胶体金标记垫3为例)包括以下步骤：①、最佳ph值的确定：取320ml胶体金溶液，取用0.1m的碳酸钾溶液调整胶体金溶液的ph值至合适ph值；②、将溶液放到磁力搅拌器上，调整转速为250rpm；③搅拌状态下，加入所需量鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体1和鼠抗mmp9单克隆抗体2，这两种抗体在此溶液中的浓度控制在8-10ug/ml；④、静置15min后加入10％bsa，使bsa终浓度为0.1％，加入0.32ml的1％peg20000，继续搅拌10min；⑤、离心：将标记好的溶液转移到离心管中，天平上调整平衡，并控制温度为2-8℃，转速为10000rpm，离心时间为30min；⑥、小心吸出上清，收集沉淀，用金标结合物稀释液定容到原胶体金溶液体积的10％；⑦、涂布：取聚酯无纺布，设定涂布量为6-8ul/cm，干燥温度为37℃，相对湿度≤40％，转动速度1.5m/min，将涂布好的胶体金标记垫3转移到干燥间；⑧、干燥温度为37℃，干燥湿度≤40％，干燥时间为16-24h；⑨、胶体金标记垫3干燥后，用铝箔袋封存备用。

步骤b中的胶体金标记垫3制备完成后，在其表面上标记有鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体1和鼠抗mmp9单克隆抗体2。

步骤c中还包括③、距离间隔设定：乳铁蛋白检测线8离硝酸纤维素膜检测垫4的底端距离为7mm，mmp9检测线7离硝酸纤维素膜检测垫4的底端距离为12mm，质控线5离硝酸纤维素膜检测垫4的底端距离为17mm；④、设定干燥温度为37℃，相对湿度≤40％的环境下干燥，干燥时间为16-24h；⑤、包被好的硝酸纤维素膜检测垫4经干燥塔干燥后，卷好备用。

步骤d中还包括①、检查内包间温湿度，确保温度为18-24℃，湿度≤40％才能开始工作；②、在台面上展开pvc底板1，两端粘在操作台上，撕掉中间部分宽度为25mm的离层纸；③、将硝酸纤维素膜检测垫4对准直线贴在撕开离层纸的地方；④、再撕开pvc底板1下边的保护纸，将胶体金标记垫3黏贴在pvc底板1上，让胶体金标记垫3的上边缘与硝酸纤维素膜检测垫4的下边缘重叠1-2mm，将样品垫2粘贴在胶体金标记垫3的下方，让样品垫2的上边缘与胶体金标记垫3的下边缘重叠1-2mm；⑤、撕开pvc底板1上边的离层纸，将吸水垫6直线黏贴到pvc底板1上，让吸水垫6与硝酸纤维素膜检测垫4的上边缘重叠2mm左右；⑥、贴透明胶带，让透明胶带完全覆盖胶体金标记垫3；⑦、操作自动斩切机，按要求的宽度切割。

使用时，通过检测泪液中的乳铁蛋白和mmp9的含量，当出现乳铁蛋白阴性或mmp9阳性时，提示患者眼干症的可能，以便将眼干症患者同其他早期眼疾患者区分，避免误诊，其泪液采取方便、工艺简单、重复性好、成品结构稳定、使用性能佳，且其能同时检查两种与眼干症相关的蛋白或酶，提高诊断效率、减少人工、检测速度快、灵敏度高、对患者基本没有任何伤害、耐受性好，非常适合医院来解决临床眼干症患者检测和诊断难题。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。