一种用于前列腺炎检测的试剂盒的制作方法

本发明涉及医学检验领域，尤其是涉及一种用于前列腺炎检测的试剂盒的制备、使用方法及用途。
背景技术：
：慢性前列腺炎是成年男性泌尿、生殖系统疾病中最常见的一种，多发于青壮年、中年男性，青春期发病极少。有调查显示慢性前列腺炎占泌尿外科男性门诊就诊患者的25％左右，人群中有前列腺炎者超过10％，50％男性不同时期均患过前列腺炎。目前还没有诊断慢性前列腺炎的“金标准”，可用于临床研究的方法学的意义非常有限，仅有不到5％的临床医生采用寥寥无几的客观依据来诊断前列腺炎。尽管在疾病的早期可以通过临床症状而初步诊断，但须依据现代检查手段进行必要的检查，并排除其他的泌尿外科疾病与异常后才能够确定。所以，慢性前列腺炎往往是一种排除性或缺陷性诊断，分类诊断依据也是排除方法，即缺乏其他类型前列腺炎的阳性特点。实验室常用的检查方法主要为尿液分析、前列腺液检查、直肠指检，其中前列腺液检查、直肠指检对人体有侵袭性，有一定的痛苦，耗时时间长，人们普遍对此有抵触心理。因此市场需求一种无创稳定、简便快捷，同时又准确可靠的生物标记物和检测手段，作为慢性前列腺炎检测方法，用于人群筛选和临床检测，避免患者的侵入检查痛苦，提高患者的生活质量。前列腺小体是由人类前列腺上皮细胞分泌的一种亚细胞结构，含有440种蛋白质，具有多种功能。由于前列腺的排泄管开口于尿道前列腺部的后壁，并且许多前列腺腺泡直接开口于尿道，故前列腺小体容易进入尿液和前列腺液中，慢性前列腺炎中组织受到炎细胞的浸润，会释放出各种活性物质和趋化因子。研究发现慢性前列腺炎症患者尿液中前列腺小体外泌蛋白含量明显高于正常人尿液中含量，有显著性差异可以作为一个很好的前列腺特异性生物标记物。本发明相对于目前市场上已公开产品，具有操作简单使用方便的特点，节省了人力物力；同时出结果快(40min)，为检验人员节省了大量时间；试剂盒线性范围宽，hook风险小，更加适合临床上的应用。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于前列腺炎检测的试剂盒的制备、使用方法及用途。还试剂盒操作简便，检测速度快(40min即可出检测结果)，检测范围宽，hook风险小，更便于临床使用。本发明提供了一种试剂组合，其包括标记抗体混合液、磁珠混悬液和校准品；所述标记抗体混合液包括：0.1％～0.5％(w/v)示踪标记物标记的psep抗体、0.01mol/l～0.1mol/l缓冲液a、1‰～3‰(w/v)防腐剂a、1‰～3‰(w/v)稳定剂a和0.5‰～3‰(w/v)表面活性剂a；所述磁珠混悬液由活化的jsr疏水性磁珠、mes缓冲液、psep抗体、表面活性剂和封保液制得；其中，所述封保液包括：0.01mol/l～0.1mol/l缓冲液b、1‰～3‰(w/v)防腐剂b、1‰～3‰(w/v)牛血清白蛋白、5％～15％(w/v)甘油或蔗糖、和0.5‰～3‰(w/v)表面活性剂b；其中，所述缓冲液a、b独立地选自tris-nacl、bis-tris、pbs、mops、mes、taps中至少一种；所述防腐剂a、b独立地选自proclin300、mit、bro、ipbc、nan3中至少一种；所述稳定剂a选自酪蛋白、鱼明胶、牛血清白蛋白中至少一种；所述表面活性剂a、b独立地选自tween-20、tritonx-100、silwetl7600surfactant中至少一种。本发明中，磁珠混悬液和标记抗体溶液中均含有表面活性剂tritonx-100，有提高精密性，降低跳孔风险的作用。本发明中，所述标记抗体混合液由0.1％(w/v)示踪标记物标记的psep抗体、0.05mol/ltris-nacl、1‰(w/v)proclin300、1‰(w/v)酪蛋白、1％(w/v)牛血清白蛋白、和5‰(w/v)tritonx-100组成。本发明中，所述示踪标记物选自吖啶酯、辣根过氧化物酶、鲁米诺或其衍生物、异鲁米诺或其衍生物。本发明中，所述磁珠混悬液中，活化的jsr疏水性磁珠的制备包括：将粒径为100～200nm的jsr疏水性磁珠以含有tritonx-100的mes缓冲液洗涤5次后，以20mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐对磁微粒活化1小时，制得活化的jsr疏水性磁珠。所述的磁微粒为jsr疏水性磁珠，包被过程中添加有表面活性剂，增加了磁珠的分散性，降低了跳孔的风险。本发明中，所述磁珠混悬液的制备方法包括：以含有表面活性剂的mes缓冲液洗涤活化的jsr疏水性磁珠，然后与psep抗体混合，在表面活性剂存在条件下，室温震荡3h，以终止液终止反应后，再以封保液封闭三次，制得磁珠混悬液。一些实施例中，所述终止液为5％的乙醇胺。本发明中，所述封保液由0.05mol/ltris-nacl、1‰(w/v)proclin300、1％(w/v)牛血清白蛋白、5％(w/v)蔗糖和0.5‰(w/v)tritonx-100组成。本发明所述的试剂组合中还包括校准品，所述校准品包括：psep抗原、0.01mol/l～0.1mol/l缓冲液c、1‰～3‰(w/v)防腐剂c、1％(w/v)牛血清白蛋白和1‰～3‰(w/v)酪蛋白；其中，所述缓冲液c选自tris-nacl、bis-tris、pbs、mops、mes、taps中至少一种；所述防腐剂c选自proclin300、mit、bro、ipbc、nan3中至少一种。本发明中，所述校准品由psep抗原、0.05mol/ltris-nacl、1‰(w/v)proclin300和1‰(w/v)酪蛋白、1％的(w/v)牛血清白蛋白。本发明中，所述校准品为梯度浓度的校准品，主要包括不同浓度的psep抗原。具体的，所述校准品中，psep的浓度范围为0～20ng/ml。即包含多个不同特定pesp浓度的标准品。所述校准品中，必须包含pesp浓度为0的标准品。一些实施例中，校准品中设置有psep的浓度分别为0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、6ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的6份校准品。本发明的试剂组合在制备前列腺炎检测试剂盒中的应用。本发明中，所述前列腺炎检测监测慢性前列腺炎发生和/或病程进展。本发明还提供了一种试剂盒，其包含本发明所述的试剂组合。所述的试剂盒采用的是双抗体夹心法，拓宽了检测范围，更利于临床上的使用。所述的试剂盒采用的是磁微粒化学发光法，可搭配相应的全自动化学发光仪，使用方便，检测用时短。本发明所采用的试剂针对psep的磁微粒化学发光法检测进行筛选，采用本发明提供的试剂组合，能够获得更好的准确性、稳定性和灵敏度，且hook风险较低。更具体的，所述的试剂盒含有定标卡，仪器可通过定标卡自动获取测试所需的参数。本发明还提供了一种辅助前列腺炎诊断的方法，其以本发明提供的试剂组合检测尿液中psep含量，根据检测结果辅助判断是否患有前列腺炎。本发明提供的试剂组合能够用于前列腺炎标志物psep的双抗体夹心检测，配合autolumoa2000系列全自动化学发光测定仪，能够实现psep的自动化检测。该试剂组合至少存在以下优点之一：1、检测样本效率高，可节省大量时间以及人力；现有技术的检测时间至少需要3.5小时，而本申请的试剂只需要40分钟就实现对pesp的检测，效率得到了显著的提高。在环境稳定的条件下，本发明试剂的检测时间可缩短到20分钟，甚至20分钟以下。2、本发明提供的试剂线性良好，线性范围可达0.3～20pg/ml，检测阈值低，灵敏度更高。3、本发明提供的试剂精密性良好，每例样本用两种试剂盒连续检测20次，计算20次的变异不超过5％。4、本发明提供的试剂准确性较高，且本发明试剂盒检测高浓度的样本或抗原，未发生hook现象。附图说明图1是本发明试剂的线性范围考核；图2是本发明试剂与对照试剂盒的相关性对比；图3是本发明试剂的hook考核。具体实施方式本发明提供了一种用于前列腺炎检测的试剂盒的制备、使用方法及用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，psep抗原、包被抗体、标记抗体均来自于伊美诺公司。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1前列腺炎检测的试剂盒的制备及使用方法一、前列腺炎检测试剂盒的制备本发明试剂盒由标记抗体混合液、磁珠混悬液和校准品3个组分构成。(一)常规器材及试剂1、示踪物标记的抗体混合液(装于12ml磁珠瓶中)；2、磁珠混悬液(装于4ml磁珠瓶中)；3、试剂架(用于固定示踪标记物标记的抗体混合液、磁珠混悬液两个组分)；4、校准品(装于4ml的hdpe瓶中)；5、定标卡；(二)标记抗体缓冲液的选择及混合液的制备1.缓冲液的选择采用新鲜配制的6种缓冲体系的缓冲液(浓度为0.05mol/l)，添加0.1％(w/v)示踪标记物标记的psep抗体、1‰(w/v)proclin300，1‰(w/v)酪蛋白，0.5‰的tritonx-100，1％的牛血清白蛋白制成标记抗体混合液，检测校准品，校准品由psep抗原、0.05mol/ltris-nacl、1‰(w/v)proclin300和1‰(w/v)酪蛋白、1％的(w/v)牛血清白蛋白配制，校准品s0～s5中，psep的浓度依次为0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、6ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的6份校准品。配合的磁珠混悬液为：0.05mol/ltris-nacl、添加1‰(w/v)proclin300，1％(w/v)牛血清白蛋白，5％(w/v)蔗糖，0.5‰的表面活性剂tritonx-100，制成的封保液，封闭终止反应后的磁珠，制成的磁珠混悬液。结果如下表所示：表1标品荧光值样品名称tris-naclbis-trispbsmopsmestapss01280811291116338699811420272491s1488704492743537450653355695755543385s2234613922341132295036257259023927982384159s3141551631352397414588002143288511330322912990161s4449319804607549049956623459925944371133946871873s5186818090176703735198624820178514218171994628168500337s1/s0384446867注：表中s1/s0值表示检测的信噪比从表1中可以看出缓冲液为tris-nacl、bis-tris和pbs的标记抗体混合液本底都比较好，缓冲液为mops、mes、taps的稀释液本底较差。2、方法同上，分别采用tris-nacl、bis-tris和pbs缓冲体系的稀释液，各试剂在37℃条件下放置10天(热10天)，与4℃放置10天的试剂作为对照。以s0～s1以及五份来自临床的样品(p1～p5)考核试剂的稳定性，考核结果如下表：表2样品荧光值注：表中s0为浓度为0的标品的荧光值；s1为浓度为0.5ng/ml的标品的荧光值；p1～5为对临床样品检测的的荧光值；s1/s0值表示检测的信噪比；av表示比值的平均值。从上表可以看出bis-tris缓冲的稀释液在放置稳定性不满足要求，pbs缓冲的稀释液热加速后本底升高了，因此采用tris-nacl缓冲液的标记抗体混合液。优选的，标记抗体混合液的制备方法为：1、配制：0.05m的tris-nacl缓冲液，添加1‰(w/v)proclin300，1‰(w/v)酪蛋白，0.5‰的tritonx-100，1％的牛血清白蛋白，制得溶液。将辣根过氧化物酶标记的psep抗体，以如上配制的溶液按照0.1％的比例稀释，得到标记抗体混合液备用。(三)磁微粒混悬液的制备1、封保液的选择与制备采用新鲜配制的6种缓冲体系的缓冲液(浓度为0.05mol/l)，添加1‰(w/v)proclin300，1％(w/v)牛血清白蛋白，5％(w/v)蔗糖，0.5‰的表面活性剂tritonx-100，制成封保液，用来封闭终止反应后的磁珠。校准品由psep抗原、0.05mol/ltris-nacl、1‰(w/v)proclin300和1‰(w/v)酪蛋白、1％的(w/v)牛血清白蛋白配制，校准品s0～s5中，psep的浓度依次为0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、6ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的6份校准品。磁珠混悬液的制备方法为：将终止反应后的磁珠用封保液封闭三次，最后以封保液将磁珠混匀，制成50测试/ml的磁珠混悬液。采用的抗体标记混合液由：0.1％(w/v)辣根过氧化物酶标记的psep抗体，0.05m的tris-nacl缓冲液，1‰(w/v)proclin300，1‰(w/v)酪蛋白，0.5‰的tritonx-100，1％(w/v)的牛血清白蛋白组成。检测结果如下表所示：表3校准品的荧光值tris-naclbis-trispbsmopsmestapss01216712902101529967911851559123s1490158493967551157609860612282473438s2237504423021762565312257206925777652452702s3138513441356427313967674144468631425669913752346s4439262194308338147559871451738494166875642553131s5183930739187781724198705825186131175172124767155762097s1/s0403854658从表3中可以看出缓冲液为tris-nacl、bis-tris和pbs为缓冲液的磁珠混悬液的本底都比较好，缓冲液为mops、mes、taps的稀释液本底较差。2、方法同上，分别采用tris-nacl、bis-tris和pbs缓冲体系的稀释液在37℃条件下放置10天(热10天)，与4℃放置10天的试剂作为对照。以s0～s1以及五份来自临床的样品(p1～p5)考核试剂的稳定性，考核结果如下表：表4样品荧光值注：表中s0为浓度为0的标品的荧光值；s1为浓度为0.5ng/ml的标品的荧光值；p1～5为对临床样品检测的的荧光值；s1/s0值表示检测的信噪比；av表示比值的平均值。从上表可以看出bis-tris缓冲的稀释液稳定性不满足要求，pbs缓冲的稀释液热加速后本底上升了，因此选择tris-nacl缓冲液制备封保液获得的磁微粒混悬液。3、包被浓度的选择采用如上封保液方法，分别按照0.3μg/t、0.4μg/t、0.5μg/t、0.7μg/t的包被浓度对磁珠进行包被，并对包被好的磁珠进行效价检测，表中样品1～10为来自临床的样品。结果如下表：表5包被浓度从表中可以看出，包被浓度为0.5μg/t时达到饱和，因此选择0.5μg/t的包被浓度。4、表面活性剂的选择采用的抗体标记混合液由：0.1％(w/v)辣根过氧化物酶标记的psep抗体，0.05m的tris-nacl缓冲液，1‰(w/v)proclin300，1‰(w/v)酪蛋白，0.5‰的表面活性剂，1％(w/v)的牛血清白蛋白组成。采用的封保液由0.05m的tris-nacl缓冲缓冲液，添加1‰(w/v)的proclin300，1％(w/v)牛血清白蛋白，5％(w/v)蔗糖，0.5‰的表面活性剂组成。抗体标记混合液和封保液中的表面活性剂分别为tritonx100、silwetl7600surfactant或tween-20，另设置不含表面活性剂的试剂盒作为对照。一次检测中，封保液与抗体标记混合液中选择的表面活性剂抑制。检测样品为高低两例临床样本，每例样本连续检测20次，计算20次的变异，检测结果如表6所示：表6试剂盒精密性由表4可以看出，含有表面活性剂的试剂盒的精密性明显要优于不含有表面活性剂试剂盒的精密性，含tritonx-100表面活性剂的稍优于其他两种表面活性剂。因此，筛选获得的磁微粒混悬液的制备方法为：①取0.05mtris-nacl缓冲缓冲液，添加1‰(w/v)的防腐剂proclin300，1％(w/v)牛血清白蛋白，5％(w/v)蔗糖，0.5‰的表面活性剂tritonx-100，制得封保液。②取60μl的jsr疏水性磁珠原液(粒径为100～200nm)，用mes缓冲液洗涤5次，洗涤过程中加tritonx-100；③用20mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐对磁微粒活化1小时；④用ph4～5的mes缓冲液将活化后的磁微粒洗涤2次，洗涤过程中加tritonx-100；⑤按照0.5μg/t的量将psep抗体加入到洗涤后的磁微粒中，再加入0.5‰的tritonx-100，室温震荡3h进行包被；⑥加入5％乙醇胺，终止半小时；⑦用封保液封闭3次，按照50t/ml的量分装待用；(四)校准品的制备取浓度为0.05m的缓冲液tris-nacl、bis-tris、pbs、mops、mes或taps中的一种，添加1‰(w/v)的proclin300，1‰(w/v)酪蛋白，1％的(w/v)牛血清白蛋白。将psep抗原按照一定的比例添加到校准品稀释液中，制成浓度分别为0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、6ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的校准品，分装待用。前述验证过程中，校准品由psep抗原、0.05mol/ltris-nacl、1‰(w/v)proclin300和1‰(w/v)酪蛋白、1％的(w/v)牛血清白蛋白配制，校准品s0～s5中，psep的浓度依次为0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、6ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的6份校准品。二、步骤一制备的检测前列腺炎试剂盒的使用方法(一)试剂包装载试剂包首次上机前，轻轻地倒转试剂包多次以混合新试剂包内的成分，避免产生气泡。不要倒转已经打开的试剂包。(二)定标1、仪器通过扫描试剂包条码自动获取测试所需的参数。2、将校准品转移至样本容器，放置在仪器配套样本架中，在仪器软件界面中输入定标信息选择“运行”开始测试，生成定标曲线。(三)测试准备测试样本正确放置后，点击启动按钮进行样本检测程序，仪器将执行检测操作(每个样本加样量为50ul，示踪物标记的抗体混合液加样量为100ul，温育30分钟)。(四)结果计算本试剂盒采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为x轴，以校准品发光值的log值为y轴建立定标曲线，根据待测样本的发光值回算相应的浓度值。仪器自动操作系统可通过存储的定标曲线以及样本测试得到的发光值自动计算样本测试结果。(五)参考区间本试剂盒参考区间为≤1.5ng/ml(检测500例正常人群样本，采用百分位数法确定参考区间，95％正常人群的psep测定值≤1.5ng/ml)。建议各实验室根据自己实际条件及接触人群建立正常参考区间。实施例2试剂载机稳定性考核(试剂拆开后稳定性)取一套制备好的试剂，配方如下1)、标记抗体混合液的制备方法为：1、配制：0.05m的tris-nacl缓冲液，添加1‰(w/v)proclin300，1‰(w/v)酪蛋白，0.5‰的tritonx-100，1％的牛血清白蛋白，制得溶液。将辣根过氧化物酶标记的psep抗体，以如上配制的溶液按照0.1％的比例稀释，得到标记抗体混合液备用。2)、磁微粒混悬液的制备方法为：①取0.05mtris-nacl缓冲缓冲液，添加1‰(w/v)的防腐剂proclin300，1％(w/v)牛血清白蛋白，5％(w/v)蔗糖，0.5‰的表面活性剂tritonx-100，制得封保液。②取60μl的jsr疏水性磁珠原液(粒径为100～200nm)，用mes缓冲液洗涤5次，洗涤过程中加tritonx-100；③用20mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐对磁微粒活化1小时；④用ph4～5的mes缓冲液将活化后的磁微粒洗涤2次，洗涤过程中加tritonx-100；⑤按照0.5μg/t的量将psep抗体加入到洗涤后的磁微粒中，再加入0.5‰的tritonx-100，室温震荡3h进行包被；⑥加入5％乙醇胺，终止半小时；⑦用封保液封闭3次，按照50t/ml的量分装待用；3)、校准品由psep抗原、0.05mol/ltris-nacl、1‰(w/v)proclin300和1‰(w/v)酪蛋白、1％的(w/v)牛血清白蛋白配制，校准品s0～s5中，psep的浓度依次为0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、6ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的6份校准品。将上述试剂包装好，试剂瓶口胶塞用枪头扎开放到仪器上，分别在第1天、8天、15天、22天、30天分别检测同一组样本(样本来自临床，分装后低温保存，样本降解可忽略不计)，分别计算后面的检测结果与第一天检测结果的偏差，结果如下表：表7载机稳定性由表6可知，试剂在一个月之内检测相同的样本与第一天检测的结果偏差都在10％以内，因此该试剂载机(开封)稳定性可达到至少一个月。实施例3试剂盒灵敏度考核取实施例2记载的试剂盒，按照clsi标准《ep17-a：临床实验室检测限的评价》的性能确认(建立)的方法，进行lob、lod、loq的建立。本项目无标准物质，不能可溯源至si单位，loq不适用，考核功能灵敏度(fs)。建立方法如下：以最终确定的配方(如实施例2)考核lob，准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；lod，准备5份浓度范围为1～4倍lob的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；fs：采用lod实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、sd和cv％，最接近20％的浓度为功能灵敏度，结果见表7：表8试剂盒灵敏度考核第一批第二批第三批lob0.08ng/ml0.09ng/ml0.08ng/mllod0.15ng/ml0.17ng/ml0.16ng/mlfs0.21ng/ml0.23ng/ml0.23ng/ml考核3批试剂结果显示本试剂盒的lob、lod、fs分别是：0.09ng/ml、0.17ng/ml、0.23ng/ml。因此将本试剂盒的lob、lod、fs分别是定为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.3ng/ml。实施例4试剂盒线性范围考核取实施例2记载的试剂盒，按照clsi标准《ep6-a：定量检测方法的线性评估》的方法，以终配方配制的试剂建立本试剂盒的线性范围。建立方法如下：取1例高值样本h(＞20pg/ml)，1例低值样本l(＜0.3pg/ml),分别按照如下比例进行混合成11个浓度样本(10h、9h+1l、8h+2l、7h+3l、6h+4l、5h+5l、4h+6l、3h+7l、2h+8l、1h+9l、10l)，每个浓度样本检测4次，计算均值。将理论值与实测均值使用excel软件进行一次方程y＝ax+b回归分析，统计方程因子斜率a和相关性r，要求a＝1±0.1，r＞0.99。结果如附图图1所示，可以看出本发明试剂盒线性范围可达0.3～20pg/ml。实施例5试剂盒临床评价采用本发明实施例2所述的试剂盒与昂科生物公司生产的前列腺小体外泄蛋白(psep)检测试剂盒(酶联免疫法)平行考核梯度样本112例，浓度范围为0-20pg/ml。昂科生物试剂盒对超过10pg/ml的样本采用其说明书中方法稀释测定，检测结果进行临床相关性分析和符合率分析。符合率结果如表5所示，相关性如附图图2所示。表9交叉四格表法计算考核试剂与对比试剂的符合率由表5可以看出，本发明试剂盒与对比试剂盒阴阳符合率与总符合率均较好。由附图图2可以看出，本发明试剂盒和昂科生物试剂盒有较好的相关性，r2＝0.9928，且量值偏差较小，临床一致性较好。实施例6试剂盒hook考核取一份高浓度抗原，按照一定的比例进行稀释；统计其理论值与检测值，结果如表4所示：表10稀释比例与检测值与理论值由表10和附图图3可以看出，本发明试剂盒检测高浓度的样本或抗原，未发生hook现象以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12