一种EMSA试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种emsa试剂盒及其应用。

背景技术：

电泳迁移率实验(electrophoreticmobilityshiftassay，emsa)是一种研究dna结合蛋白与其相关的dna结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析蛋白质与dna的相互作用。这一技术最初用于研究dna结合蛋白，目前已推广用于研究rna结合蛋白与其相关的rna结合序列的相互作用。emsa通常将核蛋白与p³²同位素或生物素标记的dna或rna探针共同孵育，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，dna-蛋白复合物或rna-蛋白复合物较非结合的探针的移动速度慢，从而达到分离复合物和未结合的探针的目的。

现有技术中，p³²同位素由于具有放射性已不常用，常用的生物素标记探针法在电泳过后需要将dna结合蛋白转移到尼龙膜上，再利用链霉亲和素抗体孵育尼龙膜，使用化学发光法检测dna结合蛋白的含量。但是，转膜这一步骤十分关键，不能保证将全部dna结合蛋白转移到尼龙膜上，显著影响了结果的真实性。

cn107422022a公开了一种凝胶或电泳迁移率实验的结合反应体系的工作流程，具体步骤如下：步骤一，处理探针；步骤二，配胶；步骤三，预电泳；步骤四，配制结合反应体系；步骤五，电泳；步骤六，转膜；步骤七，交联固定dna；步骤八，结合膜预处理；步骤九，化学发光反应。所述方法包括转膜步骤，对结果的准确性有显著影响。

viagenebiotech研发了一款emsa试剂盒，采用红外荧光染料标记的探针进行蛋白捕获，具有灵敏度高、检测速度快等优点，但存在着探针聚集明显的问题，影响了结果的准确性。

因此，提供一种新的emsa试剂盒，提高emsa对核酸蛋白复合物检测的准确性和灵敏性，具有重要意义和广阔的应用前景。

技术实现要素：

为达此目的，本发明提供了一种emsa试剂盒及其应用，所述试剂盒中的探针采用荧光基团替代放射性p³²或生物素进行标记，显著提高了emsa的可操作性、特异性、灵敏度和结果的准确性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种emsa试剂盒，所述试剂盒包括荧光标记探针；

所述荧光标记包括cy2、cy3、cy5、cy5.5、cy7、alexafluor488或fitc中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，采用荧光标记探针与蛋白反应结合，通过凝胶电泳将核酸-蛋白复合物与未结合的探针进行分离，并在凝胶电泳后成像得到实验结果，实现了核酸结合蛋白的快速、准确、特异性检测。

优选地，所述荧光标记探针的浓度为10^-6～10^-7μm。

优选地，所述荧光标记探针包括靶向转录因子的探针。

优选地，所述转录因子包括stat3或nfat中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述靶向的探针包括如seqidno:1所示的核酸分子；

seqidno:1所示的核酸分子为：agttgaggggactttcccaggc.

优选地，所述靶向stat3的探针包括如seqidno:2所示的核酸分子；

seqidno:2所示的核酸分子为：gatccttctgggaattcctagatc.

优选地，所述靶向nfat的探针包括如seqidno:3所示的核酸分子；

seqidno:3所示的核酸分子为：

ctagtaatgctggaaaaataatatgggggtgt.

优选地，所述试剂盒还包括emsa结合缓冲液、竞争探针、目标蛋白特异抗体或无酶水中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述竞争探针为未标记探针。

优选地，所述未标记探针包括未标记野生型探针和/或未标记突变型探针。

本发明中，采用标记探针和百倍浓度的未标记野生型探针与目的蛋白反应，进行探针冷竞争反应；采用标记探针和未标记突变型探针与目的蛋白反应，进行突变探针的冷竞争反应；在反应中加入目的蛋白特异抗体，进行超迁移反应。

本发明中，未标记野生型探针标记探针的核酸序列相同，未标记突变型探针是在未标记野生型探针的基础上进行点突变获得的。

优选地，所述试剂盒还包括蛋白提取试剂和/或非特异性dna结合蛋白结合试剂。

优选地，所述蛋白提取试剂包括细胞裂解液、蛋白酶抑制剂或pmsf(苯甲基磺酰氟)中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述非特异性dna结合蛋白结合试剂包括polydi-dc和/或polyda-dt。

本发明中，非特异性dna结合蛋白结合试剂用于非特异性竞争结合dna，由于其特定的结构，在emsa中可以抑制粗制核抽提液对标记探针的非特异性结合，避免假复合物的出现；其中，polydi-dc由肌苷和胞嘧啶组成，polyda-dt由腺嘌呤和胸腺嘧啶组成。

优选地，所述非特异性dna结合蛋白结合试剂的浓度为0.1～1μg/μl，例如可以是0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl、0.6μg/μl、0.7μg/μl、0.8μg/μl、0.9μg/μl或1μg/μl，优选为0.5～0.8μg/μl。

第二方面，本发明提供了一种检测方法，所述方法包括采用如第一方面所述的emsa试剂盒检测核酸结合蛋白的步骤。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)从样本中提取蛋白；

(2)将提取的蛋白与非特异性dna结合蛋白结合试剂共孵育；

(3)加入荧光标记探针，孵育；

(4)进行凝胶电泳，扫描读取结果。

优选地，步骤(1)所述样本包括细胞、组织或外周血中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，在步骤(2)之前还包括将提取的蛋白与特异性抗体室温孵育30～60min的步骤，该步骤为可选步骤，仅在进行超迁移实验时进行。

优选地，步骤(2)所述孵育的温度为0～4℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃。

优选地，步骤(2)所述孵育的时间为10～60min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min、41min、42min、43min、44min、45min、46min、47min、48min、49min、50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min或60min，优选为10～15min。

优选地，步骤(3)所述孵育的温度为15～30℃，例如可以是15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，优选为20～25℃。

优选地，步骤(3)所述孵育的时间为10～30min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min，优选为20～25min。

第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的emsa试剂盒和/或如第二方面所述的检测方法在检测核酸结合蛋白中的应用。

优选地，所述核酸结合蛋白包括转录因子。

优选地，所述转录因子包括stat3或nfat中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明以串联荧光基团的探针与核蛋白反应结合，并通过凝胶电泳将核酸-蛋白复合物与未结合探针分离，由于核酸-蛋白复合物的分子量大，进行电泳时移动速度慢，处于凝胶上层，而未结合探针的分子量小，电泳时移动速度快，处于凝胶底层；此外，不与探针结合的蛋白由于没有荧光基团标记，无法检测到；

(2)本发明采用荧光基团替代放射性p³²或生物素对探针进行标记，显著提高了emsa实验的可操作性、特异性、灵敏度和结果的准确性；

(3)本发明经过反复优化及对比，每个样品仅需10^-6～10^-7μm探针即可清晰检测到dna特异性结合蛋白，并且在电泳后即刻得到实验结果，无需其他处理；

(4)采用本发明的方法用于分析巨噬细胞主要转录因子活化，具有操作简便、结果准确、检测速度快的优点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实验原理示意图；

图2为cy3标记探针与thp-1细胞核蛋白的结合；

图3为cy3标记stat3探针与ibmm细胞核蛋白的结合；

图4为cy3标记nfat探针与2b4细胞核蛋白的结合；

图5为生物素标记探针和cy3标记探针对ibmm细胞核蛋白的结合对照结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1裂解液的配制

裂解液配方如下：

裂解液a(buffera)：10mm4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes，ph＝7.9)，1.5mmmgcl2，20mmkcl；

裂解液b(bufferb)：10％乙基苯基聚乙二醇(nonidetp40，np40)；

裂解液c(bufferc)：20mm4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes，ph＝7.9)，25％甘油，0.42mnacl，1.5mmmgcl2，0.2mmedta。

实施例2细胞核蛋白的提取

分别从thp-1细胞、ibmm细胞和2b4细胞中提取核蛋白，具体步骤如下：

取10⁷个细胞，在4℃、500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，收集细胞；用冷pbs洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清；在洗涤并去除上清液的细胞中加入实施例1配制的裂解液a，其中以每10⁷细胞中加入0.4ml裂解液的比例加入裂解液a，冰上孵育15min，之后加入20μl裂解液b，震荡10s后以3000rpm的速度在4℃下离心10min，收集上清液为胞浆蛋白；

向沉淀中加入0.5ml裂解液a，洗涤后以4200g的速度在4℃下离心3min，弃上清；

沉淀采用50μl裂解液c重悬，冰上孵育30min，每10min震荡一次，以14300g的速度在4℃下离心20min，收集上清液为核蛋白。

本实施例中，裂解液a、b和c在使用前加入1mmpmsf和蛋白抑制酶。

实施例3荧光标记探针介导的emsa

如图1所示为荧光标记探针介导的emsa原理示意图：荧光标记探针与核蛋白反应结合，通过凝胶电泳将核酸-蛋白复合物与未结合探针分离，由于核酸-蛋白复合物的分子量大，进行电泳时移动速度慢，处于凝胶上层；而未结合探针的分子量小，电泳时很快移动到凝胶底层；此外，不与探针结合的蛋白由于没有荧光基团标记，故无法检测到。

实施例4emsa检测

对照组和基因沉默型thp-1细胞核蛋白被提取后，与2×反应缓冲液(12％甘油，24mmhepes(ph＝7.0)，8mmtris-hcl(ph＝8.0)，2mmedta，1mm二硫苏糖醇dtt)、bsa(1μg/μl)以及polydi-dc(0.5μg/μl)在冰上反应10min，每个样品加入2×10^-7μm的cy3标记的探针seqidno:1，室温反应20min后，将样品加入非变性胶中进行跑胶，跑胶结束后用chemidoc^tmmpimagingsystem(biored)进行扫描读取结果。

如图2所示，第一泳道和第二泳道为thp-1shegfp细胞的核蛋白，第三泳道和第四泳道为thp-1shadap细胞的核蛋白，其中第一泳道和第三泳道的细胞处于静息状态，第二泳道和第四泳道的细胞处于脂多糖(lps)刺激状态；结果显示，lps刺激后shegfp和shadap细胞中nf-kb的激活状态无明显变化。

实施例5emsa检测stat3

ibmm细胞核蛋白被提取后，与2×反应缓冲液(12％甘油，24mmhepes(ph＝7.0)，8mmtris-hcl(ph＝8.0)，2mmedta，1mm二硫苏糖醇dtt)、bsa(1μg/μl)以及polydi-dc(0.5μg/μl)在冰上反应10min，每个样品加入2×10^-7μm的cy3标记的stat3探针seqidno:2，室温反应20min后，将样品加入非变性胶中进行跑胶，跑胶结束后用chemidoc^tmmpimagingsystem(biored)进行扫描读取结果。

如图3所示，第一泳道为静息状态ibmm细胞的核蛋白，第二泳道为lps刺激下ibmm细胞的核蛋白；结果显示，lps刺激后ibmm细胞中stat3的激活无明显变化。

实施例6emsa检测nfat

2b4细胞核蛋白被提取后，与3μgnfat特异性抗体或igg室温反应1小时，之后与2×反应缓冲液(12％甘油，24mmhepes(ph＝7.0)，8mmtris-hcl(ph＝8.0)，2mmedta，1mm二硫苏糖醇dtt)、bsa(1μg/μl)以及polydi-dc(0.5μg/μl)在冰上反应10min，每个样品加入2×10^-7μm的cy3标记的nfat探针seqidno:3，室温反应20min后，将样品加入非变性胶中进行跑胶，跑胶结束后用chemidoc^tmmpimagingsystem(biored)进行扫描读取结果。

如图4所示，第一泳道为静息状态2b4细胞核蛋白，第二至第四泳道为cd3及cd28刺激后2b4细胞核蛋白，第一、二泳道蛋白不做处理，第三泳道蛋白加入nfat抗体孵育，第四泳道蛋白加入对照igg孵育；结果显示，第三泳道出现超迁移条带，证明是nfat蛋白的特异性结合。

实施例7

thp-1细胞核蛋白被提取后，与2×反应缓冲液、bsa以及浓度为0.5μg/μlpolyda-dt在冰上反应20min，每个样品加入2×10^-7μm的fitc标记的探针，30℃反应10min后，将样品加入非变性胶中进行跑胶，跑胶结束后用chemidoc^tmmpimagingsystem(biored)进行扫描读取结果。

实施例8

ibmm细胞核蛋白被提取后，与2×反应缓冲液、bsa以及浓度为0.5μg/μlpolyda-dt在冰上反应20min，每个样品加入2×10^-7μm的cy2标记的探针，15℃反应30min后，将样品加入非变性胶中进行跑胶，跑胶结束后用chemidoc^tmmpimagingsystem(biored)进行扫描读取结果。

对比例

与实施例4相比，对比例的探针采用生物素标记，非变性胶后进行转膜、交联固定dna、结合膜预处理和化学发光反应，用chemidoc^tmmpimagingsystem(biored)进行扫描读取结果。

结果如图5所示，在对照组和实验组中，第一泳道为对照组细胞，第二泳道细胞进行了甲型流感病毒(iav)感染；cy3结合探针结果显示，ibmm细胞经iav感染后激活降低，而在样品相同、上样量相同的条件下，对比例中生物素结合探针的emsa未检测到灵敏度较差，结果不准确。

综上所述，本发明以串联荧光基团的探针与核蛋白反应结合，并通过凝胶电泳将核酸-蛋白复合物与未结合探针分离，由于核酸-蛋白复合物的分子量大，进行电泳时移动速度慢，处于凝胶上层，而未结合探针的分子量小，电泳时移动速度快，处于凝胶底层；此外，不与探针结合的蛋白由于没有荧光基团标记，无法检测到；本发明采用荧光基团替代放射性p³²或生物素对探针进行标记，显著提高了emsa实验的可操作性、特异性、灵敏度和结果的准确性；每个样品仅需10^-6～10^-7μm探针即可清晰检测到dna特异性结合蛋白，并且在电泳后即刻得到实验结果，无需其他处理；采用本发明的方法用于分析巨噬细胞主要转录因子活化，具有操作简便、结果准确、检测速度快的优点，具有广阔的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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<110>西交利物浦大学

<120>一种emsa试剂盒及其应用

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