应用TLC-CMS-IR检测米糠神经酰胺类化合物的方法与流程

本发明涉及神经酰胺类化合物检测领域，具体为一种应用tlc-cms-ir检测米糠神经酰胺类化合物的方法。

背景技术：

小米是我国北方主要的杂粮农作物，它具有生产周期短，耐干旱，营养丰富等特征。而小米去皮后的产物小米糠是由小米的果皮层、糊粉层和米胚芽三部分构成。米糠有好多营养，但是被人们忽视了，在过去的时间里常常会被人们忽略因此导致利用率不高，但是最近几年对米糠的不断深入了解研究，研究人员发现了米糠在营养方面具有不容小觑的价值，并且米糠中含有生物碱、甾醇、三萜类、谷维素、神经酰胺等营养的物质，可以使用这些来加工一些不同种类的食品，因此也可以把米糠作为是十分优质的原材料。虽然米糠有丰富的营养价值且资源充足，但是由于会发生酸败现象，也会因为外界的许多原因受到污染破坏导致风味变差等问题，所以大部分米糠被当作废料进行处理。但随着人们认识观念的转变和科学技术的发展，米糠越来越被人们重视，合理利用米糠会产生巨大的经济效益，而且也不会被浪费，使小米的食用价值和营养价值更高。

神经酰胺（ceramide，结构式如图1所示），n-脂酰鞘胺醇，是神经鞘磷脂的基本单位，鞘磷脂是细胞膜的一个组成部分。它还是体内重要的一类生物活性物质，具有屏障、粘附、保湿、增强免疫力、防癌、抗癌等功能。神经酰胺具有很强的保水和保湿性能，因此它多用于化妆品行业。此外，神经酰胺作为体内重要的第二信使，引起了研究者的广泛关注。目前通过研究发现，神经酰胺可以通过一系列方式参与信息的传导，因此也会影响到一些生理和病理过程。目前，在神经酰胺的开发和应用中，最重要的是将其作为保湿剂添加到化妆品中。但也尝试将天然神经酰胺作为开发利用的食品原料，并取得了一定的进展。而日本和法国已经有这类食品上市，目前国内对这类食品的研究还不多，有待进一步研究。

以米糠为原料提取神经酰胺等生物活性物质，进行相关产品的研发，将有望获得有重要价值的产物，对资源的综合利用和可持续发展有重要意义。

目前也有许多人对神经酰胺展开了各种研究，各种方法来检测神经酰胺。到目前为止，已经知道的检测方法有苯甲酰化-紫外检测、荧光标记-荧光检测和蒸发光散射检测。近年来，质谱和生化分析也被应用于神经酰胺的检测。iwamori等人首次提出了神经酰胺的苯甲酰化-紫外检测方法，其基本原理是用某些试剂与神经酰胺反应，形成在230~280nm处具有较强紫外吸收的n-酰基化合物。从而实现了神经酰胺的间接紫外检测。previati等人发展了神经酰胺柱前衍生化的nap荧光标记和荧光检测方法。但在小米米糠中用薄层色谱检测神经酰胺还未曾见报道。

技术实现要素：

本发明是在前人研究的基础上，以米糠为例，提供一种应用tlc-cms-ir检测米糠神经酰胺类化合物的方法。该方法采用tlc-ir技术检测米糠中神经酰胺类化合物，是对资源的有效利用，且运用本方法通过超声波微波萃取结合薄层层析色谱技术对米糠中神经酰胺类物质分离提纯，该方法设备简单，操作简便，分离速度快，精确度高，适用于从米糠中分离纯化神经酰胺。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种应用tlc-cms-ir检测米糠神经酰胺类化合物的方法，包括如下步骤：

（1）、米糠中神经酰胺样品的粗提取

粉碎：将米糠放于通风处阴干，并且用粉碎机粉碎后，过80目筛子进行筛分，备用。

浸提：配置70%的乙醇溶液，将米糠粉末放入容器中，按料液比1:10加入乙醇溶液，然后放入恒温振荡器中振荡，调节温度40℃，振荡12h。

超声波微波组合萃取仪辅助处理：用超声波微波萃取仪辅助分三个阶段进行提取，每阶段5min，共15min；具体参数为在恒定超声波的条件下，设置温度为45℃、50℃、55℃，超声波功率为800w、900w、1000w，微波功率为250w、300w、350w，超声波频率为50khz，模式15:10，电机转速900r/min。

离心：将提取液放在4000r/min下离心10min，3次，合并上清液，获取沉淀物和上清液；粗滤后用微膜进行过滤，过滤上清液，将沉淀物与滤渣合并。

浓缩蒸发：取上清液倒入旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，并且打开冷凝管，设置温度为79℃，然后进行旋转蒸发，等到冷凝时没有液体蒸发出来，回收烧瓶中的乙醇并且重复使用。

定容：蒸发后的物质用甲醇将其定容至25ml。

（2）、神经酰胺标准品的制备

将神经酰胺标准品放入容量瓶中，加入甲醇，在超声条件下溶解，得到1mg/ml神经酰胺标准品，将其置于2~4℃的冰箱中保存，备用。

（3）、薄层色谱技术分离纯化（tlc）

活化：用10×10cm的硅胶gh254层析板，放置在电热鼓风干燥箱中，设置温度为105℃，活化30min后备用。

点样：用微量进样器吸取25μl的样品溶液，将点样参数放在自动点样机上，其中点距10mm、点宽8mm、点数3、点样量10μl、点样速度2s/μl，在硅胶板上点样并分别取25μl神经酰胺对照品溶液，并点样三个作为对照。

展开：在层析缸中配制体积比为氯仿:甲醇:乙酸=19:0.8:0.1混合溶液，静置作为展开剂，倒入展开缸中，让其在展开缸中氤氲20~30分钟直至饱和，将点样完成的硅胶g板放入展开剂液面高10~15mm的平卧式展开缸内，待到展开剂前沿距离硅胶板顶端1cm处时，取出，晾干。

显色：用制备的0.1%茜素乙醇溶液喷于干燥的层析板上进行显色，并观察结果。

薄层色谱成像系统记录：将显色后的色谱板置于薄层色谱成像系统中，并在365nm紫外光下拍摄色谱图并拍照。

薄层色谱扫描仪测定含量：通过全能的薄层色谱扫描仪扫描拍摄的薄层板，并通过轨迹跟踪确定点位置参数；用手动调节位置功能确定背景及各个神经酰胺斑点的横、纵坐标，用光谱扫描确定神经酰胺的测定波长与参与波长，通过反射扫描方法确定目标点的吸收峰面积的积分值，并且通过峰面积和点量之间的线性关系确定目标点的物质含量。

紫外光谱测定：将样品用95%乙醇溶解并稀释，使用蒸馏水代替样品作为空白，将含有空白和样品的石英比色皿放入紫外扫描仪的样品槽中，并且在200~700nm的最大吸收波长下扫描样品并记录。

（4）、质谱仪检测

标准品的质谱检测：用色谱甲醇和超纯水用作流动相，打开仪器和软件使其处于工作状态，用微量进样器吸取25μl的神经酰胺标准品溶液插入到进样口处，打到load档开始进样，进完样后打到inject档；点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

待测液的质谱检测：流动相与测标标准品的流动相相同，使仪器和软件处于工作状态，用微量进样器吸取25μl的待测样品溶液插入到进样口处，打到load档开始进样，进完样后打回到inject档；点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

（5）、红外检测

标准品的检测：打开仪器并选择相应的工作界面，用擦镜纸擦拭点样中心处，测试背景，然后用毛细管吸取标准品于点样中心处，测试样品并对谱图界面出现的谱图进行处理和分析。

待测品的检测：将第二套薄层板上画出的神经酰胺斑点置于烧杯中，加入10ml色谱甲醇，然后再将其过滤得到的滤液进行红外检测，检测步骤与标准品的检测步骤一致。

本发明方法以米糠为原料，用70%乙醇为提取剂，料液比1:10，经超声波微波萃取仪辅助处理获得神经酰胺类化合物粗提取液，经薄层层析分离和纯化后测定其含量，红外光谱仪对其进行定性分析。结果显示：神经酰胺最佳展开剂为（氯仿:甲醇:乙酸=19:0.8:0.1，v/v），显色后呈红色斑点，清晰无拖尾，供试样液与神经酰胺对照品有相同的rf值，为0.42。反射式扫描显示峰面积值与含量线性关系良好（r=0.9985），外标两点法测定米糠中神经酰胺含量为0.74%。经质谱仪检测，供试液分子信息与神经酰胺标准品基本一致。供试样品与神经酰胺标准品红外光谱图对比显示出羟基、羰基和酰胺基的特征峰，初步判定为是神经酰胺类化合物。结论：米糠中含有神经酰胺类化合物，超声波微波萃取法辅助处理提取率高，提取时间短；tlc-ir联用对其进行分离纯化及定性分析，设备简单，操作简便，重现性好，精确度高，分离效果好，且纯度高。

本发明方法主要研究米糠中检测神经酰胺类化合物，米糠检测神经酰胺类化合物采用了乙醇为提取剂，微波超声波萃取，所采用的超声波微波萃取法是利用超声提取时温度低，步骤简单，提取物杂质较少，因此米糠中神经酰胺类化合物的提取率大大提高了，这样可以更多的提取神经酰胺类化合物。检测神经酰胺类化合物最常见的是高效液相色谱法，利用薄层色谱法分离方法较少。在薄层色谱分离纯化过程中，展开剂的选择和配比也是比较重要的，展开缸内展开剂的预处理时间和环境温度对展开的效果也有不同程度的影响，在配置展开剂的过程中也有许多问题，如跑板，歪斜，拖尾等，所以展开缸要水平放置在水平桌面上；其次，点样距离也应适中。本实验所采用的超声波微波萃取法是利用超声提取时温度低，步骤简单，提取杂志少，因此大大提高了米糠神经酰胺类物质的提取率。本发明所得结论将为以后米糠能否获得营养价值和保健功效提供理论依据，对资源的可持续发展和利用具有重要意义。

附图说明

图1表示神经酰胺结构式。

图2表示样品与神经酰胺薄层色谱成像图（10×10cm）。

图3表示神经酰胺标准曲线。

图4表示样品中神经酰胺含量的测定结果。

图5表示供试液质谱扫描曲线。

图6表示神经酰胺标准品质谱扫描曲线。

图7表示神经酰胺样品红外图。

图8表示神经酰胺标准品红外图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细说明。

一种应用tlc-cms-ir检测米糠神经酰胺类化合物的方法，如下：

1、实验材料

1.1、材料

晋谷8311红小米糠由山西省大同市浑源县提供。

1.2、实验所用试剂

表1实验所用试剂

1.3、实验所用仪器

表2实验所用仪器

2、实验方法

2.1、米糠中神经酰胺样品的粗提取

粉碎：将米糠放于通风处阴干，并且用粉碎机粉碎后，过80目筛子进行筛分，装入玻璃器中备用。

浸提：配置70%的乙醇溶液。用电子天平分别称取15g米糠粉末放入同等体积的三个250ml锥形瓶中。按料液比1:10加入乙醇溶液，然后放入恒温振荡器中振荡，调节温度40℃，振荡12h。

超声波微波组合萃取仪辅助处理：用超声波微波萃取仪辅助分三个阶段提取，每阶段5min，共15min。在恒定超声波的条件下，设置温度为45℃、50℃、55℃，超声波功率为800w、900w、1000w，微波功率为250w、300w、350w，超声波频率为50khz，模式15:10，电机转速900r/min。

离心：将提取液放在4000r/min下离心10min，3次，合并上清液，获取沉淀物和上清液。粗滤后用微膜进行过滤，过滤上清液，将沉淀物与滤渣合并。

浓缩蒸发：取上清液倒入旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，并且打开冷凝管，因为乙醇的沸点是78℃~79℃，但是会有水，因此设置为79℃，然后进行旋转蒸发，等到冷凝时没有液体蒸发出来，大约为体积的1/10。回收烧瓶中的乙醇并且重复使用。

定容：蒸发后的物质用甲醇将其定容至25ml。

提取率：经浓缩后物质质量/原料质量×100%，最佳微波超声波条件得优化选择，如表3所示：

表3超声波、微波参数

2.2、神经酰胺标准品的制备

称取25mg神经酰胺标准品放入干净的25ml容量瓶中，加入甲醇，在超声条件下溶解，得到1mg/ml神经酰胺标准品，将其置于2~4℃的冰箱中保存。

2.3、薄层色谱技术分离纯化（tlc）

活化：用10×10cm的硅胶gh254（青岛海洋）层析板，放置在电热鼓风干燥箱中，设置温度为105℃，活化30min后以备使用。

点样：用微量进样器缓慢吸取25μl的样品溶液，将点样参数放在自动点样机上（点距10mm，点宽8mm，点数3，点样量10μl，点样速度2s/μl），在硅胶板上点样并分别取25μl神经酰胺对照品溶液，并点样三个作为对照。

展开：在层析缸中配制氯仿:甲醇:乙酸=19:0.8:0.1（v/v）混合溶液，静置作为展开剂，倒入展开缸中，让其在展开缸中氤氲20~30分钟直至饱和，将点样完成的硅胶g板轻轻放入展开剂液面高约10~15mm的平卧式展开缸内，待到展开剂前沿距离硅胶板顶端约1cm处时，取出，晾干。

显色：用制备的0.1%茜素乙醇溶液喷于干燥的层析板上进行显色，并观察结果。

薄层色谱成像系统记录：将显色后的色谱板置于薄层色谱成像系统中，并在365nm紫外光下拍摄色谱图并拍照。

薄层色谱扫描仪测定含量：通过全能的薄层色谱扫描仪扫描拍摄的薄层板，并通过轨迹跟踪确定点位置参数。可以用手动调节位置功能确定背景及各个神经酰胺斑点的横、纵坐标，先用光谱扫描确定了神经酰胺的测定波长与参与波长，通过反射扫描方法确定目标点的吸收峰面积的积分值，并且通过峰面积和点量之间的线性关系确定目标点的物质含量。

紫外光谱测定：将样品用95%乙醇溶解中并稀释至合适的浓度。使用蒸馏水代替样品作为空白，将含有空白和样品的石英比色皿放入紫外扫描仪的样品槽中，并且在200~700nm的最大吸收波长下扫描样品并记录。

2.4、质谱仪检测

标准品的质谱检测：用色谱甲醇和超纯水用作流动相。打开仪器和软件使其处于工作状态，用微量进样器吸取25μl的神经酰胺标准品溶液插入到进样口处，打到load档开始进样，进完样后打到inject档。点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

待测液的质谱检测：流动相与测标标准品的流动相相同。使仪器和软件处于工作状态，用微量进样器吸取25μl的待测样品溶液插入到进样口处，打到load档开始进样，进完样后打回到inject档。点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

2.5、红外检测

标准品的检测：打开仪器并选择相应的工作界面，用擦镜纸擦拭点样中心处，测试背景，然后用毛细管吸取少量的标准品于点样中心处，测试样品并对谱图界面出现的谱图进行处理和分析。

待测品的检测：将第二套薄层板上画出的神经酰胺斑点用小刀抠下置于烧杯中，加入10ml色谱甲醇，然后再将其过滤得到的滤液进行红外检测，检测步骤与标准品的检测步骤一致。

3、结果分析

3.1薄层层析色谱分析

样品溶液和对照品溶液经点样展开后，再用显示剂进行显色，茜素黄是一种高度特异性的指示剂，可以在特定的颜色反应中与酰胺反应。硅胶板进行显色以后，出现清晰的斑点，无拖尾，重现性好，表明这种物质可能是神经酰胺。tlc成像系统显示在灯下拍的样品图和标准品图有相同的rf值，并且在紫外（365nm）检视时观察到相同颜色的荧光斑点，如图2所示。

紫外光谱分析：在薄层色谱分离之后，uv光谱扫描在200nm~400nm的波长范围内没有显示出吸收峰，这与相关文献中记载的关于神经酰胺缺乏的uv发色基团一致。

以上图谱表明：在样品色谱图中，在神经酰胺对照品色谱相应的位置上，可以观察到相同的荧光斑点。

精确吸取以上制备好的神经酰胺对照品溶液8μl、9μl、10μl分别点于同一硅胶板上（10×10cm），根据色谱条件，并且依法展开后进行扫描，对照品量是横坐标（x），吸收峰面积值是纵坐标（y），绘制标准曲线，并且实验数据线性回归以获得回归方程y=0.1059x–0.5064（r=0.9985）。结果表明：在8~10μl之间内，神经酰胺的峰面积与对照物的量具有良好的线性关系，如图3所示。

样品含量的测定：分别移取神经酰胺对照品溶液25μl，在硅胶板上分别点样8μl、9μl、10μl，对应于图4所示的标准品1、标准品2、标准品3。分别移取样品溶液25μl，在同一硅胶板上点样10μl、10μl、10μl，对应于图4中样品1、样品2、样品3。依法展开，利用反射扫描发测得神经酰胺的含量为0.7672mg/ml、0.6867mg/ml、0.7781mg/ml。

3.2、质谱分析

将配制的神经酰胺标准品和供试液进行质谱分析，观察图5可知，供试液在537出现了强峰，表明该化合物分子量为537，观察图6可知，神经酰胺的相对分子量为537，按理在质谱图中应该会出现537的强峰，但在536出现了强峰，推测神经酰胺标准品在电子的轰击下减少了一个h，这属于正常现象，故判定该物质为神经酰胺类化合物。

3.3、红外光谱分析

红外光谱是选择性地吸收某些波长的红外线的分子，引起分子中振动能级和转动能级的转变，通过检测红外线的吸收可以得到物质的红外吸收光谱，红外光谱主要是比较官能团，只要将样品的红外光谱与标准品的红外光谱进行比较，就可以有效地表征测试物品的特征官能团。

在分析神经酰胺粗提物的红外光谱图中出现的峰值，发现粗提物含有一组特定的神经酰胺：羟基，羰基和酰胺基团，如图7、8所示。

官能团的测定：（1）羟基：ir（kbr）vmax/cm^-1在3348、3309处具有吸收峰，2925、2954表明化合物中存在羟基；（2）羰基：ir（kbr）vmax/cm^-1中间体1625、1639、1511、1516具有表明化合物中存在羰基的吸收峰；（3）酰胺基：ir（kbr）vmax/cm^-1在1217、1270、1074、1015处具有吸收峰，表明该化合物存在酰胺基。

4、结论

以米糠为原料，经过多次实验，超声波辅助萃取神经酰胺的最佳工艺测定如下：70％乙醇，料液比1:10，微波和超声功率分别设定为250w、300w、350w和800w、900w、1000w时，米糠中的神经酰胺具有良好的提取性能（通过超声波微波组合合成萃取仪辅助提取一次，每次5min，总共3段，持续15min）。经过多次实验，点样的最佳参数设置为：点样间距10mm、点样宽度8mm、点样速度2s/μl。神经酰胺的最佳展开剂比例为（氯仿:甲醇:乙酸=19:0.8:0.1，v/v）。在0.1%的茜素乙醇下显色，薄层成像系统365nm下检视，硅胶板上荧光斑点显色清晰，样品中斑点与神经酰胺标准品位置一致，且呈红色斑点，其rf值为0.42。在薄层扫描下峰面积与含量线性关系良好（r=0.9985），外标两点法测得样品其含量为0.74%。

本实验方法以米糠为原料，最终用乙醇作为本实验的提取溶剂，采用微波超声波萃取法结合薄层层析色谱技术分离纯化米糠提取物神经酰胺。通过薄层色谱分离的神经酰胺，也可以准确识别分离的物质并确定其含量。该方法简便，准确，结果也较好。因此，从米糠中提取的神经酰胺的含量可以通过薄层色谱法测定。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖于本发明权利要求书的保护范围中。