一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法与流程

本发明属于代谢组学领域，更具体地，涉及一种分离同分异构体胆汁酸的方法。

背景技术：

胆汁酸(bileacids,bas)是生物体内一类非常重要的代谢物，构成胆汁的主要有机成分，是几种结构类似的类固醇酸的统称。主要功能是作为乳化剂促进食物中脂肪的代谢和脂溶性维生素和胆固醇的吸收，还可以作为信号分子参与多个信号传导途径，同时也是菌群与宿主互利共生的协调者。胆汁酸按来源可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸，前者是肝细胞以胆固醇为原料直接合成，而后者是由初级胆汁酸随胆汁进入肠道后，经历了肠道细菌的分解，以及肠肝循环后形成的产物，故冠名为“次级”。胆汁酸按化学结构可分为游离胆汁酸和结合胆汁酸，游离胆汁酸主要是指胆酸(cholicacid,ca)、脱氧胆酸(deoxycholicacid,dca)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholicacid,cdca)、石胆酸(lithocholicacid,lca)，结合胆汁酸是前者通过酰胺键与甘氨酸、牛磺酸、硫酸、葡糖醛酸结合的产物，多与甘氨酸、牛磺酸结合。临床诊断上胆汁酸浓度是肝胆疾病、胃肠疾病如胆汁淤积的一项重要依据，科学研究上胆汁酸与肥胖、肠胃肿瘤、肠道菌群、能量代谢等密切相关，因此亟需一种针对胆汁酸的全面快速、专一灵敏的精准定量测定方法，这对健康领域和代谢组学领域的基础研究具有显著意义。

目前市面上已有多种胆汁酸测定方法，主要是基于液相色谱-质谱的方法。其中文献(penno,c.a.,d.arsenijevic,t.dacunha,g.a.kullak-ublick,j.-p.montanianda.odermatt.quantificationofmultiplebileacidsinuninephrectomizedratsusingultra-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry[j].analmethods.2013,5(5):1155-1164)中的测定方法被广泛使用，使用高效液相色谱(uplc)对胆汁酸进行分离，使用三重四级杆质谱(qqq)、电喷雾电离(esi)和多反应监测(mrm)采集碎片信息，通过比对标准品的保留时间和离子对信息来定性，具有高选择性、定性准确的优点，但是存在检出种类少、同分异构体分离度差等缺点，胆汁酸同分异构体由于分子量相同，离子碎片通常也完全相同，无法通过质谱的mrm技术进行区分，因此色谱上不能分离的同分异构体无法进行准确的定性定量分析，而这些同分异构体胆汁酸往往具有重要的生理功能，极大的阻碍了相关基础研究，因此亟需一种有效分离同分异构体胆汁酸的色谱方法来解决以上问题。

现有技术1(alterationsofbileacidsandgutmicrobiotainobesityinducedbyhighfatdietinratmodel)发展了一种胆汁酸检测方法，基于高效液相色谱质谱联用，并应用于大鼠肝脏、粪样、血浆和肠道内容物中28种胆汁酸的定量检测，但是对于t-α-mca/t-β-mca这类同分异构体分离度差。

现有技术2(中国专利文献cn108072704a)公开了基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法，该方法将色谱分离及质谱分辨技术结合，同时检测26种胆汁酸，但是对于β-mca/ω-mca、t-α-mca/t-β-mca这两类同分异构体分离度差。

现有技术3(alterationofbileacidmetabolismintheratinducedbychronicethanolconsumption)发展了基于液相色谱质谱联用的胆汁酸的检测方法，并应用于大鼠肝脏、血清和肠道内容物中30种胆汁酸的定量检测，但是对于α-mca/β-mca/ω-mca、cdca/dca这两类同分异构体分离度差。

现有技术4(中国专利文献cn106841492a)公开了一种利用高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，但是对于cdca/dca这类同分异构体分离度差。

现有技术5(中国专利文献cn106885867a)公开了一种利用高效液相色谱串联质谱检测血清中五种牛磺结合型胆汁酸的方法，但是对于tdca/tcdca这对同分异构体分离度差。

综上所述，多类同分异构体胆汁酸的色谱分离差是一个普遍现象，并且极大影响同分异构体的定性定量分析，在色谱上对同分异构体胆汁酸进行有效分离是一个亟需解决的技术瓶颈。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其目的在于，通过针对胆汁酸同分异构体代谢组分进行的洗脱体系即洗脱梯度设置的优化，调整含有同分异构提胆汁酸代谢组分的分离度及出峰间距，从而在较短的时间范围内，充分分离胆汁酸代谢组分，实现胆汁酸含有同分异构体的代谢组分的定量检测，由此解决现有技术不能很好的分离胆汁酸各组同分异构体的代谢组分，导致胆汁酸代谢组分无法定量检测的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，采用反向高效液相色谱梯度洗脱法，其流动相系统为：a、超纯水，b、乙腈；

在t-α-mca峰至gudca峰之间，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率小于等于每分钟0.86％。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其在ghdca峰至iso-dca峰之间，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率小于等于每分钟7.6％且大于等于每分钟6.8％。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其在iso-lca峰至lca峰之间，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率在大于等于每分钟25％。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其起始流动相中b相的体积比例在25％至27％。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其采用c18填料的反相色谱柱。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其a相含有质量分数在0.001～0.01％的甲酸或乙酸。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其a相含有质量分数0.005％的甲酸。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其b相含有质量分数在0.001～0.01％的甲酸。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其b相含有质量分数0.005％的甲酸。

优选地，所述含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其柱温在40～50℃之间。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明采用反向高效液相色谱梯度洗脱法分离胆汁酸代谢组分分离方法，通过对固定相、流动相体系、柱温进行摸索，尤其是通过制定梯度洗脱方案，实现了在短时间内分离胆汁酸代谢组分，使得其中的含有的8对同分异构体，皆能有效分离，分离度达到定量测试标准的要求，甚至包括现有技术不能分离的同分异构体。优选方案的分离时间仅13分钟左右，完全满足高通量检测对胆汁酸代谢组分分离时间的要求。

附图说明

图1是按照本发明技术方案对32种胆汁酸的标准品溶液的检测结果；

图2是按照本发明技术方案对32种胆汁酸的标准品溶液的检测结果；

图3是按照本发明技术方案对32种胆汁酸的标准品溶液的检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，具体如下：

采用反向高效液相色谱梯度洗脱法，其流动相系统为：a、超纯水，b、乙腈；优选方案，a相含有质量分数在0.001～0.01％的甲酸或乙酸，优选含有质量分数0.005％的甲酸；b相含有质量分数在0.001～0.01％的甲酸，优选含有质量分数0.005％的甲酸。

洗脱方案如下：在t-α-mca峰至gudca峰之间，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率小于等于每分钟0.86％；在ghdca峰至iso-dca峰之间，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率大于等于每分钟6.8％且小于等于每分钟7.6％；在iso-lca峰至lca峰之间，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率大于或等于25％。起始流动相b相的体积比例在25％至27％。

优选采用c18填料的反相色谱柱，柱温在40～50℃之间。

流动相(a、b相的体积比例)的变化，影响胆汁酸的保留时间，即使轻微调整流动相，也会对所有胆汁酸的保留时间和分离度产生影响，甚至改变胆汁酸的出峰顺序。对于胆汁酸中同分异构体来说，它们在固定相和流动相的分配系数差别非常微小，保留时间也非常接近，我们发现通过改变流动相中a、b相的变化速率可以提高胆汁酸代谢组分中同分异构体的分离度。然而，为了分离所有胆汁酸代谢组分中的同分异构体，匀速变化的流动相洗脱方案的洗脱时间过长，无法满足高通量检测的分离要求。我们采用分段调整的策略，摸索合理的梯度洗脱方案。由于流动相的变化影响整体胆汁酸各组分的保留时间、甚至影响出峰顺序，故给分段设置洗脱梯度策略带来极大的不可预知性，其难度在于如何划分洗脱梯度变化区段，并对区段内的流动相变化速率进行摸索，使得同分异构体的分离度提高的同时整体出峰均匀，在可接受的时间范围内高效分离胆汁酸同分异构体代谢组分。

我们发现针对胆汁酸代谢组分，以t-α-mca、gudca、iso-dca、lca的出峰为分段区间，对区间内的流动相变化速率加以限制，可维持基本的出峰先后顺序；在各区间内针对胆汁酸代谢组分中同分异构提的分离度以及出峰间隔均匀性双目标进一步优化调整流动相变化速率，最终实现全区间胆汁酸均能较好分离同时整体分离时间较短的目的。

同时分离度也同时受到反相色谱柱填料(固定相)、柱温的影响，需针对整体色谱条件，即反相色谱柱、柱温、洗脱梯度同时做优化，优选方案控制胆汁酸同分异构体的分离度大于1.0，整体分离时间不超过20分钟，实现了胆汁酸中同分异构体代谢组分高通量定量检测的突破。

以下为实施例：

实施例1

一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，具体如下：

采用反向高效液相色谱梯度洗脱法，反相色谱柱采用agilentzorbaxeclipseplusc18(2.1×100mm，1.8μm)；柱温45℃。

其流动相系统为：a相为含有质量分数0.005％甲酸的超纯水；b相为含有质量分数0.005％的甲酸。

洗脱方案如下：起始流动相中b相的体积比例为26％，在t-α-mca峰至gudca峰之间，本实施例为第0至7分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率为每分钟0.86％，第7分钟流动相中b相体积比例增加至32％；在ghdca峰至iso-dca峰之间，本实施例为第7至12分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率为7.6％，第12分钟升至70％；在iso-lca峰至lca峰之间，本实施例为第12至13分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率大于或等于25％，第13分钟b相体积比例增加至95％，并在第13至16分钟，95％b冲洗色谱柱，柱子的再平衡时间为2分钟，流速为0.6ml/min。

实施例2

一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，具体如下：

采用反向高效液相色谱梯度洗脱法，反相色谱柱采用agilentzorbaxeclipseplusc18(2.1×100mm，1.8μm)；柱温40℃。

其流动相系统为：a相为含有质量分数0.001％甲酸的超纯水；b相为含有质量分数0.001％的甲酸。

洗脱方案如下：起始流动相中b相的体积比例为25％，在t-α-mca峰至gudca峰之间，本实施例为第0至8分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率为每分钟0.75％，第8分钟流动相中b相体积比例增加至31％；在ghdca峰至iso-dca峰之间，本实施例为第8至12分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率为7.25％，第12分钟升至60％；在iso-lca峰至lca峰之间，本实施例为第12至13分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率为35％，第13分钟b相体积比例增加至95％，并在第13至16分钟，95％b冲洗色谱柱，柱子的再平衡时间为2分钟，流速为0.6ml/min。

实施例3

一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，具体如下：

采用反向高效液相色谱梯度洗脱法，反相色谱柱采用agilentzorbaxeclipseplusc18(2.1×100mm，1.8μm)；柱温50℃

其流动相系统为：a相为含有质量分数0.01％甲酸的超纯水；b相为含有质量分数0.01％的甲酸。

洗脱方案如下：起始流动相中b相的体积比例为27％，在t-α-mca峰至gudca峰之间，本实施例为第0至7分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率为每分钟0.57％，第7分钟流动相中b相体积比例增加至31％；在ghdca峰至iso-dca峰之间，本实施例为第7至12分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率为6.8％，第12分钟升至65％；在iso-lca峰至lca峰之间，本实施例为第12至13分钟，流动相中b相体积比例逐渐增加，增加速率为30％，第13分钟b相体积比例增加至95％，并在第13至16分钟，95％b冲洗色谱柱，柱子的再平衡时间为2分钟，流速为0.6ml/min。

以上实施例为针对质谱检测的例子，采用甲酸或乙酸皆可发挥较好的改善胆汁酸峰型作用。如果针对紫外或其他检测手段，可采用其他有机酸或无机酸。

采用实施例1至3的中的方法，对胆汁酸的标准品溶液进行分离。

胆汁酸的标准品溶液成分如表一所示：

表一32种胆汁酸的标准品溶液成分表

实施例1检测结果如图1所示，实施例2检测结果如图2所示，实施例3检测结果如图3所示。32种胆汁酸包括8类同分异构体，每一类同分异构体包括2～6种，均能实现有效色谱分离。本领域常用分离度r作为总分离效能指标，r等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，r值越大，分离效果越好，当r＝1时认为两色谱峰基本分离，当r≥1.5时认为两色谱峰完全分离。分别统计本实施例和现有技术1～5的检测结果(色谱图)中相同种类同分异构体胆汁酸的r值(见表二)，r值均根据色谱图中的保留时间和峰宽计算而得，可以发现本实施例的r值均显著高于现有技术，达到定量检测要求。

实施例1至实施例3的方法，胆汁酸代谢组分的总体分离时间为13分钟，满足高通量检测需求。

实施例1至3分离方法与现有的分离方法分离效果对比如表二所示：

表二实施例1至3的分离效果对比图

32种胆汁酸包括8类同分异构体，每一类同分异构体包括2～6种，均能实现有效色谱分离。本领域常用分离度r作为总分离效能指标，r等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，r值越大，分离效果越好，当r＝1时认为两色谱峰基本分离，当r≥1.5时认为两色谱峰完全分离。分别统计本实施例和现有技术1～5的检测结果(色谱图)中相同种类同分异构体胆汁酸的r值(见表二)，r值均根据色谱图中的保留时间和峰宽计算而得，可以发现本实施例的r值均显著高于现有技术，达到定量检测要求。

实施例1至实施例3的方法，胆汁酸代谢组分的总体分离时间为13分钟，满足高通量检测需求。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。