一种具有柔弹性的生物传感器及其应用的制作方法

本发明涉及生物传感器技术领域，更具体地，涉及一种具有柔弹性的生物传感器及其应用。

背景技术：

随着现代人们生活水平的提高和人口老龄化问题的加剧，人体自身生理生化多指标的即时检测和长期监测技术受到了越来越广泛的关注；发展可穿戴生物医学传感器件，实时监测人体生理生化信号，在日常健康管理、卫生保健及诊疗康复等多个领域中具有重要价值和巨大需求；尽管近年来可穿戴设备在监测人体生命体征如心率等方面取得了一定进展，但是总体而言，目前的可穿戴传感器检测指标单一、检测效率低下，同时检测通量不够，利用已有的生物芯片虽可实现高通量检测，但仍存在较多问题，如生物芯片设备制造成本高、检测过程需额外配设信号检测元件，以及传感器柔弹性较差，难以与皮肤良好接触和实时采集信号等。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于克服上述不足之处，提供一种具有柔弹性的生物传感器及其应用。

本发明的技术方案为：

一种具有柔弹性的生物传感器，包括工作电极；所述工作电极包括柔弹性导电复合膜基底，以及固定在柔弹性导电复合膜基底表面的酶；所述柔弹性导电复合膜基底由导电纳米体和柔弹性载体组成。

本发明采用的导电纳米体具有大的比表面积、优良的导电性，柔弹性载体具有优良的可塑性，能够制成各种形状，从而有效提高柔弹性导电复合膜的导电性、延展性和生物相容性。

进一步的，所述导电纳米体和柔弹性载体的质量比为1:9~9:1，所述柔弹性导电复合膜的柔弹性、导电性可根据导电纳米体和柔弹性载体的质量比例进行调整。

进一步的，所述酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、乙醇氧化酶和胆固醇氧化酶中的一种以上。

进一步的，所述导电纳米体的材料包括金纳米材料、银纳米材料和碳纳米材料中的一种以上。

进一步的，所述柔性载体包括乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚二甲基硅氧烷。

进一步的，所述工作电极采用如下步骤制备：

s1、将导电纳米体和柔弹性载体分别均匀分散于良溶剂中，混合、持续超声0.5~1h，获得导电墨水，通过自组装得到柔弹性导电复合膜基底；

s2、在柔弹性导电复合膜基底表面滴加25~100μl含有酶的溶液，4~10ºc下放置1.5~2h，经交联反应后酶固定在柔弹性导电复合膜基底表面，制得所述工作电极。

其中，常用的良溶剂为二甲苯、环己烷。

本发明的柔弹性导电复合膜基底生物相容性好，可有效保持固载酶的生物活性。

本发明还提供了一种具有柔弹性的生物传感器在制备可穿戴生物电子设备中的应用。

进一步的，所述可穿戴生物电子设备应用于生物电信号、生理生化信号的采集。

进一步的，所述生理生化信号包括葡萄糖浓度、乳酸浓度、乙醇浓度和胆固醇浓度。

本发明提供的一种具有柔弹性的生物传感器，采用三电极体系(包括工作电极、对电极和参比电极)，或者两电极体系(工作电极和对电极)。所述对电极采用但不限于铂电极或碳电极，所述参比电极采用但不限于ag/agcl电极或者饱和甘汞电极。

本发明提供的具有柔弹性的生物传感器的工作原理为：柔弹性导电复合膜基底表面固定的生物酶与待测底物发生催化反应，期间存在电子传递，导致电极体系电流发生变化，待测底物浓度越大，电流越大，通过检测电流的变化量可间接计算出待测底物的浓度。

本发明提供的具有柔弹性的生物传感器可用于检测可被柔弹性导电复合膜基底表面固定的酶特异性催化的底物，如柔弹性导电复合膜基底表面固定的是辣根过氧化物酶，可催化的底物为过氧化氢，那么该生物传感器可应用于检测过氧化氢浓度；如柔弹性导电复合膜基底表面共同固定葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶，可催化的底物为葡萄糖，那么该生物传感器可应用于检测葡萄糖浓度；本发明的具有柔弹性的生物传感器，所固定的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、乙醇氧化酶和胆固醇氧化酶。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明采用导电纳米体和柔弹性载体在室温下通过疏水作用相互缠绕自组装制得柔弹性导电复合膜，表面为致密均一的三维多孔结构，具有较高的导电性，其导电性通过线性扫描伏安法进行测定，其柔弹性通过弯曲、折叠、扭曲和打结等方式进行表征，将其切割成柔弹性电极，可实现对生物电信号（如肌电信号）的高灵敏采集，具有成本低、易于加工等特点，容易进行工业化生产和商品化推广。

2、本发明采用导电纳米体和柔弹性载体制备的柔弹性导电复合膜，以该柔弹性导电复合膜为基底，酶经过交联反应吸附、固定在基底表面，并发生直接电子转移，实现生理生化信号的直接高灵敏采集，具有检测方法简单、无须标记、抗干扰能力强、灵敏度高（如，在过氧化氢检测时，在0.1mm~1mm浓度范围内其线性灵敏度可达2mamm^-1cm^-2，响应时间为2~3s）、不需要外加媒介体等优点，能够用于制备可穿戴生物电子设备并广泛应用在生物医学检测、健康监控、环境预警等领域。

附图说明

图1为本发明的柔弹性碳纳米管复合膜的扫描电子显镜(sem)照片；

图2为本发明采用柔弹性碳纳米管复合膜用于采集肌电信号的图像；

图3为本发明的具有柔弹性的生物传感器在连续加入0.1mm过氧化氢溶液时的时间-电流响应（a）及检测曲线（b）；

图4为本发明的具有柔弹性的生物传感器在连续加入0.1mm葡萄糖溶液时的时间-电流响应（a）及检测曲线（b）；

图5为本发明的具有柔弹性的生物传感器用于汗液中的葡萄糖浓度检测的时间-电流响应（a）及检测曲线（b）；

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征更易被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚的界定。

实施例1

本实施例提供了一种具有柔弹性的生物传感器，为三电极或两电极体系，包括工作电极；所述工作电极包括柔弹性导电复合膜基底，以及固定在柔弹性导电复合膜基底表面的酶；所述柔弹性导电复合膜基底由碳纳米管和乙烯-醋酸乙烯共聚物组成。

本实施例的生物传感器用于不同目标物的特异性检测，采用循环伏安法测量。

本实施例中，工作电极采用如下步骤制备：

称取碳纳米管（cnts）和乙烯-醋酸乙烯共聚物（evac）的质量分别为300mg和450mg，室温（25~30°c）下分别分散于二甲苯溶剂中，持续超声1h，获得均一的导电墨水，将上述导电墨水倒入平整的玻璃培养皿中，置于通风橱内室温（25~30°c）下过夜挥发除去溶剂，即可获得大面积均一的柔弹性碳纳米管复合膜，如图1为柔弹性碳纳米管复合膜的扫描电子显微镜(sem)照片，由照片可知，具有均匀致密的三维孔状结构。

将柔弹性碳纳米管复合膜切割成1cm²的柔弹性电极，并加工出导线结合部位，取上述结合有导线的柔弹性电极3枚，均匀涂上导电凝胶，2枚置于所测肌肉的肌腹位置处（如肱二头肌、肱三头肌、桡侧屈肌、胫骨前肌等），另1枚置于肌肉末端的关节处，用医用胶带贴紧；上述3枚电极与肌电信号采集仪连接，打开肌电测试程序，分别测试肌肉舒张与收缩时的肌电信号，如图2，为采用柔弹性碳纳米管复合膜用于采集肌电信号的图像，实现了对肌电信号的高灵敏采集，响应时间小于0.5s。

实施例2

本实施例与实施例1相同，进一步的，实现辣根过氧化物酶的固定和直接电子转移反应，用于检测溶液环境中过氧化氢浓度。

以柔弹性碳纳米管复合膜为基底，采用戊二醛交联法进行辣根过氧化物酶的负载，具体的，在其表面滴加25μl辣根过氧化物酶-戊二醛混合溶液，其中，混合溶液中辣根过氧化物酶浓度为5mg/ml，戊二醛浓度为2.5%，4°c下放置2h后，用去离子水冲洗表面，除去未吸附的辣根过氧化物酶，制得辣根过氧化物酶修饰电极；

以上述辣根过氧化物酶修饰电极为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，0.1m磷酸盐缓冲溶液（ph=7）为电解液，三电极连接至电化学工作站，进行电化学测试。

在0vvs.ag/agcl工作电压条件下，每隔20s向磷酸盐缓冲溶液中加入过氧化氢溶液，使得过氧化氢浓度每次上升0.1mm，利用电流-时间模式测定上述辣根过氧化物酶传感器对过氧化氢标准溶液的电流响应（参见图3a）和工作标准曲线（参见图3b），实现了过氧化氢浓度范围为0.1~1mm的线性检测，其线性灵敏度为2macm^-2mm^-1,响应时间为2~3s。

实施例3

本实施例与实施例1相同，进一步的，将葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶共同固定在柔弹性碳纳米管复合膜表面，用于检测溶液环境中葡萄糖浓度，因葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应产生过氧化氢，过氧化氢通过辣根过氧化物酶特异性地在电极表面还原，进而引起体系电流的变化，葡萄糖浓度越大，电流越大，通过检测电流的变化量可间接计算出葡萄糖浓度。

以柔弹性碳纳米管复合膜为基底，采用戊二醛交联法进行葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶的负载，具体的，在其表面滴加100μl葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-戊二醛混合溶液，其中，混合溶液中葡萄糖氧化酶浓度为2.5mg/ml，辣根过氧化物酶浓度为0.25mg/ml，戊二醛浓度为2.5%，10°c下放置1.5h后，用去离子水冲洗表面，除去未吸附的葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶，制得葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶双酶修饰电极；

以上述葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶双酶修饰电极为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，0.1m磷酸盐缓冲溶液（ph=7）为电解液，三电极连接至电化学工作站，进行电化学测试。

在0vvs.ag/agcl工作电压条件下，每隔20s向磷酸盐缓冲溶液中加入葡萄糖溶液，使得葡萄糖浓度每次上升0.1mm，利用电流-时间模式测定上述葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶双酶传感器对葡萄糖标准溶液的电流响应（参见图4a）和工作标准曲线（参见图4b），实现了葡萄糖浓度范围为0.1mm~1mm的线性检测，其线性灵敏度为250μacm^-2mm^-1，响应时间为3~5s。

实施例4

本实施例与实施例1相同，进一步的，用于检测人工汗液中葡萄糖浓度。

以柔弹性碳纳米管复合膜为基底，采用戊二醛交联法进行葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶的负载，具体的，在其表面滴加60μl葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-戊二醛混合溶液，其中，混合溶液中葡萄糖氧化酶浓度为2.5mg/ml，辣根过氧化物酶浓度为0.25mg/ml，戊二醛浓度为2.5%，7°c下放置1.5h后，用去离子水冲洗表面，除去未吸附的葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶，制得葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶双酶修饰电极；

以上述葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶双酶修饰电极为工作电极，ag/agcl导电泥浆印刷电极为参比电极，无酶修饰的柔弹性碳纳米管复合膜为对电极，制备可穿戴柔弹性生物传感器，实现人工汗液中葡萄糖浓度的无试剂检测；

在0vvs.ag/agcl工作电压条件下，利用电流-时间模式测定上述可穿戴柔弹性生物传感器对含有不同葡萄糖浓度（分别为0mm，0.1mm，0.2mm，0.3mm，0.4mm，0.6mm，0.8mm）的人工汗液（0.1%尿素，0.5%nacl，0.1%乳酸，ph~6.5）的时间-电流响应（参见图5a）和检测曲线（参见图5b），实现了对汗液中葡萄糖浓度范围为0.1mm~0.8mm的线性检测，其线性灵敏度为80μacm^-2mm^-1。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。