一种神经黑色素样纳米材料及其制备方法和用途与流程

本申请属于应用化学领域，具体来讲，涉及一种制备黑色素样纳米材料及其制备方法和用途。

背景技术：

神经黑色素(nm)是一种在大脑部分发现的色素，例如黑质。它由中枢神经系统(cns)中的多巴胺(da)产生，能够保护大脑免受氧化应激，它的产生与帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关。与在珠被中发现的外周黑色素不同，nm不具有明确的颗粒形状，并且更难提取或纯化。此外，nm是一种更复杂、异质的黑色素和蛋白质结构。

da是哺乳动物中枢神经系统中最重要的单胺类神经递质之一，它调节了广泛的复杂过程，包括运动控制、注意力程度以及强化学习。在体外，da可以在碱性条件下自我聚合形成荧光聚多巴胺(合成黑色素)纳米颗粒，所述碱性条件是通过氧化h2o2或还原碱如nh3·h2o、naoh或三(羟甲基)-氨基甲烷(tris)提供的。生物组织中不存在这些碱基，研究人员仍需要使用生物相容性试剂合成黑色素这样的替代方法来用于体内应用。

在大脑中，l-精氨酸、l-赖氨酸、l-组氨酸和da作为化学信使，属于超平衡神经递质复合物，用以维持正常的大脑功能。了解这些碱性氨基酸催化人体内da的氧化，特别是在大脑中的氧化，对于阐明体内da氧化和提供nm的新合成途径是非常重要的。

技术实现要素：

本发明的发明人研究了多巴胺与20种氨基酸的反应，并成功证明了碱性氨基酸促进da转化为神经黑色素样纳米颗粒(nm-nps)。具体来讲，发明人选择l-赖氨酸作为模型碱性氨基酸来制备尺寸可控的nm-np(5-160nm)。当nm-np的尺寸为5nm左右并且其荧光可以被铅离子选择性地猝灭时，它们显示出强荧光，因此nm-np可以用作多功能探针以监测其降解并检测铅离子。该发明不仅扩展了人们对da自聚合的理解，而且为监测大脑中神经毒性铅离子提供了一条新途径。

本发明的一方面提供了一种神经黑色素样纳米材料，所述神经黑色素样纳米材料的含有碱性氨基酸和多巴胺，

所述神经黑色素样纳米材料的粒径为5nm～160nm；

优选地，所述神经黑色素样纳米材料的粒径为5nm～40nm。

优选地，所述多巴胺可以是盐酸多巴胺，其他多巴胺物质还可以是甲肾上腺素等类似物。

在优选的实施方式中，所述神经黑色素样纳米材料的红外光谱图上至少包括以下峰：

波长200至500nm的峰；

波数3300～3500cm^-1的峰；

波数1600～1650cm^-1的峰；

波数1050～1100cm^-1的峰。

需要理解的是，以上示出的特征峰仅为根据优选实施例的神经黑色素样纳米材料的特征峰，在其他的优选实施例中，特征峰可能超出该范围。

在优选的实施方式中，当所述神经黑色素样纳米材料的粒径为5nm时，所述神经黑色素样纳米材料在430nm波长的光激发下，在505nm～515nm处存在荧光发射峰。

本发明的另一方面提供了一种制备神经黑色素样纳米材料的方法，所述方法至少包括以下步骤：

1)将碱性氨基酸溶解在水溶液中，获得溶液i；

2)向所述溶液i中加入多巴胺，低速离心去除沉淀物，获得溶液ii；

3)对所述溶液ii进行高速离心，分离上清液后获得神经黑色素样纳米材料。

在优选的实施方式中，所述碱性氨基酸的浓度为0.01至10mg/ml；

优选地，所述碱性氨基酸的浓度为0.08至2.8mg/ml。

在优选的实施方式中，所述多巴胺为盐酸多巴胺，所述盐酸多巴胺的浓度为1至10mgml^-1；

优选地，所述碱性氨基酸与盐酸多巴胺的比例为1：1至1：10。

在优选的实施方式中，所述盐酸多巴胺与溶液i的反应时间为3至24小时；

优选地，所述低速离心的速度为2500～5000rpm，所述高速离心的速度为8000～12000rpm。

在优选的实施方式中，所述沉淀物的分子质量高于8000da。

在优选的实施方式中，在所述步骤3)中，分离上清液后还包括用去离子水洗涤以及将产物冷冻干燥的步骤。

本发明的又一方面提供了一种黑色素样纳米材料的应用，所述黑色素样纳米材料用于检测pb²⁺。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请所提供的制备神经黑色素样纳米材料的方法，可以有效地调整黑色素样纳米颗粒的尺寸。

2)本申请所提供的制备神经黑色素样纳米材料的方法，简单并易于操作。

3)本申请所提供的神经黑色素样纳米材料，可以应用于pb²⁺检测中。

附图说明

图1a是示出了由da和his(his-nm)形成的黑色素不具有良好控制的形态的透射电镜图；图1b和图1c分别为示出了arg-nm和lys-nm形成的黑色素呈球形的透射电镜图。

图2示出了以lys-nm作为模型系统来表示nm-np的合成机理和性质。

图3a为实施例1的nm-np的傅里叶变换红外光谱，示出了np具有200至500nm的宽吸收，图3b示出nm-np在3300-3500cm^-1、1620cm^-1和1089cm^-1处显示出三个主要条带。

图4示出了da通过l-赖氨酸质子化氧化来产生nm-np的反应步骤。

图5a示出了l-赖氨酸浓度和反应时间是调节nm-nps大小的关键。将l-赖氨酸浓度从0.15mg/ml增加至2.6mg/ml，nm-np从95nm降低至5nm，结果如图5a所示，并且nm-np的产率保持不变。此外，当反应时间从3小时增加到24小时时，nm-np的尺寸从95nm增加到160nm，结果如图5b所示。

图6示出了直径为5nm的nm-np的荧光特性。

图7a示出了当使用430nm的激发波长时，5nmnm-np的发射峰在510nm处；图7b示出发射强度取决于激发波长，它最初随着波长的增加而增强，然后开始逐渐减小；图7c和7d示出了nm-np的荧光强度随着其浓度增加而增加。

图8a和8b分别示出，在与h2o2反应12小时后，nm-np的荧光逐渐增加。

图9是证实了nm-np降解的tem图。

图10a显示出pb²⁺可以诱导显著的荧光猝灭，而其他金属离子不会明显改变nm-np的荧光强度；图10b示出随着pb²⁺浓度的增加，nm-np的荧光降低；图10c显示校准曲线显示与pb²⁺浓度(0-50μgl^-1)的线性关系，检测限为2μgl^-1。

图10d示出nm-np良好的生物相容性。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，实施例中使用的原料均来自商业购买，未经处理直接使用；所使用仪器，均采用厂家推荐参数使用。

实施例中，da·hcl、fmoc-lys(me,boc)-oh以及20种氨基酸(包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸)购自sigmaaldrich。

实施例中，通过malvernzetasizernanozs仪器(malvern，uk)使用动态光散射(dls)方法测量nm-np的大小。通过透射电子显微镜(tem)(feitecnaimultipurposetem，thermofisherscientific，usa)表征nm-np的形态。傅里叶变换红外光谱(ftir)(thermofisherftir6700)用于表征化学结构，uv-visnanodrop2000c光谱(thermofisherscientific，usa)用于测量样品的吸收。荧光光谱从荧光分光光度计(horibajobinyvon，fluorolog-3)获得。

实施例1nm-nps的合成与修饰

nm-np的合成和表征

具体的实验条件为，在25℃搅拌的条件下，将8mg的l-赖氨酸完全溶解在95ml水溶液中1小时。在搅拌下将5mlda·hcl(4mgml^-1)缓慢注入上述溶液中。3小时后，通过低速离心(4,000rpm)除去所有大的沉淀物，然后通过高速离心(10,000rpm)分离上清液并用去离子水洗涤三次。将产物在冷冻干燥器中干燥12小时。用乙醇和去离子(di)水洗涤数次后得到nm-np。

按照l-赖氨酸相同的条件，将上述其余19种氨基酸进行试验，藉此研究了20种氨基酸是否在水溶液中直接与da反应。结果显示，只有当添加碱性氨基酸(组氨酸、精氨酸和赖氨酸)时，溶液变深然后变黑。考虑到这种合成过程类似于大脑中da转化为nm，因此将产物命名为nm-nps。由da和his(his-nm)形成的黑色素不具有良好控制的形态，如图1a所示，另外两种类型(arg-nm和lys-nm)显示出球形，结果如图1b和图1c所示。

由于lys-nm的良好形态和相对简单的赖氨酸化学结构，我们使用lys-nm作为模型系统来表示nm-np的合成机理和性质，如图2所示。

与在300nm处具有尖锐吸收峰的da相比，nm-np具有200至500nm的宽吸收，如图3a所示。nm-np显示宽带ir光谱。nm-nps与l-赖氨酸和da不同，表明nm-nps是一种新的聚合物材料。nm-np在3300-3500cm^-1、1620cm^-1和1089cm^-1处显示出三个主要条带，如图3b所示。3300-3500cm^-1峰来自nh(～3300cm^-1)和吲哚或吡咯中的oh伸缩(～3400cm^-1)；c＝o拉伸碳酸盐基团为1620cm^-1，c＝n和/或c＝c芳环振动；来自c-o伸缩振动和/或c-h振动的1089cm^-1。nm-nps与合成黑色素在化学上不同，合成黑色素在1089cm^-1处没有峰，可能是由于l-赖氨酸与da反应。

为了理解l-赖氨酸和da形成nm-np的反应，我们用l-赖氨酸的三种化学类似物(例如，f-moc-lys(me，boc)-oh、n-ε-乙酰基-l-赖氨酸和n-α-乙酰基-l-赖氨酸)取代l-赖氨酸。在反应中发现，相同条件下没有颜色变化。da通过l-赖氨酸(碱性氨基酸)质子化，并且在合成条件下发生自动氧化以产生nm-np，反应步骤如图4所示。在反应过程中，溶液的ph值从9.2降至8.0。当为氨基被阻断的l-赖氨酸类似物(即n-ε-乙酰基-l-赖氨酸，n-α-乙酰基-l-赖氨酸和f-moc-lys(me，boc)-oh)的情况时，我们在溶液中既观察不到颜色变化又不形成纳米颗粒。这表明l-赖氨酸中的两个氨基对于nm-np的制备是至关重要的。l-赖氨酸的游离胺通过“提供”可用的孤对电子而作为亲核试剂。da的反应位点主要不是氮，而是儿茶酚部分。由于来自儿茶酚的电子给予效应，芳环富含电子且更容易氧化而产生邻醌产物。该氧化反应在一定程度上取决于ph，但主要取决于活性氧物质的存在。在醌部分上的反应位点发生氧化后，它可以作为亲核试剂并通过迈克尔加成反应通过伯氮对吲哚产物的攻击产生吲哚单元(吲哚醌)。吲哚醌很容易通过席夫碱反应(l-赖氨酸-吲哚酮)与l-赖氨酸的nh2结合，并进一步聚合成nm-np(l-赖氨酸-吲哚醌的高级低聚物)。

实施例2nm-nps的稳定性的测定

制备三瓶2.0mlnm-nps水溶液，浓度均为0.1wt％。在小瓶1中，添加10μlh2o2(体积比为30％)；在小瓶2中，在50mmpbs(ph6.5)和10μlh2o2(30％)中加入10μl0.1mgml^-1辣根过氧化物酶vi型(sigmaaldrich)。样品瓶3是一个无任何添加的对照。将所有三个小瓶加盖并通过磁力搅拌器以250rpm在25℃下搅拌。温育24小时后，用去离子水洗涤样品并以10,000rpm离心。使用tem和dls来研究nm-np的大小变化。

l-赖氨酸浓度和反应时间是调节nm-nps大小的关键。将l-赖氨酸浓度从0.15mg/ml增加至2.6mg/ml，nm-np从95nm降低至5nm，结果如图5a所示，并且nm-np的产率保持不变。此外，当反应时间从3小时增加到24小时时，nm-np的尺寸从95nm增加到160nm，结果如图5b所示。

为了研究nm-np的荧光性质，制备了不同尺寸的nm-np。直径为5nm的nm-np是荧光的，如图6所示，但是对于40nm纳米颗粒或任何更大的纳米颗粒没有观察到荧光。对于5nmnm-np，当使用430nm的激发波长时，发射峰在510nm处，如图7a所示。发射强度取决于激发波长，它最初随着波长的增加而增强，然后开始逐渐减小，如图7b所示。nm-np的荧光强度随着其浓度，如图7c-7d所示，从0增加到0.24mgml^-1而增加。

黑色素在体内和体外都是一种强大的抗氧化剂。为了促进我们对nm抗氧化剂行为的理解，我们研究了nm-nps的降解特性。在与h2o2反应12小时后，nm-np的荧光逐渐增加，如图8a-8b所示，表明nm-np减少至小于40nm。48小时后，由于h2o2完全降解，其荧光消失。tem也证实了nm-np的降解，如图9所示。

实施例3选择性检测pb²⁺

在去离子水中制备pb²⁺、cd²⁺、hg²⁺、cu²⁺、mn²⁺、mg²⁺、k¹⁺和na¹⁺的储藏液。将pb²⁺(10μl，1-5000μgl^-1)和其他金属离子(10μl，3000μgl^-1)与990μl0.1μgml^-1的nm-np在25℃下在1分钟内分别混合。在430nm(λex＝430nm)的激发波长和510nm(λem＝510nm)的发射波长下记录所得溶液的荧光光谱。

我们假设nm-nps可以作为黑色素与金属离子结合。为了证实nm-nps的特异性，我们用30μgl^-1的7种金属离子(cd²⁺、hg²⁺、cu²⁺、mn²⁺、mg²⁺、k¹⁺和na¹⁺)追踪荧光变化。

pb²⁺可以诱导显著的荧光猝灭，而其他金属离子不会明显改变nm-np的荧光强度，如图10a所示。这表明唯一的pb²⁺可以有效地与nm-np结合，因此nm-np可以用于检测pb²⁺。此外，随着pb²⁺浓度的增加，nm-np的荧光降低，如图10b所示。校准曲线显示与pb²⁺浓度(0-50μgl^-1)的线性关系，检测限为2μgl^-1，如图10c所示。在人体内，低浓度(10μgl^-1)的pb²⁺会引发行为问题，干扰大脑发育，并减缓神经传导速度。使用nm-np作为铅检测剂是实用的并且具有生物相容性的，该方法与光纤探针方法的分辨率相当。

实施例4细胞毒性测定

在dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中培养人表皮角质形成细胞(成体，heka细胞)，其中补充有10％胎牛血清(fbs，gibco)，80uml^-1青霉素和0.08mgml^-1链霉素。为了测定nm-np的细胞毒性，将heka细胞接种在密度为10⁴个细胞/孔的96孔板中。将nm-np分散在不含fbs的dmem中，加入到具有一系列浓度(0、20、40、80和160μgml^-1)的heka细胞中。温育24小时后，用100μl/孔的噻唑基蓝四唑溴化物(mtt)溶液(keygenbiotech)替换细胞上清液，并再孵育4小时。弃去上清液并加入dmso。通过微量滴定板读数器(multiskango)测量550nm处的光密度。

为了进一步验证nm-np在生物医学科学中的潜在用途，我们通过测试与nm-np孵育24小时后heka细胞的活力来评估nm-np的细胞毒性。当浓度低于40μgml^-1时，超过95％的细胞存活，如图10d所示。当nm-np的浓度达到80μgml^-1及以上时，观察到细胞活性的轻微抑制。然而，即使浓度达到160μgml^-1，细胞存活率仍保持在80％以上，表明相对良好的生物相容性。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。