一种驴骨胶特征性多肽及其在检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分中的应用的制作方法

本发明涉一种驴骨胶特征性多肽及其应用，还涉及动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的检测方法，本发明属于医药与食品检测技术领域。

背景技术：

动物胶为由动物的皮、骨等熬制而成胶类物质，在食品、保健品和药品中有着广泛的应用。动物皮胶常见的包括阿胶、黄明胶、猪皮胶等，在临床应用上各有特点，需用规定原料熬制，比如阿胶由驴皮熬制、黄明胶由牛皮熬制等，否则将视为伪品。因各种胶外观非常相似，而且价格差别很大，因此除了各种胶容易混淆外，市场上还出现了造假、制假的不法分子。以阿胶为例，在生产阿胶时，部分用其他动物皮包括马皮、牛皮、猪皮等，也有用驴骨来取代驴皮进行假阿胶的熬制，从而谋取非法利益。

随着质谱检测技术的发展，逐渐产生了动物皮类样品中驴、马、牛、猪、羊源性成分的检测方法，它们都是基于不同动物的ⅰ型胶原蛋白中氨基酸序列的不同，寻找特征性多肽进行检测。但是对于动物皮胶与骨胶的鉴别区分仍存在很大困难，比如阿胶与驴骨胶，它们的成分相近，ⅰ型胶原蛋白序列相同，因此无法采用以前的方法进行鉴别区分。

因此，迫切需要提出一种能够快速、准确检测动物皮胶及其制品中驴骨胶含量的方法，进而实现对动物皮胶及其制品，尤其是阿胶产品的真伪鉴别。

技术实现要素：

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题，提供一种驴骨胶特征性多肽，并建立针对动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的检测方法，该方法操作简单，灵敏度高，不但能鉴定是否含有驴骨胶成分，而且还能准确定量。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

首先，本发明提出了一种驴骨胶特征性多肽，所述的驴骨胶特征性多肽的氨基酸序列为gly-glu-hyp-gly-gly-ala-gly-pro-val-gly-pro-hyp-gly-glu-arg(seqidno.1所示，其中xaa＝hyp)。

进一步的，本发明还提出了所述的驴骨胶特征性多肽在检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分中的应用。

其中，优选的，本发明通过液质联用仪对所述的骨胶特征性多肽进行检测，进而来判定动物皮胶及其制品中是否含有驴骨胶成分。

更进一步的，本发明还提出了一种检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的方法，当检测样品为动物皮胶时，包括以下步骤：

将待测的动物皮胶用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解液注入液质联用仪，采用二级质谱模式，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对进行mrm检测，对照品为驴骨胶纯品或是以待检测的阴性样品为基质，通过加入上述的驴骨胶特征性多肽制备而成；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有驴骨胶成分，其含量可根据对照品的峰面积计算。

当检测样品为动物皮胶制品时，包括以下步骤：

将待测的动物皮胶制品经蛋白提纯后，用胰蛋白酶进行酶切处理，取酶解液注入液质联用仪，采用二级质谱模式，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对进行mrm检测，对照品为驴骨胶纯品或是以待检测的阴性样品为基质，通过加入上述的驴骨胶特征性多肽制备而成；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有驴骨胶成分，其含量可根据对照品的峰面积计算。

其中，优选的，将待测的动物皮胶用胰蛋白酶进行酶切处理的具体操作步骤为：取0.05g待测动物皮胶样品于25ml量瓶中，用1％w/vnh4hco3溶液(ph8.0)溶解并定容，过0.22μm微孔滤膜，精密量取续滤液300μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液30μl，37℃恒温酶解过夜，获得酶解液。

其中，优选的，动物皮胶制品进行蛋白提纯以及酶切处理的具体操作为：取0.5g待测动物皮胶制品于50ml量瓶中，加适量水，超声使样品溶解完全，用水定容至刻度，取5ml加入5ml的30％v/v的三氯乙酸溶液，4℃静置30min，然后5000rpm离心5min，弃清液，沉淀物中加5ml丙酮，振荡5min，5000rpm离心5min，弃清液，沉淀物在室温下干燥15min，移入25ml量瓶中，用1％w/vnh4hco3溶液(ph8.0)溶解并定容，过0.22μm微孔滤膜，精密量取续滤液300μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液30μl，37℃恒温酶解过夜，获得酶解液。

其中，优选的，液质联用仪的检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％v/v甲酸溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱：0～25min，a95％→80％，b5％→20％。流速为0.3ml/min。以质谱仪作为检测器，电喷雾离子源(esi⁺)。

其中，优选的，所述动物皮胶包括阿胶、黄明胶、猪皮胶。

其中，优选的，所述动物皮胶制品包括由动物皮胶制成的食品、保健品或药品。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提出了一种驴骨胶特征性多肽(gly-glu-hyp-gly-gly-ala-gly-pro-val-gly-pro-hyp-gly-glu-arg)，该多肽为驴骨胶特有，而阿胶、黄明胶、猪皮胶等动物皮胶则不含，基于该驴骨胶特征性多肽，本发明选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对，其中选择m/z683.7→590.5作为定量离子对，通过液质联用仪对该多肽进行检测，实现了对动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的快速鉴别检测，而且还可以对驴骨胶成分进行准确定量。本发明的方法特征性强，灵敏度高，操作简单，为检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的检测提供了有效技术手段。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1是四种纯品胶mrm扫描模式下选择离子对m/z683.7→590.5，628.5，826.4监测的质谱图；

图2是加入5％驴骨胶的混合胶mrm扫描模式下选择离子对m/z683.7→590.5，628.5，826.4监测的质谱图；

图3是不同浓度驴骨胶的混合胶mrm扫描模式下选择离子对m/z683.7→590.5监测的质谱图；

图4是阿胶制品(以阿胶补血膏为例)在mrm扫描模式下选择离子对m/z683.7→590.5，628.5，826.4监测的质谱图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

1材料和试剂

待测样品：各种纯品胶，包括驴骨胶、阿胶、黄明胶、猪皮胶，分别用驴骨、驴皮、牛皮、猪皮煎煮获得。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)。

2检测方法

取0.05g待测样品于25ml量瓶中，用1％w/vnh4hco3溶液(ph8.0)溶解并定容，过0.22μm微孔滤膜，精密量取续滤液300μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液30μl，37℃恒温酶解过夜，获得酶解液。

取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：c18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相a为0.1％v/v甲酸溶液，流动相b为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～25min，a95％→80％，b5％→20％。质谱条件：电喷雾离子源(esi⁺)，多反应监测(mrm)，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对。

结果见图1，9.7min处只有驴骨胶中检出相应的离子峰，其他均没有检出，可见该法能够特异性检测驴骨胶成分，而与其他动物皮胶成分包括阿胶、黄明胶、猪皮胶进行区分。

实施例2

1材料和试剂

待测样品：混合胶样品由实施例1中的纯品胶样品分别加入5％w/w驴骨胶制成，包括含5％w/w驴骨胶的阿胶、含5％w/w驴骨胶的黄明胶、5％w/w驴骨胶的猪皮胶。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)。

2检测方法

取0.05g待测样品于25ml量瓶中，用1％w/vnh4hco3溶液(ph8.0)溶解并定容，过0.22μm微孔滤膜，精密量取续滤液300μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液30μl，37℃恒温酶解过夜，获得酶解液。

取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：c18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相a为0.1％v/v甲酸溶液，流动相b为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～25min，a95％→80％，b5％→20％。质谱条件：电喷雾离子源(esi⁺)，多反应监测(mrm)，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对。

结果见图2，9.7min处加入5％w/w驴骨胶的混合胶样品中均检出相应的离子峰，而实施例1中的纯品阿胶、黄明胶、猪皮胶中均没有检出相应的离子峰。可见该法能够特异性检测混入驴骨胶成分的动物皮胶。

实施例3

1材料和试剂

动物胶样品：驴骨胶、阿胶分别用驴骨、驴皮煎煮获得。

混合胶样品：含5％w/w驴骨胶的阿胶、10％w/w驴骨胶的阿胶、20％w/w驴骨胶的阿胶、40％w/w驴骨胶的阿胶，由上述纯品胶精确混合制成。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)。

2检测方法

取0.05g待测样品于25ml量瓶中，用1％w/vnh4hco3溶液(ph8.0)溶解并定容，过0.22μm微孔滤膜，精密量取续滤液300μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液30μl，37℃恒温酶解过夜，获得酶解液。

取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：c18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相a为0.1％甲酸溶液，流动相b为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～25min，a95％→80％，b5％→20％。质谱条件：电喷雾离子源(esi⁺)，多反应监测(mrm)，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对，其中选择m/z683.7→590.5作为定量离子对。

图3为提取m/z683.7→590.5的质谱图，由9.7min处的峰面积(aa)对驴骨胶的百分含量绘制标准曲线，线性方程y＝907819x+19561(y为峰面积，x为百分含量)，系数r²＝0.999，线性良好。可见该法能够特异性检测驴骨胶成分，而且可准确对驴骨胶成分进行定量。

实施例4

1材料和试剂

待测样品：驴骨胶、阿胶补血膏(东阿阿胶股份有限公司)、加入驴骨胶的阿胶补血膏

试剂：三氯乙酸(分析纯)、丙酮(分析纯)、碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)。

2检测方法

取0.5g待测样品于50ml量瓶中，加适量水，超声使样品溶解完全，用水定容至刻度，取5ml加入5ml的30％v/v的三氯乙酸溶液，4℃静置30min，然后5000rpm离心5min，弃清液，沉淀物中加5ml丙酮，振荡5min，5000rpm离心5min，弃清液，沉淀物在室温下干燥15min，移入25ml量瓶中，用1％w/vnh4hco3溶液(ph8.0)溶解并定容，过0.22μm微孔滤膜，精密量取续滤液300μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液30μl，37℃恒温酶解过夜，获得酶解液。

取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：c18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相a为0.1％v/v甲酸溶液，流动相b为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～25min，a95％→80％，b5％→20％。质谱条件：电喷雾离子源(esi⁺)，多反应监测(mrm)，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对，其中选择m/z683.7→590.5作为定量离子对。

结果见图4，9.7min处只有驴骨胶和加入驴骨胶的阿胶补血膏中检出相应的离子峰，其他没有检出，可见该法能够特异性检测阿胶制品中的驴骨胶成分，而与其他动物皮胶包括阿胶、黄明胶、猪皮胶进行区分。

综上所述，本发明基于驴骨胶特征性多肽

gly-glu-hyp-gly-gly-ala-gly-pro-val-gly-pro-hyp-gly-glu-arg，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对，其中选择m/z683.7→590.5作为定量离子对，采用胰蛋白酶酶切、液质联用仪对动物皮胶及其制品进行检测，不但能准确对动物皮胶及其制品与驴骨胶进行鉴别区分，而且还可以对驴骨胶成分进行准确定量。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域技术人员对本发明作的各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

序列表

<110>东阿阿胶股份有限公司

<120>一种驴骨胶特征性多肽及其在检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分中的应用

<130>klpi190750

<160>1

<170>patentin3.5

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>equusasinus

<400>1

glygluxaaglyglyalaglyprovalglyproxaaglygluarg15