一种血虚小鼠模型的脂质组学分析方法与流程

本发明属于血虚小鼠体内的内源性脂质物质变化的分析技术领域，特别涉及一种血虚小鼠模型的脂质组学分析方法。

背景技术：

血虚是指血液亏虚，脏腑、经络、形体失养，以面色淡白或萎黄，唇舌爪甲色淡，头晕眼花，心悸多梦，手足发麻，妇女月经量少、色淡、后期或经闭，脉细等为常见证候。传统中医认为血虚形成的原因主要包括失血过多，或久病阴血虚耗，或脾胃功能失常，水谷精微不能化生血液等所致。

代谢组学是通过对碳水化合物、氨基酸、有机酸、核苷酸等小分子进行系统的分析，可用于疾病差异代谢物以及疾病机制的一种研究技术。脂质组学是代谢组学的一个重要分支，是对机体的脂质系统进行综合的分析，可以用于发现疾病的差异代谢物、疾病的诊断和疾病机制的研究。目前，应用于代谢组学分析的技术多为核磁共振(nuclearmagneticresonance,nmr)和质谱(massspectrometry,ms)分析。nmr和ms是代谢组学中使用的两种主要的分析平台，应用nmr法的样本预处理相对比较简单，需要较少的样本量，使其成为一种强大的高通量技术，能够快速分析大量样本，但其灵敏度、分辨率较低，无法测量低丰度代谢物。其中液相色谱-质谱联用(liquidchromatography-massspectrometry,lc-ms)、气相色谱-质谱联用(gas-chromatography-massspectrometry,gc-ms)，与nmr相比，质谱有高特异性和灵敏度，同时与色谱的联用可以显著弥补ms的不足之处，可以更有效的寻找有差异的代谢产物。

鉴于此，本发明应用基于高效液相色谱串联高分辨质谱建立了一种快速确定血虚小鼠模型中脂质分子组成的方法，对研究血虚小鼠的脂质代谢具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述问题本发明提供了一种血虚小鼠模型的脂质组学分析方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种血虚小鼠模型的脂质组学分析方法：包括以下步骤：

步骤一，血虚小鼠模型的构建与评价；

步骤二，收集样品并处理；

步骤三，样品的色谱液相流动分离与质谱分析；

步骤四，数据分析处理与鉴定。

进一步地，所述步骤一中血虚小鼠模型的构建与评价，具体步骤如下：

第一天空白对照组皮下注射20mg/kg的无菌水，模型组别皮下注射20mg/kg的乙酰苯肼；

第四天早上空白对照组皮下注射10mg/kg的无菌水，模型组别皮下注射10mg/kg的乙酰苯肼，两个小时之后空白对照组腹腔注射20mg/kg的无菌水，模型组别腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺；

第四天到第七天空白对照组腹腔注射20mg/kg的无菌水，模型组别腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺，即获得血虚小鼠模型。将乙酰苯肼的强氧化作用与环磷酰胺的骨髓抑制作用结合起来，同时采用适当的注射量，从而建立一种更加稳定的血虚小鼠模型。

采用空白对照组与模型组小鼠的血常规、脾脏指数与胸腺指数、股骨病理切片的变化来评价血虚小鼠模型是否构建成功。通过观察血细胞、脏器指数及骨髓细胞等传统药效来确保血虚小鼠模型构建成功。

更进一步地，所述步骤二中收集样品并处理，具体步骤如下：

将收集的脾脏组织用体积分数为75％甲醇、甲基叔丁醚与超纯水在金属浴中孵育，离心取上清液浓缩，进而用异丙醇、甲醇复溶上述浓缩物，最后超声使样品完全复溶，得待测样品。超声可使得浓缩样品充分复溶，减少待测成分的损失和系统误差，确保实验的精确性及严谨性。

更进一步地，所述将收集的脾脏组织用体积分数为75％甲醇、甲基叔丁醚与超纯水在金属浴中孵育，离心取上清液浓缩，进而用异丙醇、甲醇复溶上述浓缩物，最后超声使样品完全复溶，得待测样品，具体操作为：

称取80mg脾脏组织放入2ml的ep管中，加入400μl75％甲醇，放入钢珠，匀浆后涡旋1min并加入1ml甲基叔丁基醚，之后放入25℃金属浴中震荡孵育30min，震荡速度为1500r/min，加入250μl超纯水，涡旋1min，放入25℃金属浴中震荡孵育10min，震荡速度为1500r/min，放入振荡速度为12000r/min，4℃的高速离心机离心15min，取上清800μl，完全吹干；随后加入100μl异丙醇和25％甲醇的复溶溶液，其中异丙醇与25％甲醇的体积比为1:1，之后涡旋1min，超声15min使得样品完全复溶，将秤管放入液相小瓶中，12000r/min，4℃下离心15min后取上清100μl，得待测样品。通过金属浴反复震荡孵育使提取溶液与组织充分混匀，提高代谢物的提取率；样品吹干之后涡旋、超声可使其充分溶解，确保进样的准确性。

再进一步地，所述步骤三中样品的色谱液相流动分离与质谱分析，具体步骤如下：

将所述待测样品通过色谱柱中的流动相洗脱进行分离后，然后分别在正、负离子模式下使用高分辨质谱仪进行测定，得出小鼠脾脏的质谱谱图，分析空白对照组与模型组小鼠机体脾脏中内源性代谢产物的变化。通过正负离子模式获得完整的小鼠脾脏质谱图，尽可能全面分析样本的代谢物，确保内源性脂质轮廓的完整性。

更进一步地，所述色谱柱为watersacquityuplchsst3，该色谱柱的内径为2.1mm，长度为100mm，其内的固定相颗粒粒径为1.8μm；

所述色谱柱的使用条件为：柱温35℃，流速0.2ml/min，进样量5μl，流动相梯度为：0～1.5min，32％b；

1.5～4min，32％～45％b；

4～6min，45％～58％b；

6～12min，保持58％b；

12～16min，58％～70％b；

16～17min，70％～85％b；

17～20min，保持85％b；

20～26min，85％～95％b；

26～26.5min，95％～97％b；

26.5～30min，97％～32％b；

所述流动相分为流动相a和流动相b，流动相a包括乙腈：水，5毫摩尔每升质谱级甲酸铵，0.1％甲酸＝6:4；流动相b包括异丙醇：乙腈，5毫摩尔每升质谱级甲酸铵，0.1％甲酸＝9:1，所述甲酸铵的浓度为50mm/l。通过色谱梯度分离与质谱级甲酸铵，提升分离度与离子化，快速精确对内源性脂质定性分析。

更进一步地，所述使用高分辨质谱仪进行测定的质谱条件为：采用hesi离子化方式，喷雾电压正极3.5kv，负极2.5kv，碰撞能量为12.5、25、37.5ev；加热器温度300℃，毛细管温度320℃，辅助气体积流量10arb，鞘气体积流量35arb；采集模式为正负离子切换，扫描模式采用fμllscan/dd-ms2，采集范围为100～1500m/z；分辨率采用msfμllscan35000fwhm，ms/ms17500fwhm。采用优化后的脂质物质的定性分析条件，有助于实现抑制方法覆盖尽可能多的脂质成分，实现准确、灵敏的定性。

更进一步地，所述步骤四中数据分析处理与鉴定，具体步骤如下：

使用compounddiscover软件对所有的质谱图进行处理得到积分数据，然后对小鼠模型的质谱谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，根据目标脂类分子的化学式和相对分子量，将检测数据与之对比，鉴定出血虚模型小鼠的18个差异代谢物。借助compounddiscover软件尽可能多的发现内源性脂质物质，有效帮助快速筛查复杂基质体系中的目标化合物。

更进一步地，所述使用compounddiscover软件对所有的质谱进行处理得到积分数据，然后对小鼠模型的质谱谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，根据目标脂类分子的化学式和相对分子量，将检测数据与之对比，鉴定出血虚模型小鼠的18个差异代谢物，具体操作如下：

使用compounddiscover软件对所有的质谱进行处理得到积分数据，然后对小鼠模型的质谱谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，观察pca图，空白对照组与模型组能够显著分开，表明血虚小鼠模型造模成功；然后，在pca的基础上，利用正交偏最小二乘-判别分析法opls-da对空白对照组和模型组小鼠脾脏进一步分析，采用cv-anova(p＜0.05)评价模型质量，通过载荷图对变量加载结果进行描述，利用变量重要性vip分析，s-plot相关性＞0.58并结合统计学p＜0.05获得潜在的差异代谢物，从对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量，然后对空白对照组与模型组小鼠脾脏进行uplc-ms/ms分析得出质谱图谱进行积分，最终确定了血虚模型的18个差异代谢物。通过pca图再次确证了模型构建的成功性，借助vip、s-plot分析及统计学p值迅速获得差异性的内源性脂质代谢物。与单维筛选方法比较，pca和opls-da多元统计分析方法可以筛选去除很多干扰，获得与血虚症直接相关的差异变量(生物标志物)。此外，生物机体内代谢物彼此关联,相应的变量之间也存在相互联系,有些变量甚至只有和其他变量结合在一起时才具有统计学意义或生物学意义,多维统计方法正好能够捕捉到这些单维分析认为没有意义的变量。

更进一步地，所述血虚模型的18个差异代谢物分别为：

hypoxanthine、hexadecanamide、oleamide、palmitoylcarnitine、1-heptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、bis(2-ethylhexyl)adipate、dioleoylphosphatidylethanolamine、n-stearoyl-l-tyrosine、linoleylcarnitine、1,2-di-[(9z,12z,15z)-octadecatrienoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine、1-(9z-hexadecenyl)-2-eicosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、1-[(9z)-octadecenoyl]-2-[(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-docosahexaenoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine、1-octadecanoyl-2-(4z,7z,10z,13z,16z,19z-docosahexaenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1-octadecanoyl-2-(7z,10z,13z,16z)-docosatetraenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、n-myristoylsphingosine-1-phosphocholine、n-[(13z)-docosenoyl]sphing-4-enine-1-phosphocholine、1-oleoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine和glycidylstearate。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

(1)本发明首次将高效液相色谱串联质谱检测方法应用于血虚小鼠模型脂类分子的鉴定，可完成对血虚小鼠模型快速、全面、准确的脂质组学分析；

(2)本方法前处理简单，不需要标准化合物，样品测定及分析效率高，重复性好，适用于大批样品的高通量分析。

附图说明

图1为空白对照组与模型组小鼠脾脏质谱脂质代谢物指纹谱图；

图2为是空白对照组与模型组的pca得分图；

图3为空白对照组与模型组的opls-da得分图；

图4是空白对照组与模型组的opls-da载荷图；

图5是空白对照组与模型组小鼠股骨组织病理图。

具体实施方式

本发明中血虚小鼠模型的脂质组学分析方法不需要标准品化合物，可快速完成对血虚小鼠体内内源性脂质分子精确的脂质组学分析。

步骤一，血虚小鼠模型的构建与评价，具体步骤如下：

第一天空白对照组皮下注射20mg/kg的无菌水，模型组别皮下注射20mg/kg的乙酰苯肼；

第四天早上空白对照组皮下注射10mg/kg的无菌水，模型组别皮下注射10mg/kg的乙酰苯肼，两个小时之后空白对照组腹腔注射20mg/kg的无菌水，模型组别腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺；

第四天到第七天空白对照组腹腔注射20mg/kg的无菌水，模型组别腹腔注射20mg/kg的环磷酰胺，即获得血虚小鼠模型；

分别采用空白对照组与模型组小鼠血常规、脾脏指数与胸腺指数、股骨病理切片变化评价血虚小鼠模型的方法，结果见表1、表2与图5。

表1空白对照组与模型组小鼠的血常规变化情况(means±sd)

wbc：白细胞rbc：红细胞lymph：淋巴细胞mon：单核细胞ne：中性粒细胞eo：嗜酸性粒细胞ba：嗜碱性粒细胞hct：红细胞压积mcv：平均红细胞体积mch：平均红细胞血红蛋白含量mchc：平均红细胞血红蛋白浓度rdw：红细胞分布宽度变异系数plt：血小板mpv：平均血小板体积

“*”代表与空白对照组相比，*p<0.5，**p<0.1，***p<0.01

表2空白对照组与模型组小鼠的脾脏指数与胸腺指数变化情况(means±sd)

“*”代表与空白对照组相比，*p<0.05，***p<0.001

图5，空白对照组与模型组小鼠股骨组织病理图，左边的为空白对照组，右边的为模型组，由图可见空白对照组股骨骨髓腔内红系、粒系及巨系细胞增生活跃，各系造血细胞形态正常，分布均匀，造血组织结构完整；而模型组则表现为骨髓腔内囊性扩张，各系造血细胞减少，脂肪细胞增多。

利用空白对照组与模型组小鼠脾脏指数与胸腺指数的变化评价模型的可靠性。结果表明，与正常对照组相比，模型组脾脏指数值显著升高；胸腺指数值显著下降，结果表明血虚小鼠模型造模成功。

步骤二，收集样品并处理，具体步骤如下：

称取80mg脾脏组织放入2ml的ep管中，加入400μl75％甲醇，放入钢珠，匀浆后涡旋1min并加入1ml甲基叔丁基醚，之后放入25℃金属浴中震荡孵育30min，震荡速度为1500r/min，加入250μl超纯水，涡旋1min，放入25℃金属浴中震荡孵育10min，震荡速度为1500r/min，放入振荡速度为12000r/min，4℃的高速离心机离心15min，取上清800μl，完全吹干；随后加入100μl异丙醇和25％甲醇的复溶溶液，其中异丙醇与25％甲醇的体积比为1:1，之后涡旋1min，超声15min使得样品完全复溶，将秤管放入液相小瓶中，12000r/min，4℃下离心15min后取上清100μl，得待测样品。

步骤三，样品的色谱液相流动分离与质谱分析，具体步骤如下：

将待测样品通过色谱柱中的流动相洗脱进行分离，

色谱柱为watersacquityuplchsst3，色谱柱的内径为2.1mm，长度为100mm，其内的固定相颗粒粒径为1.8μm。

色谱柱的使用条件为：柱温35℃，流速0.2ml/min，进样量5μl，流动相梯度为：0～1.5min，32％b；

1.5～4min，32％～45％b；

4～6min，45％～58％b；

6～12min，保持58％b；

12～16min，58％～70％b；

16～17min，70％～85％b；

17～20min，保持85％b；

20～26min，85％～95％b；

26～26.5min，95％～97％b；

26.5～30min，97％～32％b；

流动相分为流动相a和流动相b，

流动相a包括乙腈：水，5毫摩尔每升质谱级甲酸铵，0.1％甲酸＝6:4；

流动相b包括异丙醇：乙腈，5毫摩尔每升质谱级甲酸铵，0.1％甲酸＝9:1，甲酸铵的浓度为50mm/l。

然后分别在正、负离子模式下使用高分辨质谱仪进行测定，使用高分辨质谱仪进行测定的质谱条件为：采用hesi离子化方式，喷雾电压正极3.5kv，负极2.5kv，碰撞能量为12.5、25、37.5ev；加热器温度300℃，毛细管温度320℃，辅助气体积流量10arb，鞘气体积流量35arb；采集模式为正负离子切换，扫描模式采用fμllscan/dd-ms2，采集范围为100～1500m/z；分辨率采用msfμllscan35000fwhm，ms/ms17500fwhm。

得出小鼠脾脏的质谱谱图，见图1，空白对照组与模型组小鼠脾脏质谱脂质代谢物指纹谱图；图1中a为正离子模式下的代谢物指纹图谱，b为负离子模式下的指纹图谱；分析空白对照组与模型组小鼠机体脾脏中内源性代谢产物的变化。

步骤四，数据分析处理与鉴定，具体步骤如下：

使用compounddiscover软件对所有的质谱进行处理得到积分数据，然后对小鼠模型的质谱谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，观察pca图，见图2，是空白对照组与模型组的pca得分图，方块表示空白对照组(c组)，圆形表示模型组(m组)，每一个都代表一个独立的样本，据图可知，空白对照组与模型组可以分开，表明血虚小鼠模型造模成功；然后，在pca的基础上，利用正交偏最小二乘-判别分析法opls-da对空白对照组和模型组小鼠脾脏进一步分析，见图3，空白对照组与模型组的opls-da得分图，方块表示空白对照组(c组)，圆形表示模型组(m组)，每一个都代表一个独立的样本，观察图3可知空白对照组与模型组能够显著分开，其中cv-anova＝0.004，再次证明模型成立；图4是空白对照组与模型组的opls-da载荷图，圆圈代表血虚小鼠脾脏代谢物，距离中心原点越远差异性越大；通过载荷图对变量加载结果进行描述，利用变量重要性vip分析，s-plot相关性＞0.58并结合统计学p＜0.05获得潜在的差异代谢物，从对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量，然后对空白对照组与模型组小鼠脾脏进行uplc-ms/ms分析得出质谱图谱进行积分，最终确定了血虚模型的18个差异代谢物。根据目标脂类分子的化学式和相对分子量，将检测数据与之对比，最终确定了血虚模型的18个差异代谢物见表3，并进行相对定量分析见表4。

血虚模型的18个差异代谢物分别为：

hypoxanthine、hexadecanamide、oleamide、palmitoylcarnitine、1-heptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、bis(2-ethylhexyl)adipate、dioleoylphosphatidylethanolamine、n-stearoyl-l-tyrosine、linoleylcarnitine、1,2-di-[(9z,12z,15z)-octadecatrienoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine、1-(9z-hexadecenyl)-2-eicosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、1-[(9z)-octadecenoyl]-2-[(4z,7z,10z,13z,16z,19z)-docosahexaenoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine、1-octadecanoyl-2-(4z,7z,10z,13z,16z,19z-docosahexaenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1-octadecanoyl-2-(7z,10z,13z,16z)-docosatetraenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、n-myristoylsphingosine-1-phosphocholine、n-[(13z)-docosenoyl]sphing-4-enine-1-phosphocholine、1-oleoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine和glycidylstearate。

表3血虚小鼠脾脏组织中脂质物质的鉴定分析

表4血虚小鼠脾脏组织中脂质物质的相对定量分析

通过对比可知，采用本发明所述评价方法能更加全面灵敏的检测血虚模型的复制过程，具有高效、快速、特异性强的优点。

本发明的应用不限于上述实施例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。