琥珀酸GPR-91受体作为分子靶点在制药中的用途的制作方法

本发明属生物医药技术领域，涉及靶向琥珀酸-gpr-91受体信号通路，尤其涉及琥珀酸gpr-91受体作为分子靶点在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎相关纤维化的药物中的用途。

背景技术：

资料显示，非酒精性脂肪性肝病(nafld)是由代谢异常所致、以肝内脂肪积蓄为特征的一类肝病，包括非酒精性脂肪肝(nafl)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)慢性化所致的肝纤维化及终末期肝病或肝硬化、nafld相关肝癌。nafld的诊断首先需排除由于酒精、药物、病毒感染或其它原因所致的肝内脂肪积蓄。有研究表明，nafl可经减少热量摄取、增加能量消耗而逆转；约1/5的nafl可进展为nash，伴有肝损伤，15-20％的nash患者可慢性化，需要药物干预；业内认为，是否伴有肝纤维化成为nash远期预后的重要指标。有报道，终末期肝病及肝癌是nash致死途径，也成为美国肝移植首要基础病因；肝癌可出现于无显著肝纤维化(f2以上)的nash阶段，而且生长速度快，肿瘤体积大，nash相关肝癌(nash-hcc，主要为肝细胞肝癌)，已成为美国肝癌发生率持续升高原因之一。

有统计显示，nafld在我国的发病率高达15％(其中包括作为肥胖、代谢综合症、糖尿病、高脂血症等肝脏并发症)，超过hbv和hcv感染率的总和，在发达地区和城市可达20％，并有低龄化趋势。随着经济发展和生活条件的改善，国人的肥胖、糖尿病、代谢性综合症、血脂代谢紊乱的发病率不断攀升，由此而生的nafld已成为严重影响人民健康的常见疾患；不良生活方式也将成为nafld发病率上升的主要因素；同时，有10％身体质量指数(bmi)正常者伴有nafld，nash患者的就诊率偏低且无明显肝功能异常，常被诊断为隐源性肝硬化；有国外临床资料提示20％以上隐源性肝硬化的基础病为nash。

还有研究公开了nash病因多样，且无针对病因的特殊治疗，至今尚无经国家药监局批准专门用于治疗nash的药物。目前临床用药包括，具有抗氧化作用、肝细胞保护剂维生素e，但大剂量(800u/日)维生素e长期(两年)治疗对中国人的适用性尚有待评估；另，影响脂质代谢稳态的过氧化物酶体增殖物激活受体-(ppar-)激动剂吡格列酮(pgz)最早用于nash的治疗，但临床实践显示非糖尿病患者长期使用pgz则会导致心血管系统的并发症；另，还有用其它保肝药物，如水飞蓟素、多烯磷酰胆碱、甘草酸二铵、还原性谷胱苷肽、s-腺苷甲硫氨酸、熊去氧胆或黄连素等(非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018更新版)(doi：10.3969/j.issn.1009-5519.2018.05.001)，但这些药物的疗效不确切，无双盲随机对照临床试验证明其对nash的治疗作用。国外有研究公开了如，nash新药开发和临床验证依据主要病理生理机制及信号通路，凋亡信号调节激酶-1(ask-1)抑制剂(selonsertib)成为nash治疗手段之一；炎症反应驱使单核细胞趋化因子(mcp)的释放以及该受体ccr2/5激活，使得mcp-ccr2/5阻止剂(cenicriviroc)成为nash治疗靶向药物之一；ppar-/双重激动剂elafibranor也通过临床ii期验证；以奥贝胆酸(oca)为代表的细胞核受体fxr激动剂ii临床验证取得较满意疗效，除改善nas评分外，35％nash患者肝纤维化得到改善，显著高于安慰剂组19％的改善率；针对selonsertib、cenicriviroc、elafibranor及奥贝胆酸的iii期临床验证正进行中，各方都在期待临床验证报告出炉同时，甲状腺素受体b激动剂(vk2809、mgl-3196)硬脂酰辅酶a去饱和酶-1(scd-1)调节剂(aasld2018年会文摘#lb-4、5，4)也在临床ii验证中，已有初步报告，等信息，因此，治疗nash药物研发处于激烈竞争中。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供琥珀酸gpr-91受体作为分子靶点在制药中的用途，尤其涉及琥珀酸gpr-91受体作为分子靶点在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎相关纤维化的药物中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供琥珀酸gpr-91受体作为分子靶点在制药中的用途，尤其是琥珀酸gpr-91受体作为分子靶点在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎相关纤维化的药物中的用途。本发明有助于治疗干预非酒精性脂肪性肝炎相关纤维化的研究，能为进一步开发针对治疗非酒精性脂肪性肝炎相关纤维化的药物提供重要的参考数据。

基于现有技术的研究基础，如，通常临床对肝损伤血清alt、ast、胆红素水平以及肝脏储备功能白蛋白水平及凝血酶原时间等为可靠的定量化指标，而nash患者这些指标改变通常不明显；以及对肝脂肪积蓄、肝细胞空泡样变性及炎症细胞浸润的程度因无其它替代的标记，肝活检病理学检查是唯一“金标准”，然而，肝活检有一定的风险及取样误差以及病理评判存有评判者间误差，不能作为常规多次随访的手段，以及一些如透明质酸、前胶原3肽、层黏连素等肝纤维化无创血清学标记也未达到临床验证的要求；目前fibroscan瞬时弹性成像技术(vcte)和磁共振弹性成像(mre)已可作为临床判断肝纤维化进展的无创指标，而fibroscan肝脏脂肪变性定量诊断技术(cap)及磁共振质子密度脂肪分数(pdff)作为判断肝脂肪含量的无创影像学检查指标；对胰岛素抵抗大多采用实验室诊断指标，如糖耐量试验、空腹胰岛素水平、糖化血红蛋白水平等；这些定量或半定量指标已广泛用于ii、iii期临床验证中，成为现有衡量抗nash药物通用标准。

基于nash相关纤维化成为iii期药物临床验证的主要终点指标，本发明提供了琥珀酸gpr-91受体作为分子靶点在用于制药中的用途，尤其是琥珀酸gpr-91受体作为分子靶点在用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎相关纤维化的药物中的用途。

本发明经体内及体外实验结果表明，非酒精性脂肪性肝炎(nash)发生时肝细胞内琥珀酸的升高是肝星状细胞(hsc)活化的重要信号分子，肝细胞与hsc间通过琥珀酸-gpr-91受体信号通路的“对话”是nash肝纤维化关键分子基础。

本领域共识，判断有成药前景的临床前实验要求动物模型能够充分反映nash的病理生理改变和量化临床终点指标。通常临床前实验要求小鼠nash模型分为高脂高热量或高胆固醇饲料、营养成分缺乏饲料(缺乏蛋氨酸及胆碱(mcd)、缺乏胆碱氨基酸限定)、反式脂肪酸共轭亚油酸(cla)诱导模型、遗传缺陷模型等。

本发明采用hfcf-hf/g饲料诱导的nash模型确认了二十二碳六烯酸(dha)显著改善小鼠nash模型的临床终点指标，如肝内脂肪积蓄、肝细胞损伤、炎症反应、胰岛素抵抗和肝纤维化，为dha作为nash治疗的补充或合用营养补充制剂提供可靠临床前实验室数据。

本发明建立的高脂高热量饲料加高糖饮水(hfcd-hf/g)喂养16周，肝细胞损伤alt达350u/l(8倍)、肝脂肪含量升高6.6倍、空腹胰岛素水平升高近3倍，肝羟脯氨酸定量升高3倍余，所反映的肝细胞损伤、肝脂肪积蓄、胰岛素抵抗和肝纤维化的定量指标及组织病理学征象、半定量评分等为评判nash药物疗效提供了可量化终点指标小鼠动物模型；实验还显示了mcd饲料诱导的小鼠模型因小鼠体重下降，无胰岛素抵抗，不能真正反映nash的临床病理特征；实验还显示了遗传缺陷模型对研究特定基因或代谢途径在nash发病中作用非常重要，而对评断药物疗效、药代动力学、代谢、毒副作用意义则有限。

本发明通过建立在健康小鼠背景上的代表不同病因nash小鼠模型实验，反映人类因营养代谢因素所致nash的病理生理改变，进一步证实，琥珀酸-gpr-91受体信号通路成为阻止nash-纤维化关键靶点。

本发明中，经实验证实，nash是肝细胞内琥珀酸的升高是hsc活化的重要信号分子，肝细胞与hsc间通过琥珀酸-gpr-91受体信号通路的“对话”是nash肝纤维化关键分子基础。

之前的动物实验显示，随着nash的进展，线粒体功能受损(内膜电位丢失、线粒体dna减少)，线粒体及细胞内氧化应激加剧，线粒体数量减少；同时，线粒体内特异代谢，如脂肪酸-氧化的限速酶(cpt-1、acox)rna水平下降，导致脂肪酸的消耗降低；三羧酸(tca)循环关键酶如苹果酸脱氢酶(mdh)、琥珀酸脱氢酶(sdh)蛋白水平下降，造成肝内琥珀酸及苹果酸升高；而nash患者血清中琥珀酸水平也升高；因此表明，nash时琥珀酸升高是肝细胞线粒体代谢功能紊乱的结果，也是tca循环减慢或停止导致能量转化障碍的标记。

g-蛋白偶联受体家族成员-91(gpr-91或sucnr1)受体的配体为琥珀酸，琥珀酸作为信号分子被业内所认识；gpr-91受体存在于人体多个脏器，如小肠粘膜细胞、骨关节细胞、视网膜细胞、脂肪细胞、心肌细胞、血小板及肝星状细胞(hsc)等；本发明通过免疫组化染色，显示nash小鼠hsc表面gpr-91随平滑肌-机动蛋白(-sma)增加而表达增多，mrna定量及蛋白水平升高；原代hsc受琥珀酸刺激后，gpr-91受体mrna及蛋白水平都升高，与hsc的活化水平相一致，gpr-91受体下游信号分子erk-1/2和c-jun的磷酸化水平相应升高，而且，反映肝纤维化程度的细胞外基质，如金属蛋白酶基质抑制因子-1(timp-1)和前胶原-i(coll-i1/2)，促进肝纤维化的细胞因子，如结缔组织生长因子(ctgf)增加；当用rna干扰技术抑制hsc表面gpr-91受体表达后，琥珀酸的刺激作用消失；

本发明实验中，喂食高脂高热量饲料加高糖饮水(hfcd-hf/g)的小鼠肝脏琥珀酸含量与对照组相比显着增加(2.3倍)，同时苹果酸含量升高(3.7倍)，与之相反的是，小鼠肝脏中苹果酸脱氢酶-1/2(mdh-1/2)和琥珀酸脱氢酶-a(sdha)的基因和蛋白质水平显着降低，结果表明琥珀酸和苹果酸水平升高可能是由于线粒体功能障碍导致的线粒体sdha和mdh-1/2酶含量和/或活性受到抑制，而所有这些变化在添加dha(二十二碳六烯酸)后得到部分纠正；

本发明实验中，hfcd-hf/g组小鼠肝脏中gpr-91受体的mrna和总蛋白水平与对照组相比略有升高(p>0.05)，添加dha后升高趋势被抑制，通过免疫荧光染色发现gpr-91受体的表达与-sma的上调相一致，hfcd-hf/g组小鼠肝脏中产生更多的-sma和gpr-91受体，已知琥珀酸是gpr-91受体的天然配体，因此推测肝细胞中升高的琥珀酸可以通过gpr-91受体信号而激活hscs，dha可能对肝细胞和hsc直接发挥作用，对这一通路不一定有直接影响；

本发明实验中，添加琥珀酸刺激人(hsc)和大鼠(bscc-10)永生化肝星状细胞后，如hsc活化标记-sma蛋白水平上升，纤维化相关基因表达增加，同时可导致gpr-91受体水平及下游分子erk-1/2和c-jun的磷酸化水平上升，而这些变化可通过添加dha而得到消除；

本发明实验中，携带gpr-91受体的shrna慢病毒感染肝星状细胞系可导致gpr-91受体蛋白水平显着下调，实验显示，抑制gpr-91受体后导致两种永生化hscs的gpr-91受体mrna和蛋白水平下调，同时下游信号分子erk-1/2和c-jun的蛋白质磷酸化水平降低，同时抑制了琥珀酸刺激肝星状细胞的活化作用，如慢病毒干扰组细胞被琥珀酸刺激后-sma蛋白水平和纤维化相关基因表达水平不再上升；

本发明实验中，pgr-91受体为g蛋白偶联受体家族成员之一，现有50-70％药物作用于这类受体，因其在非酒精性脂肪性肝炎(nash)肝纤维化中的重要作用，这一受体成为阻止nash肝纤维化的关键分子靶点，可作为小分子化合物、抗体或其它分子干预的靶点。

琥珀酸-gpr-91受体信号通路在其它慢性肝损伤所致肝纤维化中也起关键作用。

本发明经体内及体外实验结果证实，nash中肝细胞内琥珀酸的升高是hsc活化的重要信号分子，肝细胞内过量的琥珀酸作为信号分子通过激活琥珀酸-gpr-91受体信号通路激活hsc进而促进肝纤维化的进展；肝细胞与hsc间通过琥珀酸-gpr-91受体信号通路的“对话”是nash肝纤维化关键分子基础。本发明所述的琥珀酸-gpr-91受体信号通路是非酒精性脂肪性肝炎相关纤维化的关键靶标，靶向琥珀酸-gpr-91受体信号通路，如小分子化合物、抗体或其它生物制剂等可阻止nash相关肝纤维化的起始和进展。

本发明所述的琥珀酸gpr-91受体可作为分子靶点用于制药中，尤其是琥珀酸gpr-91受体可作为分子靶点用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎相关纤维化的药物中。

附图说明

图1显示了添加dha修复三羧酸循环中关键酶表达异常，其中，

图1a.肝脏succinate(琥珀酸)含量；图1b.肝脏malate(苹果酸)含量；**p<0.01；与hfcd-hf/g相比，δp<0.05，δδp<0.01，每组n＝5；

图1c.通过定量rt-pcr分析小鼠肝脏中mdh-1/2(苹果酸酶-1/2)，sdha(琥珀酸脱氢酶复合物亚基a)和gpr-91(g蛋白偶联受体91)的mrna水平，与对照组相比*，**p<0.05和0.01，与hfcd-hf/g相比δ，δδp<0.05和0.01，每组n＝5；

图1d.通过蛋白质印迹分析小鼠肝脏中mdh-1/2(苹果酸酶-1/2)，sdha(琥珀酸脱氢酶复合物亚基a)和gpr-91(g蛋白偶联受体91)的总蛋白质水平；

图1e.对图1d进行了蛋白质印迹的灰度分析，与对照组相比*，**p<0.05和0.01，与hfcd-hf/g相比δ，δδp<0.05和0.01，每组n＝3；

图1f.小鼠肝脏冰冻切片双重荧光染色的代表性共聚焦显微图片，

其中，对于a-h，sdha染成红色，coxⅳ染成绿色；对于i-p，mdh-2染成红色，coxⅳ染成绿色；对于a-d和i-1，放大倍数为400×，比例尺＝50m；对于e-h和m-p，放大倍数为400×3，比例尺＝10m。

图2显示了添加dha通过抑制gpr-91受体阻止hfcd-hf/g组小鼠hscs的活化，其中，

图2a.通过定量rt-pcr分析小鼠肝脏中gpr-91的mrna水平，与hfcd-hf/g相比δp<0.05，每组n＝5；

图2b.通过蛋白质印迹分析小鼠肝脏中gpr-91受体的总蛋白质水平；

图2c.对图2bwestern印迹的灰度分析，每组n＝3；

图2d.小鼠肝脏冰冻切片双重荧光染色的代表性共聚焦显微图片，其中，对于a-x，gpr-91染成红色，-sma染成绿色，放大倍数为400×；对于q-t，比例尺＝50m；对于u-x，比例尺＝10m。

图3显示了体外添加dha干预gpr-91受体信号通路，抑制琥珀酸刺激hscs的活化，其中，

图3a，通过蛋白质印迹分析人永生化hsc(a)和大鼠永生化bscc-10(b)细胞中

-sma、gpr-91受体、p-erk-1/2和p-c-jun的总蛋白水平，suc＝琥珀酸；其中，将琥珀酸盐(suc)溶解在双蒸水中并加入培养基至终浓度为400m，dha溶解在乙醇中，并在加入suc前15分钟将其加入到培养基至终浓度为400m，实验均重复3次；

图3b.人永生化hsc(a)和大鼠永生化bscc-10(b)细胞中-sma、col-i1、ctgf和gpr-91受体的mrna水平，suc＝琥珀酸，其中，将琥珀酸盐(suc)溶解在双蒸水中并加入培养基至终浓度为400m，dha溶解在乙醇中，并在加入suc前15分钟将其加入到培养基至终浓度为400m，实验中每组均设3个复孔，与bsa相比*，**p<0.05和p<0.01，与suc相比δ，δδp<0.05和0.01；

图3c.通过蛋白质印迹分析大鼠原代hsc细胞中-sma、gpr-91受体、p-erk-1/2和p-c-jun的总蛋白水平，suc＝琥珀酸，其中，将琥珀酸盐(suc)溶解在双蒸水中并加入培养基至终浓度为400m，dha首先溶解在乙醇中，并在加入suc前15分钟将其加入到培养基至终浓度为400m，实验均重复3次；

图3d.大鼠原代hsc细胞中col-i1、timp-1、ctgf和gpr-91受体的mrna水平，实验中每组均设3个复孔，与bsa相比**p<0.01，。与suc相比δ，δδp<0.05和0.01；

图3e.原代肝星状细胞(hsc)中gpr-91受体与细胞质-sma(a)或膜atpase(b)双重免疫荧光染色的共聚焦显微图片，其中，对于a-1，gpr-91受体用红色荧光显影，

-sma/atpase用绿色显影，放大倍数为400×，比例尺＝25m，suc＝琥珀酸；其中，将琥珀酸盐(suc)溶解在双蒸水中并加入培养基至终浓度为400m，dha首先溶解在乙醇中，并在加入suc前15分钟将其加入到培养基至终浓度为400m。

图4显示了慢病毒介导的gpr-91受体下调可抑制其下游分子和hsc的活化，其中，

图4a.利用携带乱序的shrna(对照组)或针对人(shh1、shh2、shh3和shh4)和大鼠(shr1、shr2、shr3和shr4)gpr-91受体的shrna(h-gpr91-kd，r-gpr91-kd)的慢病毒转染永生化人hsc和大鼠bscc-10细胞并通过蛋白质印记进行验证；

图4b.通过蛋白质印迹分析永生化慢病毒稳定转染人hsc细胞系(b)(h-scram,h-gpr91-kd)和大鼠bscc-10细胞系(a)(r-scram,r-gpr91-kd)中-sma，gpr-91受体、p-erk-1/2和p-c-jun的总蛋白水平，suc＝琥珀酸，其中，将琥珀酸盐(suc)溶解在双蒸水中并加入培养基至终浓度为400m，dha首先溶解在乙醇中，并在加入suc前15分钟将其加入到培养基至终浓度为400m，实验均重复3次，scram＝scrambled，kd＝knockdown；

图4c.永生化慢病毒稳定转染人hsc细胞系(h-scram,h-gpr91-kd)和大鼠bscc-10细胞系(r-scram,r-gpr91-kd)中-sma、col-i1、ctgf和gpr-91受体的mrna水平，suc＝琥珀酸，其中，将琥珀酸盐(suc)溶解在双蒸水中并加入培养基至终浓度为400m，dha首先溶解在乙醇中，并在加入suc前15分钟将其加入到培养基至终浓度为400m，实验中每组均设3个复孔，与bsa相比*，**p<0.05和p<0.01，与suc相比δ，δδp<0.05和0.01。

具体实施方式

实施例1添加dha修复三羧酸循环中关键酶表达实验

研究代谢物(琥珀酸和苹果酸)和参与三羧酸(tca)循环的酶证实hfcd-hf/g组小鼠的代谢紊乱并探索通过添加dha可能的校正：从小鼠肝脏中提取总rna和蛋白质，并检测几种关键酶的转录和翻译表达水平，例如苹果酸脱氢酶-1/2(mdh-1/2)和琥珀酸脱氢酶复合物亚基a(sdha)。同时，对来自每组小鼠的冰冻肝组织切片进行免疫荧光染色以进行验证。此外通过气相色谱-质谱(gc-ms)分析发现与对照组相比，喂食hfcd-hf/g的小鼠肝脏琥珀酸含量显着增加(2.3倍)，同时苹果酸含量升高(3.7倍)(如图1a，1b所示)。与之相反的是，与对照组相比，喂食hfcd-hf/g的小鼠肝脏中mdh-1/2和sdha的基因和蛋白质水平显着降低(如图1c,1d和1e所示)。结果表明琥珀酸和苹果酸水平升高是由于线粒体功能障碍导致线粒体sdha和mdh-1/2酶含量和/或活性受到抑制。。而所有这些变化都在添加dha后得到部分纠正，与该结果一致的是，实验观察到hfcd-hf/g组小鼠肝脏中线粒体cox-ⅳ与sdha或mdh-2的共定位表明sdha和mdh-2的表达水平比对照组阳性率低，并且可通过添加dha部分恢复(如图1f所示)。

实施例2添加dha通过抑制gpr-91受体阻止hfcd-hf/g组小鼠hsc的活化

通过rt-pcr和western印迹分析(如图2a,2b和2c所示)显示hfcd-hf/g组小鼠肝脏中gpr-91受体mrna和总蛋白水平略有升高(p>0.05)，添加dha后升高趋势被抑制；通过免疫荧光染色发现gpr-91受体与-sma表达上调相一致，与对照组相比，hfcd-hf/g组小鼠肝脏中产生更多的-sma和gpr-91(如图2d所示)，基于琥珀酸是gpr-91的天然配体，因此推测肝细胞中升高的琥珀酸可以通过gpr-91受体信号而激活hsc，而添加dha可阻止这一过程。

实施例3体外添加dha干预gpr-91受体信号通路，抑制了琥珀酸刺激hsc的活化

通过蛋白质水平检测证实添加琥珀酸可导致人hsc和大鼠bscc-10细胞系

-sma和gpr-91受体表达上升，而这些变化可通过添加dha(如图3a所示)而被抑制，利用原代大鼠hsc得到了一致的结果，在纤维化相关基因水平也得到了同样的结果(如3b所示)；如图3e所示，琥珀酸盐处理导致原代hsc中的gpr-91受体活化以及更强的-sma染色。此外，伴随着-sma和gpr-91受体表达升高产生了更多的胶原和ctgf(如图3d所示)，表明原代hsc中细胞外基质的加速生成，erk-1/2和c-jun是gpr-91受体激活的下游信号分子。在蛋白质水平上，琥珀酸刺激导致原代hsc中gpr-91受体表达增强，同时，erk-1/2和c-jun的磷酸化水平更加明显，并且可以通过添加dha得到消除(如图3c所示)；本发明在永生化人hsc和大鼠sbcc-10细胞系中，在mrna和蛋白质水平上进一步证实了通过琥珀酸盐处理激活gpr-91受体后，增强了下游信号传导erk-1/2和c-jun分子的磷酸化(如图3a所示)；与大鼠原代hsc的发现一致的是，添加dha消除了琥珀酸对gpr-91受体激活和erk-1/2和c-jun磷酸化的刺激作用，同时，该两种hsc系中的-sma，col-i1，ctgf的mrna水平通过琥珀酸刺激而增加，并通过添加dha而消除(如图3b所示)。

实施例4慢病毒介导的gpr-91受体下调可抑制其下游分子和hsc的活化

为进一步证实琥珀酸刺激后gpr-91受体介导的hsc活化，本发明在永生化hsc中进行慢病毒载体介导的gpr-91受体沉默，针对人hsc和大鼠bscc-10细胞系中转染携带gpr-91受体的shrna慢病毒载体导致gpr-91受体在蛋白质水平显着下调(如图4a所示)，实验显示抑制gpr-91受体后导致两种永生化hsc的gpr-91受体在mrna和蛋白质水平下调，同时下游信号分子erk-1/2和c-jun的蛋白质磷酸化水平降低(如图4b所示)，mrna水平得到了与蛋白水平一致的结果(如图4c所示)。

实施例5

本发明的实验中，采用如下的方法和材料：

(1)肝脏组织病理学检查和生化检测

将新鲜小鼠肝脏固定在4％中性福尔马林中，包埋并切片，在masson'strichrome染色后评估肝纤维化的程度，根据通用标准进行半定量评分。切片在20×光学显微镜物镜(尼康，东京，日本)下拍摄。利用匀浆器(上海必横生物有限公司，上海，中国)破碎肝组织，然后通过商业化试剂盒(货号：a030,南京建成生物工程研究院)测量肝脏羟脯氨酸含量。

(2)细胞培养

将人来源永生化肝星状细胞系hsc和大鼠来源肝星状细胞系bscc-10培养在补充有10％(v/v)fbs，1％(v/v)青霉素/链霉素，1％l-谷氨酰胺(v/v)和1％(v/v)丙酮酸钠的dmem中。所有细胞置于37℃，5％co2的空气潮湿培养箱中培养。

(3)分离原代大鼠肝星状细胞

按建立的方法，分离原代肝星状细胞(hsc)并接种在细胞培养皿中，将大鼠原代肝星状细胞培养在m199培养液中，分离5天后将它们转移到用i型胶原预涂覆的盖玻片上进行免疫组织化学染色，或用琥珀酸盐(suc，来自sigma-aldrichchemical，货号：o0625)+/-dha处理，用琥珀酸处理12和24小时后提取细胞总rna或蛋白质，加入的琥珀酸终浓度为400m。

(4)构建针对gpr-91受体的shrna干扰的肝星状细胞稳转细胞系

针对人gpr-91受体cdna的shrna靶序列(基因代码：nm_033050.5)由sigmaaldrich(https://www.sigmaaldrich.com/catalog/genes)生成；针对大鼠gpr-91受体的shrna靶序列(基因代码：nm_001001518.1)由thermofisherscientific(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)生成，所有shrna由genewiz(上海，中国)合成；选择针对每个物种的四种shrna靶序列作为候选干扰序列(如表-1所示)，最终，选择来自每个物种的一个shrna(h-gpr91-2，r-gpr91-3)作为慢病毒整合的特异性序列，以有效抑制细胞内gpr-91受体的表达，并将合成的shrna序列插入到质粒plk0.1-puro中，使用lipofectamine2000将shrna质粒(plk0.1-puro)和包装质粒(pmd2.g和pspax2)共转染到293t细胞中以获得敲低gpr-91受体表达的重组慢病毒，转染48小时后收集h-gpr91-kd和r-gpr91-kd慢病毒，测定其滴度后储存在-80℃直至用于感染细胞实验，用表达乱序shrna(shrna对照)的慢病毒转染的细胞作为对照转染细胞系，在嘌呤霉素选择48小时后，用含有针对gpr-91或乱序shrna慢病毒载体转染的永生化hsc细胞用于后续实验，并分别命名为h-hsc-gpr91-kd和r-bscc-10-gpr91-kd。

表1靶向gpr-91受体的shrna序列

人类

大鼠

表中加黑为本发明确定并选用的shrna序列。

(5)免疫荧光染色

用3％tritonx-100处理固定的冰冻肝组织切片以增加一抗进入胞质的渗透性，用5％山羊血清封闭，同时用5％山羊血清稀释的一抗4℃孵育过夜，并用1xpbs洗涤；此后，将它们与荧光素(flexa488或594)结合的二抗在37℃下孵育2小时，细胞核用4'6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)复染，所有切片用甘油密封，在40×物镜的共聚焦显微镜(型号：tcssp8，莱卡，德国)下检查并拍照。

(6)定量rt-pcr

抽提总rna并逆转录成cdna(takara生物有限公司，大连，中国)。用eppendorfrealplex循环(realplex4，eppendorf，德国)进行定量rt-pcr，使用2-δδct方法分析相对基因表达水平，以管家基因-actin作为对照进行标准化。

(7)western印迹分析

按常规方法提取总蛋白质并定量，采用来自中国碧云天生物有限公司的试剂盒(货号：c3601)分离线粒体蛋白，通过sds-page电泳分离变性蛋白质并转移到pvdf膜上，用5％脱脂牛奶封闭，4℃下与一抗孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的二抗孵育1小时后化学发光观察拍照。

(8)统计分析

所有数据均表示为平均值±sem，用spss17.0软件进行统计学分析；anova方差检验用于组间比较，两组间的多重比较通过lsd检验完成；p值<0.05被认为具有统计学显着性。

序列表

<110>复旦大学

<120>琥珀酸gpr-91受体作为分子靶点在制药中的用途

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>h-gpr91-1cds(159-179

<400>1

gaactggaacagcagtaatat21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>h-gpr91-2cds(969-989)

<400>2

ggctcatgaactcctactttc21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>h-gpr91-3cds(303-323)

<400>3

gcttcatgccaacctctatac21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>h-gpr91-4cds(280-300)

<400>4

ctctgcataagcaaccgatat21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>r-gpr91-1cds(514-534)

<400>5

gcaagttctggaaaccctaaa21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>r-gpr91-2cds(259-279)

<400>6

ggagatgttctctgcataagc21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>r-gpr91-3cds(107-127)

<400>7

gcaatttcaccgtggtgttcg21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>r-gpr91-4cds(128-148)

<400>8

gctacctcttctgcatgaaga21