快速检测肝素和肝素酶浓度的方法与流程

本发明属于生物分析检测领域，具体地，涉及快速检测肝素和肝素酶浓度的方法。

背景技术：

肝素在凝血、细胞生长、脂质代谢及免疫防御等生理过程中起着至关重要的作用，且被广泛应用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等医疗领域。同时，肝素酶作为一种能特异性降解肝素的酶，在肝素结构分析、低分子量制备、人体中残留肝素去除方面有重要应用。因此，对肝素及肝素酶进行准确检测具有非常重要的意义。

目前已报道的肝素及肝素酶检测方法很多，例如比色、电化学、离子交换色谱和荧光分析方法等。然而，比色法灵敏度较差，电化学方法易受外部环境影响，离子交换色谱法操作较为繁琐。相比之下，荧光检测方法因其响应快速、操作简单、灵敏度高等优点而备受关注。已建立的荧光检测方法，主要分为两类：荧光恢复/淬灭法和比率荧光法。

荧光恢复/淬灭法是基于监测某一特定波长处荧光的恢复或者淬灭，从而实现对目标分析物(肝素及肝素酶)的定量分析检测。2014年，liuziping等利用肝素可诱导cuins2量子点集聚淬灭其荧光的现象，实现了对肝素及肝素酶的检测(biosens.bioelectron.2014,54,617-622)。2015年，yanghaibo等利用肝素诱导四苯乙烯功能化的金属环探针集聚，并基于四苯乙烯探针的聚集诱导发光特性实现了对肝素的检测(j.am.chem.soc.2015,137,11725-11735)。2016年，chenxing-guo等利用肝素诱导发光硅纳米粒子集聚，淬灭硅纳米粒子的荧光，进而实现对肝素的检测(anal.chem.2016,88,10474-10481)。

比率荧光法是基于监测两个单独波长处的荧光强度变化，通过两者荧光强度的比值变化实现对目标分析物(肝素及肝素酶)的定量分析检测。2014年，keun-hyeunglee等合成了芘修饰的正电荷功能化肽基探针，利用负电荷的肝素诱导探针集聚，形成激基缔合物，基于芘探针单体荧光-激基缔合物荧光之间的转换，便可实现对肝素的比率荧光检测(anal.chem.2014,86,6580-6586)。2016年，carstenschmuck等合成了萘供体和丹酰受体同时修饰的正电荷寡肽探针，负电荷的肝素可诱使寡肽探针构型发生变化，使得萘供体和丹酰受体相互靠近而发生荧光共振能量转移(fret)，基于供受体荧光的变化即可实现对肝素的比率荧光检测(chem.eur.j.2016,22,13156-13161)。

荧光恢复/淬灭法由于仅仅依赖单一波长，容易受到假阳性信号干扰。而比率荧光法是基于两个单独波长处的荧光强度变化，可以得到较好的选择性和灵敏度。然而，目前已报道的比率荧光分析法，也因为其波长范围非近红外区、探针浓度过高或者荧光共振能量转移(fret)发生需要较为苛刻的条件而不能达到理想的检测效果。

技术实现要素：

针对上述方法的缺陷，本发明利用正电荷银纳米材料诱导增强苝探针激基缔合物荧光，结合肝素与银纳米材料的相互作用以及肝素酶的特异性，开发快速简便、灵敏度高、成本低廉的针对肝素及肝素酶的新型检测方法。

本发明的快速检测肝素及肝素酶浓度的方法，包括以下步骤：

s1、将银纳米粒子溶液与已知浓度的a溶液混合后，再与苝探针溶液混合，得到混合液，混合溶液中，银纳米粒子与苝探针结合，得到苝探针激基缔合物，利用银纳米粒子的金属增强荧光效应增强苝探针激基缔合物荧光；同时，未结合的苝探针单体发射单体荧光；

所述苝探针的结构为：

所述a为肝素或者肝素酶；当a为肝素时，将银纳米粒子溶液与已知浓度肝素溶液混合后，再与苝探针溶液混合；当a为肝素酶时，将肝素酶溶液与已知浓度肝素溶液混合，进行酶解后，再依次与银纳米粒子溶液和苝探针溶液混合反应；

s2、分别测定混合溶液中苝探针激基缔合物和苝探针单体的荧光强度，得到苝探针激基缔合物和苝探针单体荧光强度的比值；

s3、按照s1-s2的方法测定一系列不同已知浓度的a溶液的苝探针激基缔合物和苝探针单体荧光强度的比值，然后以a溶液的浓度为横坐标，以与a溶液浓度相对应的比值为纵坐标，绘制出线性标准曲线，得到标准曲线的回归方程；

s4、将银纳米粒子溶液与待测a溶液混合后，再与苝探针溶液混合，进行反应，分别测定混合溶液中苝探针激基缔合物和苝探针单体的荧光强度，将比值代入s3的回归方程，得到待测a溶液的浓度。

进一步的，s1和s4中的银纳米粒子终浓度均为63.3pm；苝探针终浓度均为100nm。

更进一步的，当a为肝素时，a溶液浓度线性范围为0～75nm。

更进一步的，当a为肝素时，回归方程为y＝52.68-0.66x。

进一步的，当a为肝素酶时，a溶液浓度线性范围为0～0.25u/ml。

更进一步的，当a为肝素酶时，s1中，与肝素酶溶液混合的肝素溶液的终浓度为250nm。

更进一步的，当a为肝素酶时，回归方程为y＝0.18+9.28x。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明基于正电荷银纳米粒子诱导增强负电荷苝探针的激基缔合物荧光，开发的肝素和肝素酶的比率荧光检测方法，具有快速简单、成本低廉、灵敏度高的特点，将我们的方法用于人血清样品中肝素及肝素酶的回收率测试，均得到良好的实验结果，回收率在96％～104％，误差不超过5％。

附图说明

图1.a银纳米粒子诱导苝探针激基缔合物示意图；b.加入银纳米粒子前(1)和后(2)苝探针荧光发射光谱

图2.a为实施例1中肝素检测示意图；b为加入不同浓度肝素后苝探针单体和苝探针激基缔合物荧光发射光谱，c为实施例1中标准曲线。

图3.a肝素酶检测示意图；b.加入不同浓度肝素酶后苝探针单体和苝探针激基缔合物荧光发射光谱，c为实施例2中标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的运用到的原理：强正电的银纳米粒子溶液与负电荷的苝探针溶液结合，得到苝探针激基缔合物；利用银纳米粒子的金属增强荧光效应有效增强苝探针激基缔合物荧光(图1a)，使得其在低浓度(100nm)即可观察到较强的激基缔合物荧光(图1b)

下述实施例中，苝探针的结构为：

实施例1

快速检测肝素浓度的方法

s1、将20μl的银纳米粒子溶液(1266pm)和4μl不同浓度(0,0.5,1,2.5,5,7.5,10,17.5,25和32.5μm)的肝素标准溶液加入到5mm的tris-hcl缓冲液中混合反应后，再与4μl浓度为10μm的苝探针溶液混合，混合溶液总体积为400μl。溶液中无肝素时，银纳米粒子与苝探针结合，得到苝探针激基缔合物，同时利用银纳米粒子的金属增强荧光效应增强苝探针激基缔合物荧光；而加入肝素后，肝素可紧密包覆在银纳米粒子表面，抑制银纳米粒子诱导苝探针激基缔合物的形成，此时可观察到强烈的单体荧光(图2a所示)；

如上所述银纳米粒子终浓度为63.3pm；苝探针终浓度为100nm；肝素标准溶液终浓度分别为0,5,10,25,50,75,100,175,250和325nm。

s2、利用比率荧光法测定s1混合溶液中苝探针激基缔合物和苝探针单体的荧光强度，图2b所示，随着肝素浓度的增加，苝探针激基缔合物荧光强度逐渐降低，单体荧光强度逐渐升高；

s3、如图2c所示，随着肝素浓度的增加，激基缔合物荧光/单体荧光的比值逐渐降低。以肝素标准溶液的浓度为横坐标，苝探针激基缔合物/单体荧光比值(ie/im)为纵坐标。将苝探针激基缔合物/单体荧光比值和肝素标准溶液做线性分析发现，激基缔合物荧光/单体荧光的比值与肝素浓度在0～75nm范围内呈现良好的线性关系(r²＝0.99)，并绘制出线性标准曲线，得到标准曲线的回归方程；

线性回归方程为y＝52.68-0.66x。

s4、将待测肝素溶液按s1所述方法与银纳米粒子混合反应，再与苝探针溶液混合，利用比率荧光法测定反应体系中苝探针激基缔合物和苝探针单体荧光强度的比值，将比值代入s3的回归方程，得到待测肝素溶液的浓度。

将实施例1的方法用于血清样品中肝素的回收率测试，结果如表1所示。

表1血清样品中肝素的回收率测试

实施例2

快速检测肝素酶浓度的方法，包括以下步骤：

s1、将4μl肝素溶液(25μm)和4μl不同浓度(0,0.5,1,2.5,5,10,15,20,25和30u/ml)的肝素酶标准溶液加入到5mm的tris-hcl缓冲液中混合，进行酶催化分解反应，后依次与20μl银纳米粒子溶液(1266pm)和4μl浓度为10μm的苝探针溶液混合，混合溶液总体积为400μl。肝素酶特异性地将肝素降解为短链多糖或二糖，导致其无法有效包覆在银纳米粒子表面，无法有效阻碍银纳米粒子诱导苝探针激基缔合物的形成，此时可观察到明显的激基缔合物荧光(图3a所示)；

如上所述银纳米粒子终浓度为63.3pm；苝探针终浓度为100nm；肝素溶液终浓度为250nm；肝素酶标准溶液终浓度分别为0,0.005,0.01,0.025,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25和0.3u/ml。

s2、利用比率荧光法测定s1混合溶液中苝探针激基缔合物和苝探针单体的荧光强度，图3b所示，随着肝素酶浓度的增加，苝探针激基缔合物荧光强度逐渐升高，单体荧光强度逐渐降低；

s3、如图3c所示，随着肝素酶浓度的增加，激基缔合物荧光/单体荧光的比值逐渐升高。以肝素酶标准溶液的浓度为横坐标，苝探针激基缔合物/单体荧光比值(ie/im)为纵坐标。将苝探针激基缔合物/单体荧光比值和肝素酶标准溶液做线性分析发现，激基缔合物荧光/单体荧光的比值与肝素酶浓度在0～0.25u/ml范围内呈现良好的线性关系(r²＝0.991)，并绘制出线性标准曲线，得到标准曲线的回归方程；

线性回归方程为y＝0.18+9.28x。

s4、将待测肝素酶溶液按s1所述方法与肝素溶液混合反应后，再与银纳米粒子和苝探针溶液混合，利用比率荧光法测定反应体系中苝探针激基缔合物和苝探针单体荧光强度的比值，将比值代入s3的回归方程，得到待测肝素酶溶液的浓度。

将实施例2的方法用于血清样品中肝素酶的回收率测试，结果如表2所示。

表2血清样品中肝素酶的回收率测试

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。