一种基于增强拉曼散射相对强度外标法的痕量物质定量分析方法与流程

本发明属于痕量有机物定量分析技术领域，特别涉及一种基于增强拉曼谱线中不同物质相对拉曼散射强度外标法实现痕量物质定量分析的方法。

背景技术：

表面增强拉曼散射(sers)光谱已成为一种重要的光谱分析方法，在诸多领域中发挥着重要作用，可以实现对环境污染物、生物标志物、食品添加剂等物质的痕量检测，具有高灵敏度、快速、基本无损、样品制备简单等诸多优点。目前基于贵金属(银、金、铜)设计的表面增强拉曼散射基片取得了很大的成功，在痕量物质检测领域中发挥了重要作用，尤其是柔性基片等更是进一步拓展了其应用范围。但是基于表面增强拉曼散射光谱实现对痕量物质的半定量和定量分析仍面临很多问题，基于绝对拉曼散射强度和物质浓度的工作曲线往往会由于基片本身的均匀性和基片批次之间的差异性而影响实际分析。主成分分析(pca)和非线性聚类算法等也由于数据预处理复杂，模型训练数据量大以及模型抗干扰和稳健性差，不够直观等原因仍需要进一步提升。

拉曼光谱作为一种非弹性散射光谱技术，物质自身的拉曼散射强度远远小于弹性散射，表面增强拉曼散射技术的发展大大拓宽了其应用范围，但是表面增强拉曼散射基片自身的均匀性和稳定性等因素限制了绝对拉曼散射强度-浓度工作曲线的应用。相对强度外标法在衍射分析中取得了成功应用，利用不同相的相对强度信息可以定量分析相含量。同样，在拉曼光谱中，不同物质的相对强度信息也包含了其相对含量的信息，这个相对强度信息可以有效减弱基片均匀性和稳定性带来的绝对强度变化对定量分析的影响。采用相对强度外标法可以实现对混合物中含量的准确分析，针对物质浓度的定量分析，可以添加已知浓度的物质实现对待测物浓度的定量分析。在实际应用中，对于物质相对含量的分析十分重要，基于增强拉曼光谱相对强度外标法的定量分析方法在环境污染物、生物代谢物含量分析、食品添加剂含量分析等方面有着广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼光谱中不同物质相对拉曼散射强度信息实现物质含量和浓度定量分析的方法，主要采用相对强度与相对含量的外标法实现对物质含量和浓度的定量分析。

为了达到上述发明目的，所采用的技术方案是：

一种基于增强拉曼散射相对强度外标法的痕量物质定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对待测物使用表面增强拉曼散射效应基片获得表面增强拉曼散射光谱；

2)建立不同物质之间相对含量和相对拉曼散射强度的外标工作曲线；

3)利用外标工作曲线实现对待测物中各物质相对含量进行定量分析；

4)通过添加已知浓度的物质，实现对待检测物的实际浓度进行定量分析。

进一步，步骤1)中采用分峰或回归等方法对待测物中不同物质相对拉曼散射强度进行求解。

进一步，步骤3)中利用混合体系的表面增强拉曼散射谱中不同物质的相对拉曼散射强度信息实现对待测物中各物质含量进行定量分析。

进一步，步骤4)中通过添加已知浓度的另一物质，然后结合步骤3)中实现的含量定量分析直接计算，得到待测物实际浓度的预测值。

具体来说，本发明的分析方法首先对待检测物质使用表面增强拉曼散射效应基片获得表面增强拉曼散射光谱，其次建立起不同物质之间相对含量和相对拉曼散射强度的外标工作曲线，基于外标工作曲线实现对混合物中痕量物质相对含量的分析，对于浓度分析可以通过添加已知浓度的物质，再根据外标工作曲线得到待检测物质的实际浓度。利用相对强度的信息进行定量分析可以有效避免表面增强拉曼散射基片自身均匀性和批次间差异性对定量分析的干扰。

所述相对拉曼散射强度外标工作方法基于混合物表面增强拉曼散射光谱建立，数据处理方式可采用分峰或回归等方法确定相对拉曼散射强度，对待测物浓度的确定可通过添加已知浓度的另一物质来根据外标工作曲线预测其实际浓度。

上述方法不限制所使用的表面增强拉曼散射效应基片，表面增强拉曼散射效应基片目的是实现对痕量物质拉曼光谱的采集，基于表面增强拉曼散射相对强度的外标法不依赖于基片种类，同时可以有效避免基片自身的均匀性和批次间的差异性对定量分析结果的干扰。

基于表面增强拉曼散射相对强度外标法的痕量物质定量分析具体实施为：通过分峰或回归等方法实现对混合物体系的表面增强拉曼散射谱线中不同物质相对拉曼散射强度进行求解，然后建立相对拉曼散射强度与相对含量的外标工作曲线；进而，可以通过外标工作曲线实现对待测物质中各物质成分相对含量进行定量分析；进一步，可通过添加已知浓度物质为作为待测物的伴随，在混合物谱中根据外标工作曲线先确定添加物和未知物的相对含量，然后根据添加物的已知浓度得到待测物质的浓度预测值，实现对痕量物质的定量分析。数据处理的具体操作为：对于n元混合物体系stol，可以通过分峰或回归等方法得到各个组员的相对表面拉曼散射强度信息，如式(1)所示，其中ai为第i个组元相对于选定纯物质的光谱si的系数：

然后对于任意两个组份可以建立式子(2)所表示外标工作曲线，其中xi和xj为对应第i和j个组份的含量。

通过以上关系可以对待测体系各个物质的相对含量进行分析，如式(3)所示：

对于浓度的检测，如果添加的已知物xi的浓度为ci,则可以通过式子(4)得到待测物质的浓度为：

本发明的有益效果是通过相对表面增强拉曼散射强度外标法进行混合物体系中物质含量和浓度的定量分析，这种方法可以有效减弱表面增强拉曼散射基片自身均匀性和批次间差异性对定量分析带来的干扰，使得表面增强拉曼散射技术在痕量物质定量分析中能够发挥更大的作用，充分将表面增强拉曼散射技术自身便捷快速、制样简单、检测灵敏度高等优点发挥在定量分析中去。该方法在环境污染物检测、生物标志物检测、食品添加剂检测中有广阔的应用前景。

附图说明

图1(a)是纯物质、已知建模混合体系和待定量分析体系各自的表面增强拉曼散射光谱图。

图1(b)为根据建模混合体系相对拉曼散射强度建立的外标工作曲线。

图2(a)为实施例1中对待定量分析体系1的相对表面增强拉曼散射强度在外标工作曲线中的位置图。

图2(b)为实施例1中对待定量分析体系1中4-mpy含量的定量预测图。

图3(a)为实施例2中对待定量分析体系2在外标工作曲线中的位置图。

图3(b)为实施例2中对待定量分析体系2中4-mpy含量的预测图。

图4为实施例3中对待测体系2中4-mpy实际浓度的定量分析预测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明予以具体说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明首先采用表面增强拉曼散射基片获得混合物体系的表面增强拉曼散射光谱，然后通过对混合体系的光谱进行分峰或回归等处理，建立不同物质间相对表面增强拉曼散射强度与相对含量的外标工作曲线，根据外标工作曲线可以对待检测物质的实际含量和浓度进行定量分析，可以有效避免基片均匀性等因素对定量分析带来的干扰，方便地实现对待检测物的定量分析。

图1(a)为用于开展实施例的混合物体系，包含四-巯基吡啶(4-mpy)和四-巯基苯甲酸(4-mba)以及用于建立相对表面增强拉曼散射强度与相对含量关系的混合物体系：含有20％的4-mpy和80％的4-mba的混合体系以及含有67％的4-mpy和33％的4-mba的体系。以及两个待定量分析体系，图1(a)中给出了各自的表面增强拉曼散射光谱图。图1(b)给出了基于两个已知混合样品中4-mpy(1096cm^-1)和4-mba(1074cm^-1)相对拉曼散射强度建立的外标工作曲线，此处的函数曲线由过原点的直线进行拟合得到。

图2(a)为实施例1中待定量分析体系1的相对表面增强拉曼散射强度在外标工作曲线中的位置，实际溶液相对含量为1:2，对应横坐标的0.5的位置，在图中可以看出，实验值基本也在外标工作曲线上，因此说明该外标工作曲线可以准确预测其物质含量，根据外标工作曲线，直接计算待测混合物中物质的相对含量范围，从而得到图2(b)中预测的4-mpy含量，图2(b)中y＝x是预测与实际含量完全一致的理论曲线，可以看出预测的4-mpy含量基本和实际含量一致。

图3(a)为实施例2中待定量分析样品体系2在外标工作曲线中的位置，可以看出数据点较外标工作曲线有略有偏移，通过外标工作曲线预测的4-mpy含量在图3(b)中列出，预测值的4-mpy含量数值较真实值略为偏高，但是在误差允许范围内。

图4为实施例3中对待定量分析体系2中4-mpy实际浓度进行预测结果，为了实现对实施例2中4-mpy的浓度预测，通过添加已知浓度为5μm的4-mba，根据实施例2中图3(a)相对表面增强拉曼散射强度预测得到二者的相对含量比值范围，将这个比值范围作为斜率绘制二者浓度的曲线簇，根据已知4-mba的浓度与曲线束的相交范围可以预测4-mpy的浓度预测值为5.02～5.07μm，比4-mpy的真实浓度5μm略偏高，但在误差允许范围内。

以下结合三个实施例，说明了利用相对表面增强拉曼散射强度与相对含量的外标工作曲线对实际物质定量分析的可行性和有效性。

实施例1

1.测试待检测体系的表面增强拉曼散射谱线，如果谱线有荧光背底则进行基本的扣除荧光背底操作；

2.通过分峰或回归等操作得到4-mpy(1096cm^-1)和4-mba(1074cm^-1)的相对表面增强拉曼散射强度；

3.根据相对表面增强拉曼散射强度与相对含量的外标工作曲线求解4-mpy相对于4-mba的含量比值；

4.根据4-mpy相对于4-mba的相对含量比值直接算出4-mpy的含量值。

所求解得到的4-mpy和4-mba的相对含量比值可以从图2(a)中得到，可以看出实际的相对含量比值和外标工作曲线上的基本一致，通过相对含量比值直接计算得到的4-mpy的含量如图2(b)所示，可看出预测的4-mpy含量为30～35％与实际值33.3％相一致。

实施例2

1.测试4-mpy和4-mba混合体系的表面增强拉曼散射谱线，如果谱线有荧光背底则进行基本的扣除荧光背底操作；

2.通过分峰或回归等操作得到4-mpy(1096cm^-1)和4-mba(1074cm^-1)的相对表面增强拉曼散射强度；

3.根据相对待检测混合体系的表面增强拉曼散射强度与相对含量的外标工作曲线求解4-mpy相对于4-mba的含量比值；

4.根据4-mpy相对于4-mba的相对含量比值直接算出4-mpy的含量值。

所求解得到的4-mpy和4-mba的相对含量比值可以从图3(a)中得到，可以看出实际的相对含量比值和外标工作曲线上的基本一致，通过相对含量比值直接计算得到的4-mpy的含量如图3(b)所示，可看出预测的4-mpy含量略偏高，为51％～54％，与真实值50％接近。

实施例3

1.在待检测4-mpy浓度的体系中添加4-mba试剂，本实施例添加的4-mba的浓度为5μm；

2.测试4-mpy和4-mba混合体系的表面增强拉曼散射谱线，如果谱线有荧光背底则进行基本的扣除荧光背底操作；

3.通过分峰或回归等操作得到4-mpy(1096cm^-1)和4-mba(1074cm^-1)的相对表面增强拉曼散射强度；

4.根据相对表面增强拉曼散射强度与相对含量的外标工作曲线求解4-mpy相对于4-mba的含量比值范围；

5.以相对含量比值范围为斜率绘制曲线簇，并根据曲线簇和添加的4-mba的浓度值可以预测得到4-mpy的浓度范围。

通过外标工作曲线预测的相对含量比值范围如图4中的曲线簇所示，通过曲线簇与添加的4-mba的含量可以预测得到4-mpy的浓度为5.02～5.07μm，与真实值5μm接近。

上述实施例对本发明的技术方案进行了详细说明。显然，本发明并不局限于所描述的实施例。基于本发明中的实施例，熟悉本技术领域的人员还可据此做出多种变化，但任何与本发明等同或相类似的变化都属于本发明保护的范围。