一种快速检测同型半胱氨酸的电化学方法与流程

本发明涉及一种同型半胱氨酸的检测方法，具体涉及一种快速检测同型半胱氨酸的电化学方法。

背景技术：

同型半胱氨酸(hcy)又称高半胱氨酸，是蛋氨酸代谢产生的一种含硫的氨基酸，80％的hcy在血中通过二硫键与蛋白结合，只有很少一部分游离同型半胱氨酸参加循环。hcy水平与心血管疾病密切相关，是心血管疾病发病的一个重要危险因子，血液中增高的hcy由于刺激血管壁引起动脉血管的损伤而导致炎症和管壁的斑块形成，最终引起心脏血流受阻。高同型半胱氨酸尿症患者，由于严重遗传缺陷影响hcy代谢，造成高hcy血症。轻微的遗传缺陷或维生素b营养缺乏会伴随中度或轻度的hcy升高，而同时增加心脏病的危险，hcy升高还可引起神经管畸形等出生缺陷类疾病。

目前，有多种分析方法用于检测同型半胱氨酸，如色谱法，具有很高的准确度和稳定性，常作为同型半胱氨酸检测的参考方法；荧光偏振免疫检测法，成本高，需要专业仪器；酶联免疫法，具有灵敏度高、特异性强的特点，但紧密度差，耗费人力，操作时间长，不适宜做单个样品和急诊样品；化学发光法，成本高，需要专用仪器；循环酶法，可在大型生化仪上使用，操作简单，结果准确可靠，且可与其它参数进行同时分析，是目前最为常见的临床检测方法。但上述方法皆存在成本高、预处理复杂、需特定的检测场所和特定设备、检测时间长且不易大规模自动检测等缺点，而且血液样品本身含有的丙酮酸会使检测结果出现假阳性现象，严重影响检测结果。因此，寻找合适的检测手段对同型半胱氨酸进行及时、准确、灵敏的检测，成为亟待解决的迫切问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种快速检测同型半胱氨酸的电化学方法，该方法测量方便、结果准确，利用该方法制作试纸的工艺简单，有利于批量生产。

同型半胱氨酸的反应原理：氧化型hcy被转化成游离hcy，游离hcy在胱硫醚-β-合成酶(cbs)催化下与丝氨酸反应生成l-胱硫醚。l-胱硫醚在胱硫醚β-分解酶(cbl)催化下又生成hcy、丙酮酸和nh3。该循环反应生成的丙酮酸可以用乳酸脱氢酶ldh和nadh检测到，nadh转变成nad的速率与样品中hcy含量成正比。涉及的反应式如下：

丝氨酸+同型半胱氨酸———→l-胱硫醚

l-胱硫醚———→同型半胱氨酸+丙酮酸+nh3

丙酮酸+nadh———→乳酸+nad⁺

nad⁺+还原性电子介体———→nadh+氧化性电子介体

氧化性电子介体+e———→还原性电子介体(产生电流)

因此，本发明人依据上述原理中丙酮酸与nadh反应能检测出丙酮酸浓度来设计本方法，以消除血液本身含有的丙酮酸的对检测结果的影响。

为此，本发明所采用的技术方案是：一种快速检测同型半胱氨酸的电化学方法，该方法步骤如下：

a.于一试纸上设置二组电极，该二组电极分别接触相应的酶层，使得二组电极中的一组电极用于测试血液样本中的同型半胱氨酸，另一组电极用于测试该血液样本本身含有的丙酮酸；

b.将一血液样本分别吸入至该二组电极上，与相应的酶层反应而分别产生一组电流；

c.以该二组电流的差值为横坐标，同型半胱氨酸标准品的浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线能求得待测血液样本中同型半胱氨酸的浓度值。

上述导电层为碳导电层或金导电层，其中碳导电层的电阻值为200-1000欧，金导电层的电阻值为30-120欧。该二组电极均由工作电极与对电极组成。

上述提及的用于测试同型半胱氨酸的电极上涂抹的酶层按重量百分比由77-97.47％缓冲液、0.01-0.5％nadh、0.1-1.5％丝氨酸、0.1-2％谷氨酸脱氢酶、0.01-1％胱硫醚-β-合成酶、0.2-2％胱硫醚β-分解酶、2-10％稳定剂、0.01-1％酚嗪硫酸甲酯及0.1-5％电子介体组成。

上述用于测试血液样本本身含有的丙酮酸的电极上涂抹的酶层按重量百分比由82.5-94.69％缓冲液、0.01-0.5％nadh、0.1-2％谷氨酸脱氢酶、5-10％稳定剂及0.2-5％电子介体组成。

上述提及的稳定剂按重量百分比由88.4-99.698％缓冲液、0.05-5％bsa、0.1-5％d-海藻糖、0.1-1％peg-4000、0.001-0.1％pc-300、0.001-0.5％3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱及0.05-3％羟甲基纤维素组成。

上述提及的缓冲液为pbs、aces、mes、pipes或tris-盐酸中的一种或几种。

上述提及的电子介体为三联吡啶氯化钌、氯化六氨合钌或亚铁氰化钾中的一种或多种。

上述提及的同型半胱氨酸标准品是指通过生化仪标定的血液样本，其同型半胱氨酸的浓度值为真实浓度值，不存在阳性测量值。

本发明同时提供一种快速检测同型半胱氨酸的电化学试纸，该试纸上分别设置有用于测试同型半胱氨酸的电极，以及用于测试血液样本本身含有的丙酮酸的电极。

本发明的有益效果在于：

本方法检测时间为3min，吸血量约4ul，cv小于4.5％，不需要专用大型设备，配套可携带仪器就可完成检测，操作方便。相对于现有的大型生化仪具有一定的优势，主要体现在，大型生化仪需要配套的试剂盒，且试剂盒种类多，测试时间长，吸血量多，国内部分地区仍然采用间接法测试同型半胱氨酸，会出现假阳性现象，而本发明的试纸同时使用两组电极测试，能有效的去除血液样品本身的丙酮酸、防止出现假阳性现象，结果可靠，且无需大型专业设备、无需特定场所。

附图说明

图1是本发明同型半胱氨酸浓度-电流差值标准曲线图。

具体实施方式

利用本方法制作同型半胱氨酸电化学试纸，该试纸的基本制作与现有技术相同，由下至上依次为绝缘pet基板、导电层、双面胶及亲水膜，不同的是，本发明的导电层上设置二组互不影响的电极(分别由工作电极与对电极组成)，并按常规技术将二酶液分别固定于二组电极上形成二酶层，其中，二酶层中的一酶层配合一组电极用于测试测试血液样本中的同型半胱氨酸，另一酶层配合另一组电极用于测试血液样本本身含有的丙酮酸，而同一血液样本通过二虹吸槽分别吸入后与二酶层反应。

上述用于测试同型半胱氨酸的酶液按重量百分比由77-97.47％缓冲液、0.01-0.5％nadh、0.1-1.5％丝氨酸、0.1-2％谷氨酸脱氢酶、0.01-1％胱硫醚-β-合成酶、0.2-2％胱硫醚β-分解酶、2-10％稳定剂、0.01-1％酚嗪硫酸甲酯及0.1-5％电子介体组成。

上述用于测试血液样本本身含有的丙酮酸的酶液按重量百分比由82.5-94.69％缓冲液、0.01-0.5％nadh、0.1-2％谷氨酸脱氢酶、5-10％稳定剂及0.2-5％电子介体组成。

上述提及的稳定剂按重量百分比由88.4-99.698％缓冲液、0.05-5％bsa、0.1-5％d-海藻糖、0.1-1％peg-4000、0.001-0.1％pc-300、0.001-0.5％3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱及0.05-3％羟甲基纤维素组成。

上述提及的缓冲液为pbs、aces、mes、pipes或tris-盐酸中的一种或几种。

上述提及的电子介体为三联吡啶氯化钌、氯化六氨合钌或亚铁氰化钾中的一种或多种。

按上述方法制作试纸，相关组成如下：

稳定剂(重量)：92％pbs缓冲液、3％bsa、3％d-海藻糖、0.6％peg-4000、0.1％pc-300、0.3％3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱、1％羟甲基纤维素。

测试同型半胱氨酸的酶液(重量)：90％pbs缓冲液、0.5％nadh、1.5％丝氨酸、1％谷氨酸脱氢酶、1％胱硫醚-β-合成酶、1％胱硫醚β-分解酶、2％稳定剂、1％酚嗪硫酸甲酯、2％三联吡啶氯化钌。

测试血液样本本身含有的丙酮酸的酶液(重量)：82.5-94.69％pbs缓冲液、0.01-0.5％nadh、0.1-2％谷氨酸脱氢酶、5-10％稳定剂及0.2-5％三联吡啶氯化钌。

采用配套的检测仪对上述试纸进行血液样本浓度定码，具体数据见下表1，并以表中序号1的电流差值为横坐标，同型半胱氨酸标准品浓度为纵坐标建立标准曲线(见图1)，方程r²为0.999，表明线性关系很好。并由表1数据可知，本发明的电化学试纸的测试范围为1-50umol/l，线性相关性r大于98％，精密度控制在4.5％以内。

表1同型半胱氨酸标准品浓度-电流差值的关系

以按本发明方法建立的标准曲线为基础，对20份血液样本进行同型半胱氨酸检测，以对照组进行对照。对照组的试纸与本发明制作的试纸大致相同，不同仅在于对照组仅设置一组检测同型半胱氨酸的浓度的电极，对照组以测试得到的电流值为横坐标，同型半胱氨酸标准品的浓度为纵坐标建立标准曲线。生化值比对结果见表2。

表2试纸血液样本比对结果

由上表2可知，本方法制作的试纸与对对照组测试结果差异较大，对照组的测试结果远大于生化浓度值，相对偏差约13-40％，出现假阳性现象，而本发明的测试结果与生化浓度值很接近，相对偏差基本控制在7.5％以内。因此，采用本发明试条的技术方案能有效的降低血液自身干扰，避免出现假阳性现象。