一种水中亚硝胺的检测方法与流程

本发明属于检测
技术领域：
，涉及一种水中亚硝胺的检测方法，具体涉及一种气相色谱-质谱联用检测水中亚硝胺的检测方法。
背景技术：
：水不仅是构成身体的主要成分，而且还有许多生理功能。水的溶解力很强，许多物质都能溶于水，并解离为离子状态，发挥重要的作用。不溶于水的蛋自质和脂肪可悬浮在水中形成胶体或乳液，便于消化、吸收和利用；水在人体内直接参加氧化还原反应，促进各种生理话动和生化反应的进行；没有水就无法维持血液循环、呼吸、消化、吸收、分泌、排泻等生理活动。体内新陈代谢也无法进行；水的比热大，可以调节体温，保持恒定。当外界温度高或体内产热多时，水的蒸发及出汗可帮助散热。天气冷时、由于水储备热量的潜力很大，人体不致因外界寒冷而使体温降低，水的流动性大。一方面可以运送氧气、营养物质、激素等，一方而又可通过大便、小便、出汗把代谢产物及有毒物质排泄掉。水还是体内自备的润滑剂，如皮肤的滋润及眼泪、唾液，关节囊和浆膜腔液都是相应器官的润滑剂。成人体液是由水、电解质、低分子有机化合物和蛋白质等组成，广泛分布在组织细胞内外，构成人体的内环境。其中细胞内液约占体重的40％，细胞外液占20％(其中血浆占5％，组织间液占15％)。水是机体物质代谢必不可少的物质，细胞必须从组织间液摄取营养，而营养物质溶于水才能被充分吸收，物质代谢的中间产物和般终产物也必须通过组织间液运送和排除。因此，与人类密切相关的水的安全问题越来越引起人类的重视。工业和农业的发展对地表水造成了不同程度的污染，导致地表水中存在不同浓度水平的亚硝胺类物质，在地表水中检出多种亚硝胺类物质(强致癌物，最重要的化学致癌物之一)。在饮用水管网中检测到亚硝胺类物质的浓度为：117.8ng/l亚硝基哌啶、180ng/l亚硝基二甲胺和70.5ng/l亚硝基吡咯烷，亚硝胺类物质随着管网的延长浓度水平不断增加。近年来，亚硝胺在饮用水消毒过程中也被检测出来，美国、法国、日本、德国等多个国家对饮用水源进行调查，均在饮用水中检测到亚硝胺类物质。虽然饮用水中此类物质的浓度水平较低(ng/l级)，但由于其毒性远高于常规卤代烃类消毒副产物(三卤甲胺和卤乙酸等)，已日益成为环境研究领域的一个新热点。亚硝胺类物质无论是大剂量还是多次小剂量的接触，均可以致癌并诱发肿瘤。遗传毒性研究显示，许多亚硝胺类物质可以通过机体的代谢作用或者直接对机体作用，进而诱发机体细胞发生基因突变、dna修复障碍和染色体异常。亚硝胺类化合物作为一种强致癌性化合物一直以来受到人们的关注。因此，及早检出水中的亚硝胺类物质，专利cn108008040a公开了一种水中痕量n-亚硝胺的检测方法，该方法包括以下步骤：a)将待测水样与n-亚硝基二甲胺-d6混合后通过活性炭固相萃取柱，之后将所述活性炭固相萃取柱中的水分挤出，再用二氯甲烷对活性炭固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液；b)将所述洗脱液与甲醇混合，进行浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液与n-亚硝基二丙基胺-d14混合，得到待分析样品；c)对所述待分析样品进行气相色谱-质谱检测，根据检测结果和预先建立的标准曲线计算出所述待测水样中n-亚硝胺的种类和含量。该方法中，需要用到活性炭固相萃取柱进行萃取和洗脱，操作比较麻烦，耗时长，不利于快速检验。另外，该专利中对常见的9种亚硝胺进行了回收率试验，其中ndpha回收率较低在20％左右，nmea与ndba回收率在55％左右，其余的都有70-85％左右，其回收率试验结果不理想，说明该方法准确率差，检测结果可信度差。技术实现要素：为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种水中亚硝胺的检测方法。本发明的水中亚硝胺的检测方法是通过下述的技术方案来解决以上的技术问题的：一种水中亚硝胺的检测方法，所述检测方法为气相色谱-质谱联用检测方法，所述检测方法包含如下步骤：对照品溶液：精密量取亚硝胺混合对照品0.45ml置200ml量瓶中，用二氯甲烷定量稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置50ml量瓶中，用正己烷-二氯甲烷(1:1)定量稀释至刻度，摇匀，得线性关系试验溶液1、2、3、4、5；供试品溶液：取饮用水3ml，加入3ml正己烷-二氯甲烷(1:1)，混合萃取，静置，取有机层，即得；空白溶液；取正己烷-二氯甲烷(1:1)作为空白溶液；检测方法及结果计算方法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液浓度与峰面积得线性方程，相关系数(r)不得小于0.99；供试品溶液中如有与各亚硝胺化合物保留时间一致的色谱峰，按线性方程法计算，即得。上述的中亚硝胺的检测方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用检测方法的色谱条件为：气相条件：聚乙二醇色谱柱(vf-waxms，30m×0.25mm(0.25μm)，agilent)的毛细管柱，45℃，维持1min；以15℃/min速率升至140℃，以20℃/min速率升至230℃，维持12分钟；进样口温度250℃，载气为氦气，流速为线速度模式，柱流速每分钟1ml，总流量15.0ml/min，不分流进样，进样1μl，进样时间1.0分钟；质谱条件：采用ei源，离子源温度：200℃，接口温度：200℃；sim模式检测离子(m/z)为74、88、102、100、56、70、114、84、169；scan模式检测离子(m/z)35～500。上述的中亚硝胺的检测方法中，所述水为饮用水、纯化水、注射用水、药物溶液剂。上述的中亚硝胺的检测方法中，所述正己烷-二氯甲烷的体积比1:1。所述聚乙二醇色谱柱的型号为vf-waxms，30m×0.25mm，0.25μm，agilent。所述亚硝胺可以为n-二甲基亚硝胺、n-甲基乙基亚硝胺、n-二乙基亚硝胺、n-二丁基亚硝胺、n-亚硝基吡啶、n-二丙基亚硝胺、n-亚硝基吡咯烷、n-亚硝基吗啉、n-亚硝基二苯胺中的一种或多种。饮用水包括干净的天然泉水、井水、河水和湖水，也包括经过处理的矿泉水、纯净水等。加工过的饮用水有瓶装水、桶装水、管道直饮水等形式。纯化水为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的制药用水，不含任何添加剂。药物溶液剂系指药物溶解于溶剂中所形成的澄明液体制剂。药物溶液剂主要是指药物注射液，比如包含氯化钠注射液，葡萄糖注射液。本发明的有益效果在于，(1)本发明提供的水中亚硝胺的检测方法，水样处理时无需使用固相萃取柱进行萃取、挤压和洗脱，采用有机相简单萃取即可进行进行检测，样品处理步骤简单，操作方便，避免了采样过程中的二次污染，样品处理耗时短，可实现送检水样的快速检测。(2)本发明的的检测方法用于水中亚硝胺的检测，能够一次检测9种亚硝胺：n-二甲基亚硝胺、n-甲基乙基亚硝胺、n-二乙基亚硝胺、n-二丁基亚硝胺、n-亚硝基吡啶、n-二丙基亚硝胺、n-亚硝基吡咯烷、n-亚硝基吗啉、n-亚硝基二苯胺。该检测方法具有良好的专属性、线性关系、精密度、准确度和重复性，其回收率在85.9-95.8％，检测结果可信度高。附图说明图1为本发明的水中亚硝胺的检测方法的专属性试验亚硝胺定位溶液scan模式定位图谱。图2为本发明的水中亚硝胺的检测方法的专属性试验亚硝胺定位溶液sim模式定位图谱。图3为本发明实施例2的样品亚硝胺检测图谱。图4为本发明实施例3的样品亚硝胺检测图谱。图5为本发明实施例4的样品亚硝胺检测图谱。图6为本发明实施例5的样品亚硝胺检测图谱。图7为本发明实施例6的样品亚硝胺检测图谱。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。本发明实施例中所用的亚硝胺混合对照品来源：sigma-aldrich，批号：lrac0077，有效期：2021/10/25。实施例1本发明的水中亚硝胺的检测方法的方法学实验检测方法：照气相色谱法(中国药典2015年版四部通则0521)和质谱法(中国药典2015年版四部通则0431)测定。气相条件：聚乙二醇色谱柱(vf-waxms，30m×0.25mm(0.25μm)，agilent)的毛细管柱，45℃，维持1min；以15℃/min速率升至140℃，以20℃/min速率升至230℃，维持12分钟；进样口温度250℃，载气为氦气，流速为线速度模式，柱流速每分钟1ml，总流量15.0ml/min。不分流进样，进样1μl，进样时间1.0分钟。质谱条件：采用ei源，离子源温度：200℃，接口温度：200℃。sim模式检测离子(m/z)为74、88、102、100、56、70、114、84、169；scan模式检测离子(m/z)35～500。(1)专属性试验空白溶剂：正己烷：二氯甲烷(1：1)。定位溶液：精密量取亚硝胺混合对照品0.45ml置200ml量瓶中，用二氯甲烷定量稀释至刻度，摇匀，即得。检测及结果：精密量取定位溶液、空白溶剂各1μl注入气相色谱仪，分别采用scan、sim模式记录色谱图。scan、sim模式色谱图分别见图1、图2。由色谱图可知，空白溶剂对检测无干扰；亚硝胺保留时间分别为n-二甲基亚硝胺6.067min、n-甲基乙基亚硝胺6.511min、n-二乙基亚硝胺6.781min、n-二丁基亚硝胺7.987min、n-亚硝基吡啶9.351min、n-二丙基亚硝胺9.613min、n-亚硝基吡咯烷9.842min、n-亚硝基吗啉10.150min、n-亚硝基二苯胺11.861min。(2)线性关系试验线性贮备溶液：精密量取亚硝胺混合对照品0.45ml置200ml量瓶中，用二氯甲烷定量稀释至刻度，摇匀，即得。线性关系试验溶液：分别精密量取线性贮备溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置50ml量瓶中，用正己烷与二氯甲烷(1:1)定量稀释至刻度，摇匀，得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。可接受标准：相关系数≥0.99。检测及结果：精密量取各线性关系溶液1μl注入气相色谱仪，采用sim模式记录色谱图，结果见表1～表3。表1线性关系试验溶液浓度(μg/ml)名称二甲胺甲乙胺二乙胺二丙胺二丁胺哌啶吡咯烷吗啉二苯胺m/z748810270841141005616910.088920.090360.090450.090900.089820.089910.089960.090090.0908120.17780.18070.18090.18180.17960.17980.17990.18020.181630.26680.27110.27140.27270.26950.26970.26990.27030.272440.35570.36140.36180.36360.35930.35960.35980.36040.363250.44460.45180.45230.45450.44910.44960.44980.45050.4541表2线性关系试验溶液峰面积名称二甲胺甲乙胺二乙胺二丙胺二丁胺哌啶吡咯烷吗啉二苯胺m/z748810270841141005616911546011860107131331717845896311322150993350223508427973256232978839206201272584534529718423521604045137970438825730030086382075044410377547197355410525665976278500421505408376353142153592499739836715075936100050547406874195984177494表3线性关系试验参数结论：亚硝胺在0.09～0.45μg/ml范围内与峰面积成良好的线性关系，符合规定。(3)系统精密度试验确定在该检测条件下，仪器重复多次地完成同一变化过程所对应的结果变化。可接受标准：rsd％＜10.0％。检测及结果：精密量取线性关系溶液(3)1μl注入气相色谱仪，采用sim模式记录色谱图，连续测定6次。结果见表4。表4系统精密度试验数据名称二甲胺甲乙胺二乙胺二丙胺二丁胺哌啶吡咯烷吗啉二苯胺m/z74881027084114100561691500543817536555420065451329668360754792489854254515425863811944692589943182440270522511054193568474335540952473756089133418418465987810830445286941416382424308756330306333885455199100435552866412023699842793558133039337928548579992965242541384376544296756341307723896655412100980平均5326341353380874382057147311183899054254100820rsd％4.34.34.14.54.14.35.17.36.3结论：结果表明系统精密度良好，符合规定。(4)准确度试验确定亚硝胺用所确定的方法检测测定的结果与真实值接近的程度。可接受标准：回收率范围70％～150％，rsd％≤15％。回收率试验贮备溶液：取线性关系试验溶液1、3、5，作为回收率贮备溶液1、2、3。对照品溶液：同线性关系试验溶液3。供试品溶液：取饮用水3ml，按表5加入各贮备溶液3ml，混合萃取，取有机层，即得。检测及结果：精密量取对照品溶液、供试品溶液1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算得测得量及回收率，并计算回收率平均值及rsd％。试验结果见表6。表5准确度供试品溶液的配制方法no饮用水加各贮备溶液13.0ml3.0ml空白溶剂23.0ml3.0ml贮备溶液133.0ml3.0ml贮备溶液143.0ml3.0ml贮备溶液153.0ml3.0ml贮备溶液263.0ml3.0ml贮备溶液273.0ml3.0ml贮备溶液283.0ml3.0ml贮备溶液393.0ml3.0ml贮备溶液3103.0ml3.0ml贮备溶液3表6准确度试验结果结论：本方法准确度符合规定。(5)重复性试验确定同一份供试品，由同一分析人员经多次取样测定所得结果之间的接近程度。对照品溶液：同线性关系试验溶液3。供试品溶液：取饮用水3.0ml，精密加入3.0ml回收率贮备溶液2，混合萃取，取有机层，即得。平行制备6份。可接受标准：rsd％＜20.0％。检测及结果：精密量取对照品溶液及各供试品溶液1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，按线性方程法计算得测得量，并计算实际测得量及rsd％。结果见表7。表7重复性试验数据名称二甲胺甲乙胺二乙胺二丙胺二丁胺哌啶吡咯烷吗啉二苯胺m/z748810270841141005616910.69260.83000.89050.87970.89040.86250.79330.76861.19420.67850.81650.83950.87340.88060.84870.79560.77231.24230.76470.80890.84470.83230.83820.81110.82280.81271.05040.58800.76650.82850.82470.84720.79140.73790.68751.20150.69510.81430.85850.85470.85440.83410.79620.77551.05160.64840.77010.81760.79520.81050.76600.73090.71821.042平均0.67790.80110.84660.84330.85360.81900.77950.75581.130rsd％8.63.33.13.83.44.54.76.08.2结论：重复性试验结果符合规定。实施例2送检样品：普利思矿泉水，生产单位：济南普利思矿泉水有限公司。检测方法：气相条件：聚乙二醇色谱柱(vf-waxms，30m×0.25mm(0.25μm)，agilent)的毛细管柱，45℃，维持1min；以15℃/min速率升至140℃，以20℃/min速率升至230℃，维持12分钟；进样口温度250℃，载气为氦气，流速为线速度模式，柱流速每分钟1ml，总流量15.0ml/min。不分流进样，进样1μl，进样时间1.0分钟。质谱条件：采用ei源，离子源温度：200℃，接口温度：200℃。sim模式检测离子(m/z)为74、88、102、100、56、70、114、84、169；scan模式检测离子(m/z)35～500。对照品溶液：精密量取亚硝胺混合对照品0.45ml置200ml量瓶中，用二氯甲烷定量稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置50ml量瓶中，用正己烷-二氯甲烷(1:1)定量稀释至刻度，摇匀，得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。(90ng/ml-450ng/ml)供试品溶液：取普利思矿泉水3ml，加入3ml正己烷-二氯甲烷(1:1)，混合萃取，静置，取有机层，即得。空白溶液；取正己烷-二氯甲烷(1:1)作为空白溶液。检测方法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液浓度与峰面积得线性方程，相关系数(r)不得小于0.99。供试品溶液中如有与各亚硝胺化合物保留时间一致的色谱峰，按线性方程法计算，即得。检测结果：未检出。普利思矿泉水样品图谱见图3。实施例3送检样品：纯化水，生产单位：华熙生物科技股份有限公司。检测方法：气相条件：聚乙二醇色谱柱(vf-waxms，30m×0.25mm(0.25μm)，agilent)的毛细管柱，45℃，维持1min；以15℃/min速率升至140℃，以20℃/min速率升至230℃，维持12分钟；进样口温度250℃，载气为氦气，流速为线速度模式，柱流速每分钟1ml，总流量15.0ml/min。不分流进样，进样1μl，进样时间1.0分钟。质谱条件：采用ei源，离子源温度：200℃，接口温度：200℃。sim模式检测离子(m/z)为74、88、102、100、56、70、114、84、169；scan模式检测离子(m/z)35～500。对照品溶液：精密量取亚硝胺混合对照品0.45ml置200ml量瓶中，用二氯甲烷定量稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置50ml量瓶中，用正己烷-二氯甲烷(1:1)定量稀释至刻度，摇匀，得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。(90ng/ml-450ng/ml)供试品溶液：取纯化水3ml，加入3ml正己烷-二氯甲烷(1:1)，混合萃取，静置，取有机层，即得。空白溶液；取正己烷-二氯甲烷(1:1)作为空白溶液。检测方法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液浓度与峰面积得线性方程，相关系数(r)不得小于0.99。供试品溶液中如有与各亚硝胺化合物保留时间一致的色谱峰，按线性方程法计算，即得。检测结果：未检出。纯化水样品检测图谱见图4。实施例4送检样品：注射用水，生产单位：齐鲁制药有限公司。检测方法：气相条件：聚乙二醇色谱柱(vf-waxms，30m×0.25mm(0.25μm)，agilent)的毛细管柱，45℃，维持1min；以15℃/min速率升至140℃，以20℃/min速率升至230℃，维持12分钟；进样口温度250℃，载气为氦气，流速为线速度模式，柱流速每分钟1ml，总流量15.0ml/min。不分流进样，进样1μl，进样时间1.0分钟。质谱条件：采用ei源，离子源温度：200℃，接口温度：200℃。sim模式检测离子(m/z)为74、88、102、100、56、70、114、84、169；scan模式检测离子(m/z)35～500。对照品溶液：精密量取亚硝胺混合对照品0.45ml置200ml量瓶中，用二氯甲烷定量稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置50ml量瓶中，用正己烷-二氯甲烷(1:1)定量稀释至刻度，摇匀，得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。(90ng/ml-450ng/ml)供试品溶液：取注射用水3ml，加入3ml正己烷-二氯甲烷(1:1)，混合萃取，静置，取有机层，即得。空白溶液；取正己烷-二氯甲烷(1:1)作为空白溶液。检测方法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液浓度与峰面积得线性方程，相关系数(r)不得小于0.99。供试品溶液中如有与各亚硝胺化合物保留时间一致的色谱峰，按线性方程法计算，即得。检测结果：未检出。注射用水样品检测图谱见图5。实施例5送检样品：氯化钠注射液，生产单位：山东华鲁制药有限公司。检测方法：气相条件：聚乙二醇色谱柱(vf-waxms，30m×0.25mm(0.25μm)，agilent)的毛细管柱，45℃，维持1min；以15℃/min速率升至140℃，以20℃/min速率升至230℃，维持12分钟；进样口温度250℃，载气为氦气，流速为线速度模式，柱流速每分钟1ml，总流量15.0ml/min。不分流进样，进样1μl，进样时间1.0分钟。质谱条件：采用ei源，离子源温度：200℃，接口温度：200℃。sim模式检测离子(m/z)为74、88、102、100、56、70、114、84、169；scan模式检测离子(m/z)35～500。对照品溶液：精密量取亚硝胺混合对照品0.45ml置200ml量瓶中，用二氯甲烷定量稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置50ml量瓶中，用正己烷-二氯甲烷(1:1)定量稀释至刻度，摇匀，得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。(90ng/ml-450ng/ml)供试品溶液：取注射用水3ml，加入3ml正己烷-二氯甲烷(1:1)，混合萃取，静置，取有机层，即得。空白溶液；取正己烷-二氯甲烷(1:1)作为空白溶液。检测方法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液浓度与峰面积得线性方程，相关系数(r)不得小于0.99。供试品溶液中如有与各亚硝胺化合物保留时间一致的色谱峰，按线性方程法计算，即得。检测结果：未检出。氯化钠注射液样品检测图谱见图6。实施例6送检样品：葡萄糖注射液，生产单位：山东齐都药业有限公司。检测方法：气相条件：聚乙二醇色谱柱(vf-waxms，30m×0.25mm(0.25μm)，agilent)的毛细管柱，45℃，维持1min；以15℃/min速率升至140℃，以20℃/min速率升至230℃，维持12分钟；进样口温度250℃，载气为氦气，流速为线速度模式，柱流速每分钟1ml，总流量15.0ml/min。不分流进样，进样1μl，进样时间1.0分钟。质谱条件：采用ei源，离子源温度：200℃，接口温度：200℃。sim模式检测离子(m/z)为74、88、102、100、56、70、114、84、169；scan模式检测离子(m/z)35～500。对照品溶液：精密量取亚硝胺混合对照品0.45ml置200ml量瓶中，用二氯甲烷定量稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置50ml量瓶中，用正己烷-二氯甲烷(1:1)定量稀释至刻度，摇匀，得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。(90ng/ml-450ng/ml)供试品溶液：取注射用水3ml，加入3ml正己烷-二氯甲烷(1:1)，混合萃取，静置，取有机层，即得。空白溶液；取正己烷-二氯甲烷(1:1)作为空白溶液。检测方法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液浓度与峰面积得线性方程，相关系数(r)不得小于0.99。供试品溶液中如有与各亚硝胺化合物保留时间一致的色谱峰，按线性方程法计算，即得。检测结果：未检出。葡萄糖注射液样品检测图谱见图7。当前第1页12