一种电致化学发光成像系统及其成像方法与流程

本发明涉及电致化学发光成像技术领域，特别是涉及一种电致化学发光成像系统及其成像方法。

背景技术：

电致化学发光技术，又称电化学发光技术(ecl)，是一种高灵敏的电化学分析测试方法。它通过检测在外界电压驱动下，由物质内部电子转移诱导产生的发光现象，来确定被测物的物质成分和含量，具有高效的物质分析检测能力，广泛应用于小分子检测、金属离子检测、免疫分析等领域。

电致化学发光成像技术是对电致化学发光技术的扩展，通过在物体上标记具有电化学发光能力的活性探针分子，利用显微光路和具有空间分辨能力的光检测器件，实现了电致化学发光现象在电极表面空间分布情况的检测，可进一步得到电极活性区域、电流密度分布等信息。目前，电致化学发光成像技术已应用于电极表面的人类指纹成像、蛋白质层成像等领域，并具有对细胞表面抗原或细胞外泄分子成像的潜力。

扫描探针显微镜(scanningprobemicroscope，spm)是一系列显微成像技术的统称，其基本原理是利用超微探针在三维空间内对被测样品进行精细扫描，在扫描过程中同时检测探针与样品之间的相互作用(隧道电流、相互作用力、静电力、磁力、电化学电流等)，从而得到被测样品表面的相关信息(形貌、结构、导电性等)。从原理上讲，扫描探针成像技术的空间分辨率受限于超微探针的尺寸和扫描系统空间定位精度，与光学衍射极限半径无关，因此扫描探针成像技术的成像分辨率可达亚纳米级别，远远高于光学成像方法。

目前，普遍采用的电致化学发光成像检测方法，多是通过传统光学显微镜原理，以ccd或者emccd作为检测器件，检测电致化学发光强度空间分布。然而，由于受到光学衍射极限半径的限制，常规光学成像的空间分辨率最高为数百纳米；ccd或emccd的像元尺寸也限制了光强检测的灵敏度。目前尚无公开报道能够实现更高空间分辨率和光强检测灵敏度的电致化学发光成像检测方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的常规光学成像的空间分辨率最高为数百纳米,不能实现更高空间分辨率和光强检测灵敏度的电致化学发光成像检测方法的问题，本发明提供一种电致化学发光成像系统及其成像方法。

本申请的具体方案如下：

一种电致化学发光成像系统，包括：工作平台、机械底座、三维滚珠丝杠扫描器、三维压电扫描器、移动控制器、电致化学发光单元、光学检测单元和控制终端；所述电致化学发光单元包括导电探针、参比电极、辅助电极和恒电位仪；所述光学检测单元包括依次连接的光电检测电路和光强检测件；所述机械底座固定在工作平台上，所述机械底座的侧边设置有放置待测物的承载凸台，所述三维滚珠丝杠扫描器固定在机械底座上，所述三维压电扫描器固定在所述三维滚珠丝杠扫描器的z移动轴上，所述控制终端和移动控制器、恒电位仪、光电检测电路均连接；所述移动控制器还和三维压电扫描器、三维滚珠丝杠扫描器连接，所述恒电位仪还和导电探针、参比电极、辅助电极连接，所述导电探针的固定在所述三维压电扫描器上，所述导电探针对准待测物且在其上方移动，所述参比电极、辅助电极均放置在待测物旁边；所述承载凸台的中部设置有透光孔，所述光强检测件设置在承载凸台的下方且通过透光孔对准待测物。

优选地，所述光强检测件为光电倍增管。

优选地，所述导电探针的针尖为铂针尖，针尖导电部分形状为直径20微米的圆形，导电探针为玻璃封装，所述参比电极为银/氯化银参比电极，所述辅助电极为直径0.5毫米的铂金属丝。

优选地，所述待测物盛装在透光容器中，所述透光容器设置在承载凸台上。

优选地，所述三维滚珠丝杠扫描器包括两两相互垂直的x移动轴、y移动轴和z移动轴，所述三维滚珠丝杠扫描器的x移动轴固定在机械底座上。

一种基于上述电致化学发光成像系统的成像方法，包括：

s1，控制终端控制电致化学发光单元的导电探针接近被测物；

s2，控制终端控制导电探针在被测物上方逐点扫描，同时控制电致化学发光单元诱导被测物电致化学发光；

s3，光学检测单元检测导电探针在被测物上方逐点扫描时待测物的电致化学发光强度，并将电致化学发光强度发送至控制终端；

s4，控制终端将导电探针在逐点扫描时的空间位置和所述电致化学发光强度一一对应，得到电致化学发光的分布图像。

优选地，步骤s1包括：控制终端分别控制三维滚珠丝杠扫描器和三维压电扫描器移动，三维压电扫描器带动导电探针在z轴方向上移动，直至导电探针接近被测物。

优选地，步骤s2包括：控制终端通过移动控制器控制导电探针在x-y平面内按蛇形轨迹逐点扫描，同时控制终端控制恒电位仪在导电探针、参比电极、辅助电极上施加响应电压，导电探针的尖端处进行电化学反应激活待测物中的活性物质产生电致化学发光现象。

优选地，步骤s2还包括：所述恒电位仪在施加响应电压的同时记录流过导电探针的电化学电流，并将电化学电流发送给计算机。

优选地，步骤s4包括：以导电探针在x-y平面内的空间位置为x-y坐标，以对应点的电致化学发光强度为亮度值，得到光强空间分布的二维图像；以导电探针在x-y平面内的空间位置为x-y坐标，以对应点的电化学电流为亮度值，得到电化学电流空间分布的二维图像。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的电致化学发光成像方法，基于扫描探针显微成像原理，光学检测单元中的光电倍增管检测导电探针在x-y平面逐点扫描时，待测物的电致化学发光强度，控制终端将导电探针在x-y平面的空间位置和所述电致化学发光强度一一对应，得到电致化学发光的平面分布图像，成像的空间分辨率与光学衍射极限半径无关，只受限于导电探针尖端的尺寸和微探针空间移动系统的空间定位精度，具有远高于光学成像方式的成像分辨率。(2)发光强度检测件可以有多种选择，不受限于ccd或emccd等阵列化光学检测器件，在光强度检测灵敏度方面具有优势。

附图说明

图1为本发明的电致化学发光成像系统的示意性结构图；

图2为本发明的电致化学发光成像方法的示意性流程图；

图3(a)为利用的本发明的电致化学发光成像系统得到的光强空间分布的二维图。

图3(b)为利用的本发明的电致化学发光成像系统得到光强空间分布的二维图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

参见图1、一种电致化学发光成像系统，包括：工作平台5、机械底座6、三维滚珠丝杠扫描器7、三维压电扫描器8、移动控制器15、电致化学发光单元、光学检测单元和控制终端18；所述电致化学发光单元包括导电探针9、参比电极10、辅助电极11和恒电位仪16；所述光学检测单元包括依次连接的光电检测电路17和光强检测件14；所述机械底座6固定在工作平台5上，所述机械底座6的侧边设置有放置待测物12的承载凸台19，所述三维滚珠丝杠扫描器7固定在机械底座6上，所述三维压电扫描器8固定在所述三维滚珠丝杠扫描器7的z移动轴上，所述控制终端18和移动控制器15、恒电位仪16、光电检测电路17均连接；所述移动控制器15还和三维压电扫描器8、三维滚珠丝杠扫描器7连接，所述恒电位仪16还和导电探针9、参比电极10、辅助电极11连接，所述导电探针9的固定在所述三维压电扫描器8上，所述导电探针9对准待测物12且在其上方移动，所述参比电极10、辅助电极11均放置在待测物12旁边；所述承载凸台19的中部设置有透光孔，所述光强检测件14设置在承载凸台19的下方且通过透光孔对准待测物12。

本方案的电致化学发光成像系统的原理为：采用扫描探针显微成像原理，驱动导电探针9在待测物12附近不同位置产生电致化学发光现象，用发光强度检测器(光强检测件14)记录各个位置的电致化学发光强度，将得到的发光强度和导电探针9的空间位置一一对应，得到电致化学发光成像结果。

在本实施例，所述光强检测件14为光电倍增管。所述导电探针9的末端固定在所述三维压电扫描器8上，所述导电探针9的针尖为铂针尖，针尖导电部分形状为直径20微米的圆形，导电探针9为玻璃封装，所述参比电极10为银/氯化银参比电极10，所述辅助电极11为直径0.5毫米的铂金属丝。所述导电探针9、参比电极10、辅助电极11构成电化学三电极体系。所述待测物12盛装在透光容器13中，所述透光容器13设置在承载凸台19上。所述透光容器13为玻璃培养皿。待测物12为适用于电致化学发光现象的化学试剂，其中化学试剂中的电致化学发光活性探针分子可以是鲁米诺或者联吡啶钌类物质，也可以是量子点或其他具有电致化学发光活性的物质等。

所述导电探针9、参比电极10和辅助电极11的一端置于所述电致化学发光成像池(透光容器13)内，另一端连接至恒电位仪16以驱动导电探针9尖端附近产生电化学电流，刺激发光探针分子产生电致化学发光现象。

在本实施例，所述三维滚珠丝杠扫描器7包括两两相互垂直的x移动轴、y移动轴和z移动轴，所述三维滚珠丝杠扫描器7的x移动轴固定在机械底座6上。作为另一可实施例，所述三维滚珠丝杠扫描器的y移动轴固定在机械底座上。所述三维滚珠丝杠扫描器7的驱动方式是步进电机，空间分辨率为30nm。三维压电扫描器8的驱动方式是压电晶体，空间分辨率为1.9nm。所述三维滚珠丝杠扫描器7和三维压电扫描器8作为三维移动运动单元。

在本实施例，所述控制终端18为计算器。所述移动控制器15为pmt控制器。

参见图2、一种基于上述电致化学发光成像系统的成像方法，包括：

s1，控制终端18控制电致化学发光单元的导电探针9接近被测物；更具体地，步骤s1包括：控制终端18分别控制三维滚珠丝杠扫描器7和三维压电扫描器8移动，三维压电扫描器8带动导电探针9在z轴方向上移动，直至导电探针9接近被测物。控制终端18分别输出控制指令至移动控制器15，移动控制器15根据控制分别驱动三维滚珠丝杠扫描器7和三维压电扫描器8的移动。其中三维滚珠丝杠扫描器7带动三维压电扫描器8和导电探针9在x/y/z方向进行较大程度的移动，对导电探针9进行初步的定位。三维压电扫描器8移动带动导电探针9在x/y/z方向进行微调，最终使得导电探针9接近被测物。

s2，控制终端18控制导电探针9在x-y平面内按蛇形轨迹逐点扫描，同时控制电致化学发光单元诱导被测物电致化学发光；更具体地，步骤s2包括：控制终端18通过移动控制器15控制导电探针9在x-y平面内按蛇形轨迹逐点扫描，同时控制终端18控制恒电位仪16在导电探针9、参比电极10、辅助电极11上施加响应电压，导电探针9的尖端处进行电化学反应激活待测物12中的活性物质产生电致化学发光现象。所述恒电位仪16在产生响应电压的同时记录流过导电探针9的电化学电流，并发送给计算机。

s3，光学检测单元检测导电探针9在x-y平面逐点扫描时，待测物12的电致化学发光强度，并将电致化学发光强度发送至控制终端18；更具体地，步骤s3包括：光电倍增管检测导电探针9在各个位置的待测物12的电致化学发光强度，光电检测电路17对所述电致化学发光强度进行处理后发送至控制终端18。

s4，控制终端18将导电探针9在x-y平面的空间位置和所述电致化学发光强度一一对应，得到电致化学发光的平面分布图像。更进一步地，步骤s4包括：以导电探针9在x-y平面内的空间位置为x-y坐标，以对应点的电致化学发光强度为亮度值，得到光强空间分布的二维图像，参见图3(b)；以导电探针9在x-y平面内的空间位置为x-y坐标，以对应点的电化学电流为亮度值，得到电化学电流空间分布的二维图像，图3(a)。

需要说明的是，本实施例是在x-y平面内做蛇形轨迹扫描，但是本方案的成像方法不限于x-y平面内蛇形轨迹扫描，可以是任何一种扫描轨迹，只要能把导电探针针尖的空间位置和检测到的发光强度对应起来，就可以得到图像。比如导电探针可以在x-y-z三维空间内任何一个方向做直线扫描，得到的是一条表示直线上各个位置发光强度的曲线；导电探针可以在x-y-z三维空间内任何一个平面内做逐点扫描，得到发光强度的二维图像；导电探针甚至可以做x-y-z三维空间的立体扫描，得到立体图像。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。