一种新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法与流程

本发明属于生物技术技术领域，尤其是属于针对新型冠状病毒(2019-ncov)电化学检测技术领域。

背景技术：

新型冠状病毒(2019-ncov)是一种以前尚未在人类中发现的新型冠状病毒，可以通过飞沫、气溶胶、接触等方式传播，会引起从普通感冒到重症肺炎的各种症状，有较高的传染性和危害性。目前，2019-ncov的常规检测方法基本上是荧光pcr法，但该方法存在设备昂贵、耗时、维护成本高、检测灵敏度不高等问题。电化学法具有高效、快速、灵敏、廉价等优点，然而目前关于电化学检测2019-ncov的研究还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种便捷、高检测灵敏度和无需高价仪器即能开展检测2019-ncov的方法。本发明用于基于探针识别技术检测人源新型冠状病毒(2019-ncov)的rna。本发明针对新型冠状病毒2019-ncov的电化学检测具有操作简单、检测快速/准确、低成本的显著优点。

本发明采用如下技术方案实现。

一种新型冠状病毒2019-ncov的电化学检测方法，其步骤如下：

(1)四氧化三铁(fe3o4)纳米微球的制备

把三氯化铁水合物加入到乙二醇中形成澄清溶液，并加入乙酸钠和聚乙二醇，搅拌30～60分钟后，放入水热反应釜中加热反应，冷却到室温后得黑色沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀，干燥后得到fe3o4纳米微球；

其中所述三氯化铁在乙二醇中的质量体积浓度为0.2％～0.5％，水热反应是在120～220℃下反应5～10小时，干燥是在60～100℃下处理6～10小时，乙酸钠与三氯化铁的质量比为3～6:1，聚乙二醇与三氯化铁的质量比为1:2～3:1；

(2)金纳米粒子负载fe3o4纳米复合物(au@fe3o4)的制备

将步骤(1)fe3o4纳米微球分散于超纯水中，超声分散均匀后，依次加聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸和抗坏血酸，搅拌，用磁铁分离后得到黑色沉淀，用无水乙醇洗涤后得到au@fe3o4复合物；

所述聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸、抗坏血酸的在超纯水中的浓度分别为0.10～0.25mg/ml、1～5mg/ml、2～6mg/ml、1～6mg/ml；

(3)金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/电信号物质复合物(au@rgo-scx8@mb)的制备

将4-磺酸杯[8]芳烃水合物(scx8)、氧化石墨烯(rgo)分散到去离子水中，超声后调节ph值为7.0～12.0，回流反应后，离心，弃去上清液，固体用去离子水洗涤3～4次，得到还原的氧化石墨烯-scx8复合物(rgo-scx8)；将rgo-scx8复合物分散于去离子水中，超声分散均匀后加入haucl4，搅拌、离心分离后弃去上清液，固体用去离子水洗涤，得到au@rgo-scx8复合物；把au@rgo-scx8复合物超声分散于去离子水中，然后加入电信号物质，搅拌，离心分离得到沉淀，用去离子水洗涤沉淀，最后得到au@rgo-scx8-电信号物质复合物；

所述scx8和氧化石墨在去离子水中的质量浓度均为0.1％～0.5％；haucl4在rgo-scx8复合物(rgo-scx8)分散液中的质量浓度为1％～5％；

所述电信号物质为能被scx8或其他大环超分子识别的电活性物质，每1mlau@rgo-scx8复合物分散液中添加0.2～1mg电信号物质；电信号物质可以是甲苯胺蓝、亚甲基蓝或二茂铁。

(4)探针序列合成

从ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载2019-ncov病毒的rna参考序列(genbankno.mn908947.3)，筛选两个靶点分别位于orf1ab和n两个结构域，并通过ucsc数据库(www.genome.ucsc.edu)检测这两个靶点的特异性。

每个靶点的检测需要三个探针捕获探针(captureprobe,cp)，标签信号探针(labeledsignalprobe,lp)和辅助探针(auxiliaryprobe,ap)。

捕获探针cp和信号探针lp序列的3’端用巯基修饰，这样可以通过配位结合作用，让两个探针分别连接到au@fe3o4复合物和au@rgo-scx8复合物上。

靶标1：orf1ab

cp：acctttccacataccgcagacg-(ch2)6-sh

lp：tcgagttacgctaagcgcggagttgatcacaacta-(ch2)6-sh

ap：cttagcgtaactcga-tagttgtgatcaactccgcg

靶标2：n

cp：caatctgtcaagcagcagca-(ch2)6-sh

lp：tcgagttacgctaagagacattttgctctcaagct-(ch2)6-sh

ap：cttagcgtaactcgaagcttgagagcaaaatgtct

(5)电化学传感器的构建

将au@fe3o4复合物超声分散在缓冲液ⅰ中，au@fe3o4复合物在缓冲液ⅰ中的浓度为0.5～3mg/ml，并加入捕获探针，捕获探针在缓冲液ⅰ中浓度为0.5～10μmol/l，在4℃的条件下放置5～20小时，磁铁分离；然后将固体加入缓冲液ⅰ和己硫醇，固体在缓冲液ⅰ中的浓度为0.5～3mg/ml，己硫醇在缓冲液ⅰ中浓度为1～5mmol/l，己硫醇用来封闭非特异性位点，室温放置10～40min后，用磁铁分离，在分离后固体中加入缓冲液ⅱ和浓度范围在10^-18～10^-9mol/l的目标rna，分离后固体在缓冲液ⅱ中的浓度是0.5～5mg/ml；室温下放置1～2小时后磁铁分离，在分离的固体中依次加入信号探针、辅助探针和au@rgo-scx8-电信号物质复合物分散液，室温下放置1～2小时后磁铁分离，将固体分散在磷酸缓冲液中，取分散液滴于丝网印刷电极表面，并在电化学工作站上用示差脉冲伏安法、循环伏安法或交流伏安法确定目标rna的浓度和峰电流的关系，并获得电流强度与rna浓度的标准曲线，进而完成电化学传感器的构建；

其中所述信号探针和辅助探针的初始浓度均为10～20μmol/l，每1mg分离的固体中各添加100～150μl的信号探针和辅助探针；au@rgo-scx8-电信号物质复合物分散液(去离子水分散液)的浓度为1～5mg/ml，每1mg分离的固体中添加1～1.5ml的au@rgo-scx8-电信号物质复合物分散液，探针用超纯水稀释。

所述每0.1mg固体添加2-10μl浓度范围在10^-18～10^-9mol/l的目标rna。

所述缓冲液ⅰ为含有10mmol/ltris-hcl、1mmol/ledta、300mmol/lnacl、1mmol/lmgcl2的溶液；

缓冲液ⅱ为含有10mmol/ltris-hcl、1mmol/ledta、300mmol/lnacl、1mmol/ltcep的溶液。

所述磷酸缓冲液ph为7.2。

根据上述步骤(5)中得到的标准曲线计算待测样品中2019-ncov中rna的浓度，并根据该结果来评价待检样本中是否存在2019-ncov，从而判断是否被病毒感染。

该技术可用于样品的快速、床旁即时诊断、微创检测等领域。

(6)目标rna(2019-ncov特异性rna片段)的测定

用构建的电化学传感器来测定2019-ncov特异性rna片段，如图1所示，对于两种目标rna(orf1ab和n)，当没有目标rna时，电化学信号较低，而有目标rna片段时电流明显增大，由此证明传感器的可行性。用该信号可以判断目标rna的存在或者进一步定量。

除上述技术方案之外，本发明步骤三中除4-磺酸杯[8]芳烃水合物scx8之外，还可以是杯[6]芳烃、环糊精、柱芳烃等能和信号分子形成主客体包合物的大环超分子。

本发明的技术要点及原理简述：

1、本发明中的关键技术点是通过石墨烯、金纳米粒子和大环超分子对信号分子的富集和催化作用，来实现电化学信号的放大。本发明中的超分子较为稳定，为实现其产业化应用奠定基础；

2、所使用的电信号富集材料为对甲苯胺蓝等识别能力较强的scx8或其他大环超分子，因此具有较好的电信号放大效果；同时，scx8有较好的化学稳定性，有利于产品的稳定和产业化开发；

4、本发明中电化学传感器所检测的目标rna是通过碱基候补的单链dna捕获探针来识别的，有较强的特异性；

5、本发明中由于电化学传感器具有fe3o4的催化效应、scx8的富集效应和金纳米粒子的导电效应，可以有效的放大信号从而有较低的检出限；

6、本发明中的方法具有简单可控、检出限低和信号易于采集等优点，可快速检测待测样品的浓度，且灵敏度高；

7、本发明中的电化学传感器可以测定rna的实际浓度，即可以绝对定量。与现有技术相比，本发明具有如下特点：

1、本发明无需核酸的pcr扩增等过程，可以有效的节省样品前处理的时间；

2、本发明无需复杂的标记和固定dna探针分子操作过程，其主要利用捕获探针分子末端修饰的巯基与纳米材料表面的金纳米粒子配位形成稳定的探针；

3、本发明中电化学传感器中所使用的电信号富集材料为对甲苯胺蓝等识别能力较强的scx8或其他大环超分子，因此具有较好的电信号放大效果；同时，scx8等大环超分子均有较好的化学稳定性，有利于产品的稳定和产业化开发；

4、本发明中电化学传感器所检测的目标rna是通过碱基候补的单链dna捕获探针来识别的，有较强的特异性；

5、本发明中由于电化学传感器具有fe3o4的催化效应、scx8的富集效应和金纳米粒子的导电效应，可以有效的放大信号从而使传感器有较低的检出限；

6、本发明中的方法具有简单可控、检出限低和信号易于采集等优点，可快速检测待测样品的浓度，且灵敏度高；

7、本发明中的电化学传感器可以测定rna的实际浓度，即可以绝对定量；

8、本发明中的电化学传感器可直接测定rna样品，无需将待测rna样品反转录为cdna检测。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1为本发明电化学传感器对目标核酸(2019-ncov特异性rna片段orf1ab结构域)的响应图。

图2为本发明电化学传感器对目标核酸(2019-ncov特异性rna片段n结构域)的响应图。

具体实施方式

一种新型冠状病毒2019-ncov的电化学检测方法，其步骤如下：

(1)四氧化三铁(fe3o4)纳米微球的制备

把三氯化铁水合物加入到乙二醇中形成澄清溶液，并加入乙酸钠和聚乙二醇，搅拌50分钟后，放入水热反应釜中加热反应，冷却到室温后得黑色沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀，干燥后得到fe3o4纳米微球；

其中所述三氯化铁在乙二醇中的质量体积浓度为0.3％，水热反应是在180℃下反应8小时，干燥是在70℃下处理6小时，乙酸钠与三氯化铁的质量比为4:1，聚乙二醇与三氯化铁的质量比为1:1；

(2)金纳米粒子负载fe3o4纳米复合物(au@fe3o4)的制备

将步骤(1)fe3o4纳米微球分散于超纯水中，超声分散均匀后，依次加聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸和抗坏血酸，搅拌，用磁铁分离后得到黑色沉淀，用无水乙醇洗涤后得到au@fe3o4复合物；

所述聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸、抗坏血酸的在超纯水中的浓度分别为0.15mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml；

(3)金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/电信号物质复合物(au@rgo-scx8@mb)的制备

将4-磺酸杯[8]芳烃水合物(scx8)、氧化石墨烯(rgo)分散到去离子水中，超声后调节ph值为7.4，回流反应后，离心，弃去上清液，固体用去离子水洗涤4次，得到还原的氧化石墨烯-scx8复合物(rgo-scx8)；将rgo-scx8复合物分散于去离子水中，超声分散均匀后加入haucl4，搅拌、离心分离后弃去上清液，固体用去离子水洗涤，得到au@rgo-scx8复合物；把au@rgo-scx8复合物超声分散于去离子水中，然后加入电信号物质，搅拌，离心分离得到沉淀，用去离子水洗涤沉淀，最后得到au@rgo-scx8-电信号物质复合物。

(4)电化学传感器的构建

将au@fe3o4复合物超声分散在缓冲液ⅰ中，au@fe3o4复合物在缓冲液ⅰ中的浓度为1mg/ml，并加入捕获探针，捕获探针在缓冲液ⅰ中浓度为2μmol/l，在4℃的条件下放置12小时，磁铁分离；然后将固体加入缓冲液ⅰ和己硫醇，固体在缓冲液ⅰ中的浓度为1mg/ml，己硫醇在缓冲液ⅰ中浓度为2mmol/l，己硫醇用来封闭非特异性位点，室温放置20min后，用磁铁分离，在分离后固体中加入缓冲液ⅱ和浓度范围在10^-18～10^-9mol/l的目标rna，分离后固体在缓冲液ⅱ中的浓度是2mg/ml；室温下放置1小时后磁铁分离，在分离的固体中依次加入信号探针、辅助探针和au@rgo-scx8-电信号物质复合物分散液，室温下放置2小时后磁铁分离，将固体分散在磷酸缓冲液中，取分散液滴于丝网印刷电极表面，并在电化学工作站上用示差脉冲伏安法、循环伏安法或交流伏安法确定目标rna的浓度和峰电流的关系，并获得电流强度与rna浓度的标准曲线，进而完成电化学传感器的构建；

其中所述信号探针和辅助探针的初始浓度均为20μmol/l，每1mg分离的固体中各添加120μl的信号探针和辅助探针；au@rgo-scx8-电信号物质复合物分散液(去离子水分散液)的浓度为2mg/ml，每1mg分离的固体中添加1.2ml的au@rgo-scx8-电信号物质复合物分散液，探针用超纯水稀释。

所述每0.1mg固体添加5μl浓度范围在10^-18～10^-9mol/l的目标rna。

所述缓冲液ⅰ为含有10mmol/ltris-hcl、1mmol/ledta、300mmol/lnacl、1mmol/lmgcl2的溶液；

缓冲液ⅱ为含有10mmol/ltris-hcl、1mmol/ledta、300mmol/lnacl、1mmol/ltcep的溶液。

所述磷酸缓冲液ph为7.2。

根据上述步骤(4)中得到的标准曲线计算待测样品中2019-ncov中rna的浓度，并根据该结果来评价待检样本中是否存在2019-ncov，从而判断是否被病毒感染。

该技术可用于样品的快速、床旁即时诊断、微创检测等领域。

(5)目标rna(2019-ncov特异性rna片段)的测定

用构建的电化学传感器来测定2019-ncov特异性rna片段，如图1、图2所示，对于两种目标rna(orf1ab和n，10^-12m)，当没有目标rna时，电化学信号较低，而又目标rna片段时电流明显增大，由此证明传感器的可行性。用该信号可以判断目标rna的存在或者进一步定量。

以上所述的仅是本发明的具体实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

<110>云南大学

<120>一种新型冠状病毒2019-ncov的电化学检测方法

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