一种适用于扫描电镜的带纤毛生物样品的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体的说是涉及一种适用于扫描电镜的带纤毛生物样品的制备方法。

背景技术：

扫描电镜的用途是观察样品的表面形貌，将样品的被观察面充分、真实地展示出来，是最终得出清晰形貌照片的首要条件。因此样品的前处理是进行电镜观察的关键过程，其处理效果的好坏直接关系到电镜观察的实验结果。

生物样品的扫描电镜前处理一般有样品清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金等步骤。但带纤毛的生物样品表面易分泌黏液粘附纤毛，纤毛易团聚，使得按照普通制样方法完成之后，扫描电镜下看到的纤毛聚集成团，舒展不开，拍不出根根清晰的纤毛形态。因此如何把带纤毛的生物样品拍摄清晰真实，一直是电镜技术人员的难题，所以需要找到更适合带纤毛生物样品的扫描电镜前处理方法。

带纤毛的生物样品之所以拍摄有难度，主要是因为样品表面易分泌黏液，从而粘附纤毛，使得处理过后的样品纤毛塌陷团聚，电镜下不能展现其真实形貌。通常的处理方法是用pbs清洗，但效果并不理想。因此采用怎样的处理方式使被黏液团聚的纤毛舒展开，而后获得更适合扫描电镜观察的样品是现在急需解决的问题。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明目的在于提供一种适用于扫描电镜的带纤毛生物样品的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种适用于扫描电镜的带纤毛生物样品的制备方法，包括样品清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金等步骤，待处理样品固定前，用透明质酸酶溶液进行前处理。

进一步的说，将待处理样品固定前，经浓度为3—5％的透明质酸酶溶液浸泡3-10min。

所述透明质酸酶溶液用0.1m磷酸缓冲溶液配制。

更进一步的说，将待处理样品固定前，经浓度为3％的透明质酸酶溶液浸泡3-5min。

所述透明质酸酶溶液浸泡后，用0.1m磷酸缓冲溶液清洗样品3次，每次3min。

所述的带纤毛生物样品为新鲜样品，未经过冷冻处理或化学固定剂浸泡。

本发明所具有的优点：

本发明提供的制备扫描电镜带纤毛生物样品的方法简单易行且效果良好，本发明在制备样品过程中通过加入特定浓度下的透明质酸酶溶液进行处理。透明质酸酶可以水解样品表面黏液，降低黏液粘度，便于对样品表面进行清洗，从而使团聚的纤毛舒展开；进而在后续样品处理中能更好地保持生物样品表面纤毛的形态结构，使纤毛不易发生变形、皱缩及聚团，最终即可获得较为清晰的纤毛结构扫描电镜图像，本发明的方法可为带纤毛生物样品的扫描电镜制样提供了一种新的方法。

附图说明

图1为应用常规制样方法得到的扇贝幼虫口前纤毛扫描电镜图像；

图2为应用常规制样方法得到的扇贝幼虫口前纤毛扫描电镜放大图像；

图3为采用本发明实施例1的方法得到的扇贝幼虫口前纤毛扫描电镜图像。

图4为采用本发明实施例1的方法得到的扇贝幼虫口前纤毛扫描电镜放大图像。

图5为应用常规制样方法得到的大鼠鼻腔上皮组织纤毛的扫描电镜图像；

图6为采用本发明实施例2的方法得到的大鼠鼻腔上皮组织纤毛的扫描电镜图像。

具体实施方式

以下通过具体实施例的形式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明解决了现阶段扫描电镜带纤毛生物样品前处理过程中最棘手的问题，即纤毛的团聚问题，通过本发明方法即可获得其较为清晰的纤毛结构扫描电镜图像；同时在制备样品过程中其他各步骤可参照常规扫描电镜生物样品前处理方法进行。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例中的百分比浓度均为质量百分比浓度。

实施例1

扫描电镜扇贝幼虫的制备方法步骤如下：

(1)取新鲜的扇贝幼虫，用0.1m磷酸缓冲溶液洗涤幼虫三次，用3％透明质酸酶溶液浸泡5min；

(2)用0.1m磷酸缓冲溶液洗涤幼虫3遍，每次3min；

(2)将幼虫浸于2.5％戊二醛固定液中，放置于4℃冰箱中固定12h；

(5)用0.1m磷酸缓冲溶液洗涤幼虫5遍，每次5min；

(6)依次用30％，50％，70％，80％，90％，95％,100％梯度乙醇脱水，每次8min；

(7)用100％丙酮置换2次，每次8min；

(8)用临界点干燥仪对样品进行干燥；

(9)干燥完成后，取出样品并用导电胶带粘于样品台上；

(10)用离子溅射仪对样品镀膜；

(11)用扫描电子显微镜观察并拍照，加速电压5kv(参见图3和4)。

由图3，4，可见采用本发明制样的样品的前处理后，在扫描电镜下可以看到，拍摄幼虫整体时，明显可以看到体表有纤毛伸出(图3)，放大后纤毛更加清晰(图4)，说明本发明提供的方法可以很好地清洗掉纤毛表面的黏液，使纤毛伸展，反映出扇贝幼虫的真实形态。

实施例2

本实施例采用的样品为哺乳动物：大鼠鼻腔上皮组织。

扫描电镜大鼠鼻腔上皮组织的制备方法步骤如下：

(1)取新鲜的大鼠鼻腔上皮组织，用0.1m磷酸缓冲溶液洗涤样品三次；

(2)用3％透明质酸酶溶液浸泡5min；

(3)用0.1m磷酸缓冲溶液洗涤样品3遍，每次3min；

(4)将样品浸于2.5％戊二醛固定液中，放置于4℃冰箱中固定12h；

(5)用0.1m磷酸缓冲溶液洗涤样品5遍，每次5min；

(6)依次用30％，50％，70％，80％，90％，95％,100％梯度乙醇脱水，每次8min；

(7)用100％丙酮置换2次，每次8min；

(8)用临界点干燥仪对样品进行干燥；

(9)干燥完成后，取出样品并用导电胶带粘于样品台上；

(10)用离子溅射仪对样品镀膜；

(11)用扫描电子显微镜观察并拍照，加速电压5kv(参见图6)由图6，可见采用本发明制样的样品的前处理后，在扫描电镜下可以看到，大鼠鼻腔上皮组织表面纤毛完整，根根分明(图6)，说明本发明提供的方法可以很好地清洗掉纤毛表面的黏性物质，使纤毛伸展，反映出大鼠鼻腔上皮纤毛的真实形态。

对比例

常规扫描电镜带纤毛生物样品的制备方法步骤如下：

(1)取新鲜的样品，用0.1m磷酸缓冲溶液洗涤三次；

(2)将样品浸于2.5％戊二醛固定液中，放置于4℃冰箱中固定12h；

(3)用0.1m磷酸缓冲溶液洗涤样品5遍，每次5min；

(6)依次用30％，50％，70％，80％,90％，95％,100％梯度乙醇脱水，每次8min；

(7)用100％丙酮置换2次，每次8min；

(8)用临界点干燥仪对样品进行干燥；

(9)干燥完成后，取出样品并用导电胶带粘于样品台上；

(10)用离子溅射仪对样品进行镀膜；

(11)用扫描电子显微镜观察并拍照，加速电压5kv(参见图1、2和图5)。

由图1和2可见，采用常规制样方法得到的扇贝幼虫，在扫描电镜下可以看到，拍摄幼虫整体时，未看到体表纤毛(图1)，放大后发现幼虫胚体表面布满粘附团聚的纤毛(图2)，说明其纤毛被胚体分泌物所粘附，纤毛伸展不出。由图5可见，用常规制样方法得到的大鼠鼻腔上皮组织，在扫描电镜下有很多黏性丝状物缠绕纤毛(图5)，使纤毛团聚在一起。说明常规制样方法不能完整、形象地反映出带纤毛生物样品的真实形态。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。