一种检测牛羊肉中掺杂鸡肉的试纸条及方法与流程

本发明属于食品质量安全检测技术领域，涉及一种检测牛羊肉中掺杂鸡肉的胶体金试纸条及方法。

背景技术：

近年来，随着社会的发展和经济水平的提高，人们的饮食结构发生了重大的改变，肉及肉制品逐渐成为人们日常饮食中的重要组成部分。但与此同时，也出现了许多肉制品掺假现象，许多不法商贩以价格低廉的鸡肉、鸭肉以及其它动物肉类冒充价格较高的牛肉、羊肉，赚取高额利润。这种欺诈行为不仅损害消费者的权益，而且扰乱了市场秩序。因此，建立准确、灵敏、快速的肉类掺假鉴别方法，对保障肉及肉制品安全、维护消费者权益都具有重要的现实意义。

目前针对肉及肉制品掺假问题，采用的检测技术主要为基于蛋白质的酶联免疫吸附技术(elisa)与蛋白质谱技术，基于代谢物的红外光谱、电子鼻与电子舌技术，以及基于核酸的pcr技术等。其中，elisa方法虽然简单，但容易受到加热及蛋白变性等因素的影响，应用并不广泛；蛋白质谱技术因为操作复杂，目前主要被用于某些如牛奶、蜂胶等含dna较少的产品的鉴别；电子鼻、电子舌及近红外广谱等技术用于肉类品种的鉴别准确度较低，目前主要用于肉的品质分析；基于核酸的pcr技术是目前肉类鉴别的主流技术，但需要昂贵的仪器、专业的操作人员，检测过程繁琐且费时多，而且dna技术的高灵敏度导致其容易被污染，这一方面对样品的采集有更高的要求，另一方面对检测的环境也有更高的要求，这些缺点导致其并不适合大规模推广及应用。因此，针对现有肉及肉制品掺假检测技术上的不足，我们设计了一种基于胶体金免疫层析技术检测牛羊肉中掺杂鸡肉的方法，该方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够检测牛羊肉中掺杂鸡肉的胶体金试纸条，并且提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。

本发明所提供的检测牛羊肉中掺杂鸡肉的试纸条，包括试纸和微孔试剂；所述试纸包括背板、反应膜、样品吸收垫、吸水垫，其依次连接，所述反应膜上具有包被有鸡igy的检测线和包被有兔抗羊抗体的质控线；所述微孔试剂上冻干有羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物，其具有微孔塞。

所述羊抗鸡igy抗体是以鸡igy作为免疫原免疫山羊制备获得。

所述背板为ps背板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫为聚酯纤维或玻璃纤维材质；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被有鸡igy的检测线和包被有兔抗羊抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、背板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测牛羊肉中掺杂鸡肉的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试纸条进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明的牛羊肉中掺杂鸡肉快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，样品中的鸡igy先与其充分反应，形成鸡igy-羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物；再滴入试纸条加样孔内，样本中的鸡igy在流动过程中与反应膜检测线上的鸡igy竞争结合羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅或使用胶体金分析仪检测t/c线的颜色信号来判断待测样品中是否掺杂鸡肉成分。

检测时，样品经处理后滴入微孔试剂内，充分反应后再加入试纸条加样孔内，当鸡肉在样品中的掺杂浓度低于检测限或为零时，羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的鸡igy结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致，或胶体金分析仪读数t/c≥1；如果鸡肉在样品中的掺杂浓度等于或高于检测限，羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物会与鸡igy全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与t线上的鸡igy结合而不出现红色条带或比c线显色浅，或胶体金分析仪读数t/c＜1。如图3所示。

阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。

阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。

无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的羊抗鸡igy抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测牛羊肉中掺杂鸡肉的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸剖面结构示意图。

图2为微孔试剂图。

图3为试纸条检测结果判定图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1检测牛羊肉中掺杂鸡肉的试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备冻干有羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被有鸡igy的检测线和包被有兔抗羊抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、背板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5ml1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。

(2)羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/l碳酸钾溶液调胶体金的ph值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入5～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入羊抗鸡igy抗体，继续搅拌混匀30min；静置10min后加入10％bsa，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含bsa的质量分数为0.1％～0.5％、蔗糖的质量分数为2％～4％、ph7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液。

2、微孔试剂的制备

向微孔试剂微孔板中加入50μl羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有羊抗鸡igy抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。

3、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白、ph为7.2、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液中浸泡1h，37℃下烘干4h以上备用。

4、反应膜的制备

将鸡igy包被到反应膜上构成检测线，将兔抗羊抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用0.01mol/l、ph7.4的磷酸缓冲液将鸡igy稀释到1mg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(t线)，包被量为0.9μl/cm；用0.01mol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液将兔抗羊抗体稀释到200μg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(c线)，包被量为0.9μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下过夜后备用。

5、试纸条的组装

根据附图1所示试纸剖面结构，将样品吸收垫(1)、反应膜(2)、吸水垫(3)依次按顺序粘贴在ps背板(6)上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与ps背板的始端对齐，吸水垫的末端与ps背板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(4)和质控线(5)，检测线(t线)和质控线(c线)均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线位于靠近样品吸收垫的末端的一侧；质控线位于远离样品吸收垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3.98mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中。

根据附图2所示微孔试剂图，微孔试剂7上具有微孔塞8。

将上述试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例2牛羊肉中掺杂鸡肉的检测

1、样品前处理

用匀浆机匀浆牛羊肉样本；称取3.0g±0.05g样本，加入6ml0.02mol/l磷酸盐缓冲液，充分混匀；室温(20～25℃)4000r/min离心5min，将上清液用0.02mol/l磷酸盐缓冲液进行1:4稀释后即为待测样本液。

2、用试纸条进行检测

用微量移液器吸取200μl待测样本液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；室温(20-25℃)孵育3min后，吸取混匀液90μl垂直滴于加样孔中；液体流动开始计时，反应10min，判定结果。

3、分析检测结果

(1)肉眼判定

阴性(－)：t线显色比c线显色深或与c线显色一致，表示样品中鸡肉掺杂浓度低于检测限，如图3a、3b。

阳性(+)：t线显色比c线显色浅或t线不显色，表示样品中鸡肉掺杂浓度等于或高于检测限，如图3c、3d。

无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图3e、3f。

(2)仪器判定

用胶体金分析仪检测t/c线的颜色信号，t/c≥1，判为阴性，表示样品中鸡肉掺杂浓度低于检测限；t/c＜1，判为阳性，表示样品中鸡肉掺杂浓度等于或高于检测限。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取纯牛羊肉样本，在其中分别掺杂鸡肉至浓度为0％、0.39％、0.78％、1.56％、3.13％、6.25％、12.5％、25％、50％，用试纸条进行检测，分别用肉眼和仪器判定，结果见表1。

表1检测限试验结果

由上表可以看出：纯鸡肉样本肉眼观察t线消失，仪器检测t/c＜1，为阳性；纯牛肉、羊肉样本肉眼观察t线显色比c线深，仪器检测t/c＞1，为阴性；在牛、羊肉中掺杂鸡肉，随着掺杂浓度的增加，t线显色逐渐变浅，直至完成消失，仪器检测t/c逐渐降低，直至掺杂浓度为3.13％时t/c＜1。因此，本发明试纸条的检测限为鸡肉掺杂浓度3％。

2、重复性试验

取纯牛羊肉样本各1份，在其中分别掺杂鸡肉至浓度为3％，用试纸条进行检测，每个样本重复6次，观察检测结果，并计算仪器检测t/c的变异系数，结果见表2。

表2重复性试验结果

由上表可以看出：对同一样本重复检测6次，肉眼判定结果一致，无假阳性、假阴性出现，而仪器检测t/c变异系数均＜10％。说明本发明试纸条的重复性较好。

3、特异性试验

用本试纸条检测6种鸡肉、4种羊肉、5种牛肉、3种鸭肉、8种猪肉和2种鱼肉样本，结果发现，6种鸡肉样本均为阳性(t/c值<0.026)，4种羊肉(t/c>1.734)、5种牛肉(t/c>1.874)、3种鸭肉(t/c>1.299)、8种猪肉(t/c>1.763)和2种鱼肉(t/c＞1.770)样本均为阴性，说明本发明试纸条的特异性较好。

表3特异性试验结果