一种便可通片标准指纹图谱的构建方法和测定便可通片成分含量的方法与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种便可通片标准指纹图谱的构建方法和测定便可通片成分含量的方法。

背景技术：

便秘是常见病、多发病，针对便秘有效治疗药物缺少，依托传统中医药理论，开发以治疗便秘为主的创新中药，是市场需求导向，也是继承发展中医药传统的重要创举。创新中药“便可通片”是以治疗便秘为主的创新中药，已获得临床研究批件，以便可通片研发创新中药对于中医药事业的可持续发展具有极大的战略意义。便可通片由芦荟3～6重量份、枳实6～11重量份、决明子6～11重量份、火麻仁6～11重量份、肉苁蓉6～11重量份、桃仁6～11重量份、当归6～11重量份、玄参18～25重量份和生地黄18～25重量份组成。

目前中成药的质量标准多采用单一指标成分的含量，不符合中医药多成分、多靶点、多途径的作用特点。中药hplc指纹图谱是采用高效液相色谱手段标定中药共有特征峰图谱，能够综合反映中成药制剂的主要组分情况，是一种综合的、整体的、可量化的质量评价手段。目前，利用中药指纹图谱来进行中成药质量评价，说明批次间的一致性已经被国内外广泛接受和认可。现有该品种的质量标准仅对处方中的阿魏酸进行定量测定，标准较简单，且阿魏酸含量较低，难以全面控制产品质量，尚无贴合中医药特色的质量评价标准。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种便可通片标准指纹图谱的构建方法和测定便可通片成分含量的方法，本发明的指纹图谱具有较好的可控性，峰的数量多，峰形好，峰的分离度好，并且重复高，可有效分离结构相近物质，有利于对便可通片的质量进行控制，本发明能同时对四种有效成分进行鉴别。

本发明提供一种便可通片标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)供试品溶液的制备：取便可通片，除去包衣，研磨，和甲醇混合，超声处理，定容，过滤，取滤液，得供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：将芦荟苷用甲醇和0.1％体积浓度醋酸水混合溶液溶解，将柚皮苷、新橙皮苷和松果菊苷分别用甲醇溶解，分别得到芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷对照品溶液；

3)高效液相色谱检测：

色谱条件为：色谱柱为c18反相色谱柱；柱温为25℃；检测波长为300nm，采用流动相a为甲醇，流动相b为0.1％体积浓度的醋酸水溶液，总流速为1ml/min；进行梯度洗脱，梯度洗脱程度见下表1：

表1梯度洗脱程序表

4)便可通片标准指纹图谱的建立：吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，用步骤3)的高效液相色谱检测，匹配16个共有峰，确定6个特征峰，建立便可通片标准指纹图谱。

优选的，步骤1)所述供试品溶液的制备方法中，供试品的质量浓度为0.02g/ml。

优选的，步骤1)所述供试品溶液的制备方法中，超声处理的功率为500w，频率为40khz，超声处理的温度低于25℃。

优选的，步骤3)的色谱条件中，色谱柱为cl8色谱柱，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。

优选的，所述步骤2)对照品溶液的制备方法中，甲醇和0.1％体积浓度醋酸水混合溶液的体积比为39:61。

优选的，所述芦荟苷质量浓度为0.04618～0.9235mg/ml，柚皮苷质量浓度为0.03780～0.7561mg/ml，新橙皮苷质量浓度为0.03755～0.7510mg/ml，松果菊苷质量浓度为0.02598～0.5196mg/ml。

优选的，所述吴茱萸药材特征图谱有6个特征峰，其中2号峰为松果菊苷，4号峰为柚皮苷，5号峰为新橙皮苷，9号峰为芦荟苷，15号峰为芦荟大黄素，16号峰为大黄酸；

表2特征图谱6个特征峰的相对保留时间

以9号峰为参照峰，所述吴茱萸药材特征图谱的6个特征峰的相对保留时间如表2所示。

一种利用便可通片标准指纹图谱的测定便可通片成分含量的方法，步骤为，根据便可通片标准指纹图谱计算得到松果菊苷、柚皮苷、新橙皮苷和芦荟苷的含量。

目前，中药特别是中药混合物的指纹图谱构建中，由于中药包括多种原料，因此为了便于控制产品质量，有效成分往往难以确定，或者多种有效成分的峰形、分离度等并不好，导致目前一般以阿魏酸一种成分来作为质量标准，结果并不理想。

本发明的有益效果是：

本发明立足于便可通片的标准指纹图谱的建立方法，及同时测定4种化学成分的含量测定方法，深化质量标准，精准控制指标，实现符合中医药特色的中成药便可通片质量评价体系，提升产品质量，稳定品质。

本发明采用中药指纹图谱技术等多成分分析法，立足于便可通片的标准指纹图谱的建立方法；设定中药活性成分含量范围，建立同时测定4种化学成分的含量测定方法。首次对不同批次便可通片hplc指纹图谱研究，建立便可通片指纹图谱，对主要共有峰进行归属，并对主要成分芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷进行定量测定，深化质量标准，精准控制指标，实现符合中医药特色的中成药便可通片质量评价体系，提升产品质量，稳定品质。

本发明建立了10批便可通片的指纹图谱，采用指纹图谱软件共标定出16个共有峰，相似度均大于0.95，说明所建立的指纹图谱具有较好的可控性，为便可通片的质量评价提供依据。方法学试验表明该色谱方法可同时定量分析芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷的含量。综上所述，采用上述建立的hplc指纹图谱方法，同时对便可通片药材、饮片与成品，进行指纹图谱检测和有效成分含量测定，实现终端质控向生产过程质量控制过渡，提升产品质量，稳定品质，为便可通片的上市生产奠定基础。

本发明的指纹图谱的相似度非常高，表明各个共有峰的选择非常好，产品共性高；本发明的指纹图谱的峰型较好，分离度、对称因子和理论塔板数均较好；本发明可以对结构差异较小的成分进行有效的分离，可以更好的标准产品的质量，更准确地测定产品有效成分的含量。本法利用hplc指纹图谱对便可通片进行质量控制，建立其标准图谱，进行相似度评价，同时实现了4个指标成分含量的同时测定，相比于现有相关报道，更加全面的反映了便可通片制剂的质量，保证了制剂批次间的一致性。

附图说明

图1为10批便可通片hplc指纹图谱。

图2为便可通片标准指纹图谱和对照品的图谱比较图。

图3为便可通片标准指纹图谱和原药材的图谱比较图。

图4为对比例1的hplc指纹图谱。

图5为对比例2的hplc指纹图谱。

图6为对比例3的hplc指纹图谱。

图7为对比例4的hplc指纹图谱。

图8为0h的芦荟苷对照品溶液的指纹图谱。

图9为4h的以甲醇做溶剂的芦荟苷对照品溶液的指纹图谱。

图10为4h的以流动相为溶剂的芦荟苷对照品溶液的指纹图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围内。

实施例1

便可通片标准指纹图谱的建立

为使药材有足够的代表性，收集不同产地的药材或不同商品规格等级的药材作为供试品。

色谱条件

色谱柱：inertsustainc18(4.6×250mm，5μm)流动相：甲醇-0.1醋酸水梯度洗脱：0～10min：20％～40％甲醇；10～20min：40％甲醇；20～30min：40％～42％甲醇；30～50min：42％～47％甲醇；50～80min：47％～60％甲醇；80～90min：60％～90％甲醇；90～100min：90％甲醇。检测波长：300nm；流速：1ml/min；柱温：25℃；进样量10μl；理论塔板数以芦荟苷计不低于5000。

溶液的制备

对照品溶液的制备

精密称取芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷、大黄酸和芦荟大黄素对照品适量，芦荟苷用流动相甲醇-0.1％醋酸水混合溶液(39:61)溶解并定容，配成含芦荟苷质量浓度为0.9235mg/ml、其余对照品用甲醇溶解并定容，配成柚皮苷质量浓度为0.7561mg/ml、新橙皮苷量浓度为0.7510mg/ml、松果菊苷质量浓度为0.5196mg/ml，大黄酸质量浓度为0.56mg/ml和芦荟大黄素0.56mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液的制备

取本品20片，除去包衣，研细，取约1g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加溶剂适量，超声处理(功率500w，频率40khz，温度低于25℃)20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法学考察

精密度试验

精密吸取同一便可通片(s1)供试品溶液10μl，按色谱条件连续进样测定6次，记录其色谱图。以9号峰(芦荟苷)为参照，计算16个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd分别为0.01％～0.07％和0.91％～9.38％，其中，芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷和松果菊苷峰面积rsd分别为2.16％、1.16％、1.15％和2.86％，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。

重复性试验

取便可通片(s1)6份，精密称定，制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，分别进样测定，记录色谱图。以9号峰(芦荟苷)为参照，计算16个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd分别为0.01％～0.14％和1.16％～9.81％。芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷和松果菊苷峰面积rsd分别为0.88％、1.83％、2.10％和1.50％，结果表明，该方法重复性好。

稳定性试验

精密吸取同一便可通片(s1)供试品溶液10μl，分别于0、4、8、12、16、24h进行测定，记录色谱图。以9号峰(芦荟苷)为参照，计算16个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd分别为0.02％～0.27％和1.49％～8.14％。而测得芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷和松果菊苷峰面积rsd分别为3.87％、2.50％、2.40％和3.97％，结果表明，供试品溶液于24h内测定结果稳定。

指纹图谱的测定

便可通片标准指纹图谱的建立取10批次的便可通片样品(s1～s10)，精密称定，制备供试品溶液，精密吸取10μl，检测波长300nm，分别进样测定，记录100min的图谱。结果采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a)”进行数据分析处理，设定s1为参照图谱，将其他样品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成便可通片指纹图谱，见图1，其中以峰9为参照峰(s)。

测量各共有峰的相对保留时间和相对峰面积见表1、2。

表110批便可通片hplc指纹图谱共有峰相对保留时间

表210批便可通片hplc指纹图谱共有峰相对峰面积

共有峰的确定根据10批便可通片的指纹图谱检测结果，通过相似度评价软件，共标出16个共有峰，样品峰经与对照品比较分析，指认2号峰为松果菊苷，4号峰为柚皮苷，5号峰为新橙皮苷，9号峰为芦荟苷，15号峰为芦荟大黄素，16号峰为大黄酸，见图2。9号峰分离度较好，峰面积也比较稳定，故选择此峰作为参照峰。

指纹图谱相似度评价上述s1～s10样品与指纹图谱的相似度通过软件计算，10批便可通与指纹图谱之间相似度在0.971～0.999之间，表明相似度良好。

实施例2对照品溶剂稳定性考察

芦荟苷对照品溶液①：芦荟苷对照品1.23mg(纯度94.4％)→10ml(甲醇)

芦荟苷对照品溶液②：芦荟苷对照品1.23mg(纯度94.4％)→10ml(流动相)

取上述对照品溶液，分别于第0h、2h、4h、6h进样分析，对比峰面积计算芦荟苷降解率。结果表明，芦荟苷在流动相混合溶液中较甲醇溶液中更为稳定，且文献表明芦荟苷溶液对光、热较为敏感，故配制芦荟苷对照品溶液时需以流动相作为溶剂，且需避光，低温保存。

表3对照品溶液稳定性考察

芦荟苷大部分是两个光学异构体的总和，分别为芦荟苷a和芦荟苷b，芦荟苷a比芦荟苷b具有更强的生物活性。本实验分别用甲醇、流动相甲醇-0.1％醋酸水溶液(39:61)作为溶剂对芦荟苷对照品进行溶解，考察0h、2h、4h、6h芦荟苷降解率，结果表明，芦荟苷在流动相甲醇-0.1％醋酸水溶液(39:61)混合溶液中较甲醇溶液中更为稳定，且芦荟苷对照品溶液对光、热较为敏感，故配制芦荟苷对照品溶液时需以流动相作为溶剂，且需避光，现配现用。

实施例3

共有峰的来源确认分别取便可通组方中的9味药材适量，精密称定，制备药材样品溶液。分别精密吸取，制备的供试品溶液和9味药材样品溶液各10μl进样，注入高效液相色谱仪，记录100min色谱图。对保留时间保持一致的色谱峰进行分析比较，根据紫外光谱信息，对全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认，确认共有峰的药材归属，见图3。

通过便可通片复方和全方药材相关性研究，确认便可通片复方hplc指纹图谱中16个特征峰的来源，指纹峰各来自肉苁蓉(2、3号峰)、生地黄(3号峰)、玄参(3号峰)、枳实(4、5、7号峰)、芦荟(1、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16号峰)、当归(16号峰)。

实施例4

样品含量测定

线性关系考察精密吸取对照品溶液，吸取部分，分别加入流动相(或甲醇)稀释成系列质量浓度的对照品溶液进行测定，进样10μl，测定其峰面积积分值(y)，以质量浓度为横坐标(x)，y为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程分别为芦荟苷y＝0.2007x+0.0187,r²＝0.9999，表明芦荟苷在0.4618～9.2354μg具有良好的线性关系；柚皮苷y＝0.1513x+0.3505，r²＝1，表明柚皮苷在0.3780～7.5607μg具有良好的线性关系；新橙皮苷y＝0.1501x+1.3668，r²＝0.9999，表明新橙皮苷在0.3755～7.5070μg具有良好的线性关系；松果菊苷y＝0.1866x-0.2159，r²＝0.9995，表明松果菊苷在0.2598～5.1959μg具有良好的线性关系。

加样回收率试验精密称量已知芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷含量的样品(s1)0.5g，6份，分别精密加入芦荟苷对照品8.1mg，柚皮苷对照品7.9mg，新橙皮苷对照品8.6mg，松菊糖苷对照品溶液(0.5196mg/ml)3.5ml，即1.8mg，置50ml棕色量瓶中，加溶剂适量，超声处理(功率500w，频率40khz，温度低于25℃)20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按色谱条件进行分析，结果芦荟苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷的平均加样回收率分别为101.62％、99.52％、102.05％和98.35％，rsd分别为2.01％、1.95、2.21和2.84％，表示本方法对四者的加样回收率较好。

样品含量测定取10批便可通片样品适量，精密称定，制备供试品溶液，按色谱条件进行分析，结果见表4。

表4含量测定结果(％)

实施例5

提取条件的选择

根据复方工艺的提取溶剂及修订的质量标准草案中芦荟苷含量测定的供试品制备方法，本研究考察了便可通片不同提取方式(超声提取、加热回流提取)，不同提取溶剂(乙醇、水、甲醇、50％甲醇)，结果表明甲醇超声提取效果最佳。

色谱条件的选择

采用了dad全波长扫描的方式，参考处方各单味中药材有效成分的检测波长，提取出200、220、235、260、280、300nm等波长下的图谱进行比较，在300nm下，样品的色谱图呈现的色谱峰数目多且峰的响应值较高。不同波长下，松果菊苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷的响应值如表4所示。

表4不同波长下松果菊苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷的响应值

考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％醋酸水、甲醇-0.2％醋酸水4种流动相系统，发现采用甲醇-0.1％醋酸水流动相系统，色谱峰的数目较多，且参照峰(芦荟苷)峰型较好，分离度、对称因子和理论塔板数均较好。

共有峰的来源确认

本发明对全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认，确认了6个峰的物质成分，主要来自肉苁蓉、枳实、芦荟。样品中8、9号峰是芦荟苷的同分异构体，芦荟苷溶液对光、热较为敏感，配制芦荟苷对照品溶液时以流动相作为溶剂，且避光，低温保存。

对比例

为了说明本申请的洗脱程序的效果，试验了不同的对比例1-4，其洗脱程序分别见表5-8，其他步骤同实施例1。

表5对比例1的洗脱程序表

表6对比例2的洗脱程序表

表7对比例3的洗脱程序表

表8对比例4的洗脱程序表

上述对比例1-4的指纹图谱分别见图4-7，从图4-7以及本申请的指纹图谱的区别可以看出，本申请的指纹图谱的峰型较好，分离度较好；本发明可以对结构差异较小的成分进行有效的分离，可以更好的标准产品的质量，更准确地测定产品有效成分的含量。

试验例

为了说明不同溶剂对芦荟苷稳定性的影响，本申请以甲醇做溶剂进行对比试验。试验结果比较如图8-10所示。

从图9-10的比较中可以看出，采用本申请的流动相做溶剂时，芦荟苷的稳定性更好。