一种舒血宁注射液中总木脂素的测定方法与流程

本发明涉及银杏叶活性成分检测技术领域，尤其涉及一种舒血宁注射液中总木脂素的测定方法。

背景技术：

舒血宁注射液是一种中药制剂，为黄色的澄明液体，主治心血管疾病。功能为扩张血管，改善微循环。用于缺血性心脑血管疾病，冠心病，心绞痛，脑栓塞，脑血管痉挛等。研究证实，本品具有促进脑血液循环、扩张脑血管、增加脑血流量、改善和保护脑细胞；增加神经递质的含量，减少神经细胞损伤；改善缺氧脑细胞的能量代谢和营养，提高脑细胞的耐缺氧能力；提高红细胞sod活性，抑制细胞膜脂质过氧化等功能，可用于治疗缺血性心脑血管疾病、冠心病、心绞痛、脑栓塞和脑血管痉挛等疾病。

舒血宁注射液中主要含有黄酮类、银杏内酯类和木脂素类成分，目前，尚未有关于银杏叶、舒血宁注射液中总木脂素含量测定方法的报道。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

为了准确测定舒血宁注射液中总木脂素的含量，本发明对提高测定精准度的方法进行了探究，以解决测定结果误差较大等问题。

具体而言，发明人对出现该问题的原因进行了探究，发现其是由于舒血宁注射液中黄酮类成分干扰所带来的。

基于上述发现，本发明首次提供了一种舒血宁注射液中总木脂素的测定方法，该方法能够排除黄酮类成分的干扰，准确测定舒血宁注射液中总木脂素的含量。

具体地，所述舒血宁注射液中总木脂素的测定方法，采用紫外双波长分光光度法，所述测定包括：

提供舒血宁注射液；

将所述舒血宁注射液中的黄酮类成分去除；

以去除黄酮类成分的舒血宁注射液为供试品溶液进行检测。

作为优选，采用聚酰胺固相萃取柱洗脱去除舒血宁注射液中的黄酮类成分。

本发明意外发现，聚酰胺固相萃取柱能够将舒血宁注射液中大部分黄酮类成分吸附在萃取柱上。

为了使舒血宁注射液中黄酮类成分最大程度的被萃取柱吸附，本发明对萃取柱进行了优化，具体如下：

进一步地，所述聚酰胺固相萃取柱中，聚酰胺的粒径为100～200目，添加量为1g/6ml；

更进一步地，所述聚酰胺固相萃取柱为cleanertpa聚酰胺固相萃取柱。

在具体的实施方式中，所述聚酰胺固相萃取柱为cleanertpa聚酰胺固相萃取柱；所述cleanertpa聚酰胺固相萃取柱购置于天津博纳艾杰尔科技有限公司。本发明还考察了该公司生产的不同批次(20180420批次和20190925批次)的cleanertpa聚酰胺固相萃取柱对总木脂素含量测定的影响，结果表面，两批次萃取柱的测定结果的rsd小于2％，可见，不同批次的cleanert聚酰胺固相萃取柱对检测结果无影响。

作为优选，将所述舒血宁注射液预先用水稀释后，再经所述聚酰胺固相萃取柱洗脱；

其中，舒血宁注射液稀释液的上样流速为1.6～2.4ml/min(2ml/min尤为理想)；按上述流速上样，有利于萃取柱吸附黄酮类成分。

作为优选，以5～15％甲醇溶液(体积比)为洗脱液，10％甲醇溶液尤为理想；采用上述洗脱液可洗脱出大部分木脂素和极少量的黄酮类成分。然而，若甲醇溶液中甲醇与水的体积比过大，如20％甲醇溶液，黄酮类化合物按极性大小逐渐洗脱下来，不利于后续检测。

作为优选，所述洗脱液的流速为1.6～2.4ml/min，2ml/min尤为理想。

作为优选，将所述舒血宁注射液预先用水稀释2～3倍(尤其是2.5倍)；也就是说，预先向舒血宁注射液中加入2～3倍(尤其是2.5倍)的水。本发明发现，将同体积未经水稀释过的舒血宁注射液直接上样至聚酰胺固相萃取柱，流出液中含有黄酮类成分；而将舒血宁注射液用水稀释后即可有效减少黄酮类成分的流出，并确定稀释2～3倍时效果较佳。

作为本发明的较佳技术方案，所述供试品溶液由包括如下步骤的方法制得：

向舒血宁注射液中加入2～3倍的水稀释，将舒血宁注射液稀释液以1.6～2.4ml/min的上样流速转移至聚酰胺固相萃取柱中，收集流出液；再用16～24ml的5～15％甲醇溶液以1.6～2.4ml/min的流速进行洗脱，收集流出液；合并所有流出液，定容。

作为优选，所述聚酰胺固相萃取柱预先经活化处理。

进一步地，所述活化处理为：用5～7ml的甲醇和5～7ml的水先后淋洗所述聚酰胺固相萃取柱，重复三次。

按照上述方式对聚酰胺固相萃取柱进行预先活化处理，更加有利于吸附黄酮类成分、以及木脂素类成分的充分流出。

作为本发明的较佳技术方案，所述测定方法包括：

s1、绘制标准曲线：以松脂醇二葡萄糖苷为对照品、5～15％甲醇溶液为溶剂制备对照品溶液；

采用紫外双波长分光光度法分别在277±2nm和370±2nm波长处测定不同浓度对照品溶液的吸光度差值δa；

以对照品溶液浓度为横坐标，吸光度差值δa为纵坐标，绘制标准曲线；

s2、制备供试品溶液：向舒血宁注射液中加入2～3倍的水稀释，将舒血宁注射液稀释液以1.6～2.4ml/min的上样流速转移至聚酰胺固相萃取柱中，收集流出液；再用16～24ml的5～15％甲醇溶液以1.6～2.4ml/min的流速进行洗脱，收集流出液；合并所有流出液，定容；

所述聚酰胺固相萃取柱预先经活化处理：用5～7ml的甲醇和5～7ml的水先后淋洗所述聚酰胺固相萃取柱，重复三次；

s3、测定：采用紫外双波长分光光度法分别在277±2nm和370±2nm波长处测定所述供试品溶液的吸收度差值δa；利用所述标准曲线计算总木脂素浓度。

在按上述方式制备舒血宁注射液的供试品溶液时，聚酰胺固相萃取柱能够将大部分黄酮类成分吸附在萃取柱上，随后采用紫外双波长分光光度法测定，通过在277±2nm和370±2nm波长处测定，以扣除供试品溶液中剩余部分黄酮类成分的干扰，保证测定的精准度。

本发明提供的方法能够准确测定舒血宁注射液中总木脂素含量，进而实现有效控制舒血宁注射液中总木脂素含量，以保证产品批间的均一、稳定。

附图说明

图1为实验例中uv190～410nm全波长扫描光谱图；其中，(a)为松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液的光谱图；(b)为供试品溶液的光谱图；(c)为山梨醇对照品溶液的光谱图；(d)为银杏内酯a、b、c混合对照品溶液的光谱图；(e)为10％甲醇空白溶剂的光谱图。

图2为实验例中线性关系图。

图3为实验例中聚酰胺固相萃取柱流出液uv360nm色谱图。

图4为实验例中中性氧化铝固相萃取柱流出液uv360nm色谱图。

图5为实施例1中供试品溶液uv360nm色谱图。

图6为实施例1中山奈酚3-o-(2″,6″-α-l-二鼠李糖)-β-d-葡萄糖uv190～410nm全波长扫描光谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中所涉及的仪器和试剂如下：

紫外分光光度仪(型号uv-2600，日本岛津公司)；

超声清洗仪(型号kq-250de，昆山市超声仪器有限公司)；

固相萃取仪(湖南力辰仪器科技有限公司)；

cleanertpa聚酰胺萃取柱(1g/6ml，100-200目，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；

甲醇(色谱纯，admas，中国)；

松脂醇二葡萄糖苷(批号111537-201605，中国药品生物制品检定所)；

舒血宁注射液样品1(批号zsa20190911，黑龙江珍宝岛药业股份有限公司)；

舒血宁注射液样品2(批号zsa20190912，黑龙江珍宝岛药业股份有限公司)；

舒血宁注射液样品3(批号zsa20190917，黑龙江珍宝岛药业股份有限公司)。

实验例

下面结合试验数据对本发明提供的舒血宁注射液中总木脂素的测定方法进行考察：

一、专属性

如图1可知，松脂醇二葡萄糖苷与供试品溶液在uv277nm处均呈现最大吸收，山梨醇、银杏内酯类化合物对总木脂素的含量测定无干扰。

二、精密度

1、重复性

取舒血宁注射液样品2按实施例1中s2的方法制备供试品溶液，平行6份，uv277nm和370nm处测得吸光度差值δa，并根据实施例1的标准曲线计算供试品溶液中松脂醇二葡萄糖苷的浓度(mg/l)；结果见表1。

表1

2、仪器精密度

连续测定浓度为65.992mg/l的松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液6次，记录吸光度，并计算uv277nm和370nm处测得吸光度差值δa的rsd(％)；结果见表2。

表2

3、重现性

两个实验室按实施例1的测定方法分别对舒血宁注射液样品1、舒血宁注射液样品2和舒血宁注射液样品3进行含量测定；结果见表3。

表3

三、稳定性

将舒血宁注射液样品2分别置于室温环境中0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、1.5小时、2小时和4小时，测定各时间点样品在uv277nm和370nm处测得吸光度差值δa；结果见表4。

表4

四、准确度(回收率/加样回收率)

分别量取1.0ml舒血宁注射液样品2至5ml容量瓶中，平行9份；其中，三份加入0.8ml松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液，加水定容至刻度，作为低浓度组；三份加入1.6ml松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液，加水定容至刻度，作为中浓度组；三份加入2.4ml松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液，加水定容至刻度，作为高浓度组。上述9份溶液按实施例1中s2的方法制备成9份供试品溶液，测定uv277nm和370nm处吸光度差值δa，按照加样回收率的计算公式(回收率＝实际测得量(μg)/实际加入量(μg)×100％)计算加样回收率；结果见表5。

表5

五、线性回归

如图2所示，按照实施例1中s1制得的标准曲线，松脂醇二葡萄糖苷在16.498mg/l～164.98mg/l范围内线性关系良好，y＝0.0079x+0.0185，r²＝0.99953(n＝6)。

六、含量测定

取3个批号舒血宁注射液(即舒血宁注射液样品1、舒血宁注射液样品2和舒血宁注射液样品3)，每个批号取两个平行样品，记为样品1-1、样品1-2、样品2-1、样品2-2、样品3-1、样品3-2，利用实施例1的方法测定舒血宁注射液中总木脂素的含量，结果见表6。

表6

七、固相萃取柱

分别精密量取1ml舒血宁注射液样品2至5ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别将舒血宁注射液稀释液上样至活化后的中性氧化铝固相萃取柱和聚酰胺固相萃取柱，uv360nm波长下检测各流出液中黄酮类化合物。结果如图3和图4所示，聚酰胺固相萃取柱吸附黄酮类化合物的能力强于中性氧化铝固相萃取柱，可将黄酮类化合物吸附于萃取柱中，部分木脂素类化合物随洗脱液洗脱。

实施例1

本实施例提供一种舒血宁注射液中总木脂素的测定方法，包括：

s1、绘制标准曲线：精密称取松脂醇二葡萄糖苷，加10％甲醇溶液(体积比)制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液；

分别精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml至5ml容量瓶，加10％甲醇溶液(体积比)稀释至刻度；采用紫外双波长分光光度法分别在277nm和370nm波长处测定不同浓度对照品溶液的吸光度差值δa；以对照品溶液浓度(mg/l)为横坐标(x)，uv277nm和370nm处测得吸光度差值δa为纵坐标(y)，绘制标准曲线；

s2、制备供试品溶液：精密量取2.0ml舒血宁注射液至5ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；以2ml/min的流速上样，收集流出液；再用10ml10％甲醇溶液(体积比)以2ml/min的流速进行洗脱，重复两次，合并三次流出液转移至25ml容量瓶，加水定容至刻度，作为供试品溶液；

所述聚酰胺固相萃取柱预先经活化处理：用6ml的甲醇和6ml的水先后淋洗所述聚酰胺固相萃取柱，重复三次；

s3、测定：采用紫外双波长分光光度法分别在277nm和370nm波长处测定所述供试品溶液的吸收度差值δa，从标准曲线上读出供试品溶液浓度，计算总木脂素浓度。

总木脂素浓度(mg/ml)＝供试品溶液浓度(mg/l)/1000×稀释倍数(12.5)。

本实施例中，步骤s2中，经过cleanertpa聚酰胺萃取柱纯化后的供试品溶液中仍然存有少量的黄酮类成分(如图5所示)；为了提高检测结果的准确性，选择uv277nm作为木脂素类成分的检测波长，以供试品溶液中残留黄酮峰面积最大的山奈酚3-o-(2″,6″-α-l-二鼠李糖)-β-d-葡萄糖作为参比化合物，该化合物全波长扫描光谱图(如图6所示)中与uv277nm吸光度值相等的uv370nm作为参比波长。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。