基于h蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法及应用
技术领域：
：[0001]本发明属于生物检测
技术领域：
：，尤其涉及一种基于h蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法及应用。
背景技术：
：：[0002]小反刍兽疫(pestedespetitsruminants，ppr)属于副黏病毒科麻疹病毒属，是由小反刍兽疫病毒(pprvirus,pprv)引起的一种急性、热性传染病，具有高度的传染性和致死性。该病毒有一个血清型4个谱系(-、-、-和-)(v.balamurugan,hemadri,gajendragad,&singh…,2014；v.s.balamurugan,a.；venkatesan,g.；yadav,v.；bhanot,v.；riyesh,t.；bhanuprakash,v.；singh,r.k,2010)，我国流行的主要为iv系。pprv为单股负链rna病毒，其基因组共编码8个蛋白，3′端到5′端编码的结构蛋白分别为核衣壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)、血凝集素蛋白(h)和大蛋白(l)，2个非结构蛋白(c、v)则由p基因编码产生(bailey,banyard,ozkul,&barrett,2005)。pprv主要感染山羊和绵羊等小反刍类动物(gibbs,taylor,lawman,&bryant,1979)，但近年来，pprv感染宿主呈现多样化，据报道骆驼(albayrak&gür,2010；intisaretal.,2017)、牛和水牛等大型反刍动物也可被感染(v.balamuruganetal.,2014；maillardetal.,2008；zakian,nouri,kahroba,mohammadian,&mokhber-dezfouli,2016)，但通常为亚临床感染。此外，狮子和犬(rattaetal.,2016)、瞪羚羊、大羚羊、蓝羚羊(furley,taylor,&obi,1987)以及野猪(schulz,fast,schlottau,hoffmann,&beer,2018)也可感染pprv。pprv为高度接触性传染病，主要通过直接接触经呼吸系统传播，也可通过精液、胚胎和乳汁等途径传播。pprv感染后临床症状主要表现为发热、肺炎、腹泻，呼吸道和消化道黏膜炎症等。鉴于其在全球的流行情况，ppr被世界动物卫生组织(oie)列为法定报告的动物疫病(santhamani,singh,&njeumi,2016)，我国也将其列为一类动物传染病。[0003]ppr自2007年传入我国以来，在我国西藏、山东、内蒙古等多个省份蔓延传播，对我国畜牧业的健康、有序发展造成严重挑战(liuetal.,2018)，因此快速准确地对其进行检测显得尤为重要。目前采用的针对pprv病原或者抗体检测方法主要有中和试验、病毒的分离鉴定、qrt-pcr试验以及基于n蛋白和h蛋白抗体的elisa方法等。由于n蛋白和h蛋白抗原性较稳定，产生的抗体在pprv感染后的血清抗体中占主导地位，因此n、h蛋白成为了ppr诊断试剂研发的主要靶蛋白(孙雨，宋晓晖，王传彬，等,2017)。但n蛋白的表达通常以不溶性的包涵体形式存在，鲜有报道其为可溶性表达(taylor,2016)，要获得高浓度和高纯度的n蛋白具有一定的难度，不利于检测技术的进一步商业开发。此外，麻疹病毒属病毒中n蛋白高度保守，不能诱导机体产生针对病毒的免疫保护，以n蛋白为基础建立的检测方法会产生一定的交叉反应。h蛋白在麻疹病毒属所有成员中不仅最为多样化，而且种属特异性强，可诱导机体产生保护性免疫反应，因此该蛋白在diva(区分疫苗免疫和自然感染动物)和免疫保护率检测上具有相当的优势。宿主的体液免疫反应也主要针对h蛋白，该蛋白也是麻疹病毒属最为重要的抗原决定蛋白(vongpunsawad,oezgun,braun,&cattaneo,2004；yonedaetal.,2002)。[0004]化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay，clia)技术由免疫反应和化学发光反应两部分相结合，对抗原或抗体进行检测的免疫分析技术，因该技术具有灵敏度高、分析方法简便快捷、操作方便等优点而被广泛用于检测技术的开发，但目前基于化学发光的ppr检测技术尚未见报道。本研究基于本实验室对pprvh蛋白b细胞表位预测及反应原性和免疫效力评价的基础之上，挑选在不同毒株之间都保守且反应原性较好的b细胞表位片段以柔性氨基酸甘氨酸(g)和丝氨酸(s)作为连接位点串联，进行多肽合成，以此作为包被抗原，通过优化各步反应条件建立针对pprvh蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法，有效弥补化学发光免疫分析技术在ppr检测方法上的缺失。技术实现要素：[0005]为解决上述技术问题，本发明提供一种基于h蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法，包括以下步骤：[0006](1)h蛋白b细胞抗原表位的筛选、多肽的设计合成[0007](2)h蛋白抗体化学发光检测方法的建立[0008]将合成的表位肽用ph值为9.6的碳酸氢盐缓冲液稀释后包被96孔化学发光酶标板，放于4℃过夜孵育；取出酶标板用pbst缓冲液洗板3次后甩干；每孔加入200μl2％bsa-pbst溶液于37℃封闭1h，洗板3次后甩干；加入经稀释后的血清，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3次后甩干；加入经稀释后的酶标二抗，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3-5次后甩干。底物a液和b液按照1:1进行混合，每孔100μl加入酶标孔，于常温黑暗处反应5min，之后在化学免疫分析仪器上测定发光值；[0009]对检测的血清样品用阳性率(s/p)进行表示，即s/p＝(待测样品发光值/标准阳性样品平均发光值)×100％；s/p值大于临界值即检测为阳性，；s/p值小于等于临界值即为阴性。[0010]优选地，所述步骤(1)具体为：利用iedb、immunomedicinegroup以及bepipred三种生物信息学软件对h蛋白的b细胞抗原表位进行预测，共得到27条抗原表位肽并合成这些多肽，然后利用ielisa方法对其与pprv阳性血清的反应原性进行鉴定，选取其中反应原性最好的4个b细胞表位h123、h185、h362、h487以gs作为接头串联，合成该肽段。[0011]优选地，包被抗原浓度为1.5×10-6μg/孔；[0012]血清稀释度为1:100；[0013]血清反应时间为10min；[0014]酶标二抗反应时间为10min；[0015]检测的临界值为s/p＝9.77％。[0016]基于h蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法在diva和免疫保护率检测上的应用。[0017]本发明旨在建立针对pprvh蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法。设计合成pprvh蛋白b细胞表位作为抗原，通过优化各步反应条件，确定临界值及进行重复性和对比试验。建立的检测方法临界值为s/p>9.77％，敏感性为95.43％，特异性为92.23％，批内及批间变异系数均小于10％，具有良好的特异性和重复性，且敏感性高于国外的celisa。通过检测247份田间血清，与国外celisa相比符合率为94.33％。表明建立的h蛋白抗体化学发光免疫分析方法可进一步用于检测试剂盒的开发。附图说明[0018]下面结合附图对本发明作进一步详细的描述。[0019]图1是串联合成多肽hplc分析结果图；[0020]图2是串联合成多肽ms分析结果图；[0021]图3是h-clia的roc分析曲线图；[0022]图4是h-clia的tg-roc分析曲线图；[0023]图5是h-clia交互式点状图；[0024]图6是h-clia和celisa分析敏感性比较图。具体实施方式[0025]1、材料与方法[0026]1.1、血清及主要试剂[0027]pprv标准阴性和阳性血清、口蹄疫病毒(fmdv)阳性血清、羊痘病毒(spv)阳性血清由本实验室保存，羊口疮病毒(orfv)阳性血清、山羊传染性胸膜肺炎(ccpp)阳性血清、蓝舌病病毒(btv)阳性血清分别由中国农业科学院兰州兽医研究所王光祥副研究员、储岳峰研究员以及独军政研究员惠赠，pprv背景清楚血清及田间血清由本实验室采集保存。pprvcelisa检测试剂盒购自法国id.vet公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记的兔抗羊二抗购自sigma公司，化学发光底物购自兰州博瑞生物科技有限公司；bsa为excellbio公司产品。pbst缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液等试剂为本实验室自行配制。[0028]1.2h蛋白b细胞抗原表位的筛选、多肽的设计与合成[0029]利用iedb、immunomedicinegroup以及bepipred三种生物信息学软件对h蛋白的b细胞抗原表位进行预测，共得到27条抗原表位肽并合成这些多肽，然后利用ielisa方法对其与pprv阳性血清的反应原性进行鉴定，发现b细胞表位h123、h138、h185、h362、h368、h487、h569、h585具有抗原反应原性(表1)(梁忠祥,2017)。选取其中反应原性最好的4个表位h123、h185、h362、h487以gs作为接头串联，送上海强耀生物有限公司合成该肽段。[0030]表1具有反应原性的b细胞表位[0031]table1bcellepitopeswithreactogenicity[0032][0033][0034]1.3、h蛋白抗体化学发光检测方法的建立[0035]1.3.1、化学发光免疫分析操作方法[0036]将合成的表位肽用碳酸氢盐缓冲液(ph9.6)稀释后包被96孔化学发光酶标板，放于4℃过夜孵育；取出酶标板用pbst缓冲液洗板3次后甩干；每孔加入200μl2％bsa-pbst溶液于37℃封闭1h，洗板3次后甩干；加入经稀释后的血清，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3次后甩干；加入经稀释后的酶标二抗，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3-5次后甩干。底物a液和b液按照1:1进行混合，每孔100μl加入酶标孔，于常温黑暗处反应5min，之后在化学免疫分析仪器上测定发光值。[0037]1.3.2、抗原最适包被浓度及血清稀释度的优化[0038]将表位肽抗原按照3×10-6μg/孔、2.5×10-6μg/孔、2.0×10-6μg/孔、1.5×10-6μg/孔、1.0×10-6μg/孔、0.5×10-6μg/孔以碳酸氢盐缓冲液包被96孔酶标板，每孔100μl,4℃过夜孵育；取出酶标板洗板后2％bsa-pbst封闭1h，洗板后拍干。pprv标准阴阳性血清以灭菌pbst溶液按照1:25、1:50、1:100、1:200进行稀释，每孔100μl加入到96孔酶标板中。按照化学发光免疫分析操作方法进行试验，酶标二抗用pbst溶液按照1:80000进行稀释，加入底物反应后读取发光值，选取p/n值较大的组合对应的抗原包被浓度及血清稀释度作为最佳的抗原包被浓度和血清稀释度。[0039]1.3.3、血清反应时间的优化[0040]抗原按照优化后最佳包被浓度进行包被，阴阳性血清按照优化后的血清稀释度进行稀释。血清反应时间分别为5min、10min、15min和20min，按照化学发光免疫分析方法进行试验。加入酶标二抗和底物反应后读取发光值，选择p/n值较大的组合对应的血清反应时间作为最佳反应时间。[0041]1.3.4、酶标二抗反应时间优化[0042]在优化完成抗原最佳包被浓度，血清最佳稀释度以及血清反应时间的基础之上，酶标二抗反应时间分别为5min、10min、15min和20min，按照化学发光免疫分析方法进行试验，选择p/n值较大的组合对应的酶标二抗反应时间作为最佳反应时间。[0043]1.4、临界值、检测特异性与灵敏性[0044]通过对431份已知阴阳性血清进行检测，在标准阳性血清的发光值>600000,且标准阴性血清的s/p值<2％的基础之上，对检测的血清样品用阳性率(s/p)进行表示，即s/p＝(待测样品发光值/标准阳性样品平均发光值)×100％。得到所有检测血清的s/p值之后，对其进行roc曲线分析，以此判断本方法的最佳检测临界值，诊断敏感性和特异性。[0045]1.5、敏感性分析[0046]为了确定本方法的检测极限，将pprv标准阳性血清进行梯度稀释(1:100-1:12800)，按照建立的化学发光检测方法对稀释后的血清进行检测，根据检测结果判定阳性血清最大稀释倍数，从而评价所建立的化学发光检测方法的灵敏度。同时，利用进口的id.vetpprvcelisa试剂盒对倍比稀释后的血清进行检测，以比较两种方法的最低检测限。[0047]1.6、特异性分析[0048]按照已经建立的化学发光检测方法，分别对pprv阴阳性样品血清、临床上与ppr易混淆的口蹄疫、羊痘、羊口疮、蓝舌病及山羊传染性胸膜肺炎的阳性血清进行检测，以此判断本方法的特异性。[0049]1.7、重复性分析[0050]随机选取10份pprv抗体水平不同的血清样品，使用同批次包被的不同酶标板对血清样本进行检测，以检测批内重复性；使用3个不同批次包被的酶标板检测10份不同抗体水平的血清，以检测批间重复性。检测完成后计算平均值、标准差以及变异系数。[0051]2、结果与分析[0052]2.1、多表位抗原串联及合成结果[0053]多表位肽串联结果如表2所示，将串联之后的多肽送上海强耀生物有限公司进行合成，合成后经hplc及ms分析，结果如图1、2所示，显示串联后的表位多肽顺利合成，最终合成纯度为90.57％。[0054]表2h蛋白部分b细胞表位串联的表位肽序列[0055]table2apartofseriesconnectionbcellepitopesequencesofhprotein[0056][0057]注：gs(灰色部分)为不同表位间的连接氨基酸[0058]2.2、包被抗原浓度及血清稀释度的确定[0059]不同浓度的抗原包被96孔化学发光酶标板后与不同浓度的阴阳性血清进行方阵滴定试验，结果如表3所示。在不同多肽抗原包被浓度中，以1.5×10-6μg/孔的量包被酶标板，血清按照1:100稀释时p/n值最高。确定1.5×10-6μg/孔为最适包被量，以1:100为最佳血清工作浓度。[0060]表3最佳抗原包被浓度和血清稀释度的优化[0061]table3optimizationfortheconcentrationofcoatingantigenandserumdilution[0062][0063]2.3、血清反应时间的确定[0064]如表4所示，当血清反应时间为10min时，相比于其它血清反应时间，其所对应的p/n值最大，故确定10min作为血清的最佳反应时间。[0065]表4血清反应时间优化[0066]table4optimizationofserumreactiontime[0067][0068]2.4、酶标二抗反应时间的确定[0069]如表5所示，当酶标二抗反应时间为10min时，相比于其它二抗反应时间，其所对应的p/n值最大，故确定10min作为酶标二抗的最佳反应时间。[0070]表5二抗反应时间的优化[0071]table5optimizationofsecondaryantibodyreactiontime[0072][0073]2.5、临界值、诊断敏感性及特异性[0074]化学发光免疫分析方法检测背景清楚的431份血清之后统计所有血清s/p值进行roc曲线分析。结果如图3、5所示，当该方法临界值为9.77％时，auc曲线下面积为0.972，95％置信区间为0.951-0.985，youden指数为0.8766，显著性水平p<0.0001，说明该方法具有极好的诊断价值。此时对应的诊断敏感性为95.43％、诊断特异性为92.23％，诊断结果最优。诊断灵敏性和特异性之间的关系如图4所示，横坐标对应的二者交叉点即为诊断临界值所在；各个临界值相对应的诊断敏感性与诊断特异性见表6。所以，本方法以s/p＝9.77％作为检测的临界值，以判定待检样品的阴阳性。[0075]表6不同临界值对应的诊断敏感性与特异性[0076]table6thediagnoseofsensitivityandspecificityindifferentcut-offvalue[0077][0078]2.6、敏感性分析[0079]分别使用建立的化学发光检测方法和id.vetpprvcelisa对稀释后的标准阳性血清进行检测。结果如图6所示，当血清稀释度为1:200时，化学发光和竞争法检测结果均为阳性；当血清稀释为1:800时，化学发光法检测为阳性，竞争法检测为阴性，说明建立的化学发光检测方法和竞争法相比具有更好的分析敏感性。[0080]2.7、特异性分析[0081]用建立的化学发光检测方法对pprv阴阳性样品血清、口蹄疫阳性样品血清、羊痘阳性样品血清、蓝舌病阳性血清以及山羊传染性胸膜肺炎阳性样品血清各3份进行检测。结果如表7所示，化学发光检测方法检测的pprv阳性血清均为阳性，其余病原阳性血清检测结果均为阴性，说明建立的化学发光检测方法与口蹄疫、羊痘和蓝舌病及传染性胸膜肺炎阳性血清无交叉反应，具有良好的分析特异性。[0082]表7特异性检测[0083]table7specificitydetection[0084][0085]2.8、重复性分析[0086]批内重复性试验如表8所示，结果显示所检测的8份血清5个复孔中变异系数最大的为9.17％，最小的为3.27％，均小于10％，说明该方法具有良好的批内重复性；不同批次间重复性结果如表9所示，不同批次包被抗原检测的8份血清各批次之间的变异系数均小于10％，说明该方法不同批次之间具有良好的重复性。[0087]表8批内重复性实验结果[0088]table8resultsofintrarunrepeatabilityexperiment[0089][0090]表9批间重复性实验结果[0091]table9resultsofinterrunrepeatabilityexperiment[0092][0093]3、结论[0094]建立针对pprvh蛋白抗体的化学发光免疫检测方法，与id.vet公司pprvcelisa比较符合率为94.33％，与口蹄疫病毒、羊痘病毒、蓝舌病病毒以及传染性胸膜肺炎阳性血清无交叉反应，批内和批间变异系数均小于10％。说明建立的化学发光免疫分析检测方法具有良好的特异性和稳定性。[0095]实施例1[0096]基于h蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法，包括以下步骤：[0097](1)h蛋白b细胞抗原表位的筛选、多肽的设计合成[0098]利用iedb、immunomedicinegroup以及bepipred三种生物信息学软件对h蛋白的b细胞抗原表位进行预测，共得到27条抗原表位肽并合成这些多肽，然后利用ielisa方法对其与pprv阳性血清的反应原性进行鉴定，选取其中反应原性最好的4个b细胞表位h123、h185、h362、h487以gs作为接头串联，合成该肽段。[0099](2)h蛋白抗体化学发光检测方法的建立[0100]将合成的表位肽用ph值为9.6的碳酸氢盐缓冲液稀释后包被96孔化学发光酶标板，放于4℃过夜孵育；取出酶标板用pbst缓冲液洗板3次后甩干；每孔加入200μl2％bsa-pbst溶液于37℃封闭1h，洗板3次后甩干；加入经稀释后的血清，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3次后甩干；加入经稀释后的酶标二抗，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3-5次后甩干。底物a液和b液按照1:1进行混合，每孔100μl加入酶标孔，于常温黑暗处反应5min，之后在化学免疫分析仪器上测定发光值；[0101]包被抗原浓度为1.5×10-6μg/孔；[0102]血清稀释度为1:100；[0103]血清反应时间为10min；[0104]酶标二抗反应时间为10min；[0105]对检测的血清样品用阳性率(s/p)进行表示，即s/p＝(待测样品发光值/标准阳性样品平均发光值)×100％；s/p值大于临界值即检测为阳性，；s/p值小于等于临界值即为阴性；[0106]检测的临界值为s/p＝9.77％。[0107]1材料与方法[0108]1.1、主要试剂及血清样本[0109]pprv标准阴性和阳性血清由本实验室制备保存，羊田间血清由本实验室采集保存，pprvcelisa检测试剂盒购自法国id.vet公司，辣根过氧化物酶(hrp)标记的兔抗羊二抗购自sigma公司，化学发光底物购自兰州博瑞生物科技有限公司；bsa为excellbio公司产品。pbst缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液等试剂为本实验室自行配制。[0110]1.2、临床血清样本比对检测试验[0111]分别用建立化学发光检测方法和id-vet公司的pprvc-elisa试剂盒同时检测临床采集的247份羊血清样本，比较2种检测方法结果的符合率。[0112]2、比对检测试验结果[0113]用建立的化学发光检测方法和id.vet商品化pprvcelisa同时对田间采集的247份血清进行检测，以比较二者的符合率。结果如表10所示，二者检测的田间血清符合率为94.33％，显示建立的化学发光免疫分析方法具有较好的检测性能。[0114]表10田间血清符合率统计[0115]table10fieldserumstatisticsofcoincidencerate[0116][0117]小反刍兽疫近年来在我国频频发生，对畜牧业的健康发展造成严重威胁，该病主要以免疫预防为主，因此准确检测免疫抗体对于防控该病非常重要。目前针对ppr检测的elisa大多以病毒n蛋白和h蛋白及其产生的抗体为基础。以n蛋白和h蛋白为基础的pprvelisa检测方法也已经建立，用于对该病的检测和流行病学调查(choi,nah,ko,kang,&joo,2003)，但以化学发光体系为基础，针对pprv特定蛋白抗体的检测方法尚未见报道。[0118]研究显示，在mv中h蛋白是细胞嗜性的主要决定因素，同时也是rpv兔化弱毒跨种致病的主要原因(yonedaetal.,2002)，显示h蛋白为麻疹病毒属病毒蛋白中最为重要的抗原决定蛋白。其同源二聚体蛋白由二硫键相互连接，h蛋白n末端的信号肽位于细胞质一侧，c末端的则在细胞质外(vongpunsawadetal.,2004)。根据h蛋白在囊膜上的分布，将其分为胞内区、跨膜区以及胞外区三个部分。在病毒感染早期，h蛋白通过参与病毒与宿主细胞受体之间相互融合的过程，介导完成病毒的感染。此外，研究人员利用mabs对pprvh蛋白的相关功能表位进行鉴定后发现第263-368位氨基酸、538-609位氨基酸两个区域为免疫优势位点(renukaradhya,sinnathamby,seth,rajasekhar,&shaila,2002)，显示h蛋白作为重要的抗原决定蛋白在免疫抗体检测上的优势。以pprvh蛋白中和单克隆抗体为基础的竞争elisa和阻断elisa的检测方法也已经建立(libeau,diallo,calvez,&lefèvre,1992；singh,sreenivasa,dhar,&bandyopadhyay,2004)，且利用病毒h蛋白单克隆抗体建立的elisa检测方法能够有效的提高试验结果的准确性。利用原核表达系统表达的pprvh蛋白，将其作为抗原建立的ielisa检测方法与国外c-elisa试剂盒相比符合率达到93.75％(栾志舫,2016)，由于h蛋白与n蛋白一样，其原核表达产物大多以包涵体形式存在，因此不利于产品的市场化开发。多表位肽以其合成纯度高、易于获取、用量少等优点，广泛应用于表位疫苗的研制及检测方法的开发。例如以合成肽作为抗原建立的elisa诊断方法，可有效区分orcd46-inducedfusionandtheirlocalizationonanewhemagglutininstructuralmodel.journalofvirology,78(1),302-313.[0142]yoneda,m.,.,bandyopadhyay,s.k.,shiotani,m.,.,fujita,k.,.,nuntaprasert,a.,.,miura,r.,.,...kai,c.,.(2002).rinderpestvirushprotein:roleindetermininghostrangeinrabbits.83(6),1457-1463.[0143]zakian,a.,nouri,m.,kahroba,h.,mohammadian,b.,&mokhber-dezfouli,m.r.(2016).thefirstreportofpestedespetitsruminants(ppr)incamels(camelusdromedarius)iniran.tropanimhealthprod,48(6),1215-1219.[0144]梁忠祥.(2017).小反刍兽疫多表位疫苗抗原的设计及其免疫效力评价.中国农业科学院..[0145]栾志舫,陈.,吴锦艳,王光祥,田宏,尹双辉,杨顺利,尚佑军,张志东,刘湘涛.(2016).小反刍兽疫病毒h蛋白的表达及间接elisa方法的建立.中国兽医学报(7期),1109-1114.[0146]孙雨，宋晓晖，王传彬，等.(2017).小反刍兽疫病毒n蛋白原核表达与间接elisa检测方法的建立.动物医学进展,38(1),6-10.[0147]胥传来,彭池方,郝凯,金征宇,&王武康.(2005).化学发光酶免疫方法检测克伦特罗残留.分析化学,33(5),699-702.[0148]张书圣,江淑芙,白洁洪,&邓妍娑.(1992).化学发光酶联免疫分析的进展.青岛科技大学学报(自然科学版)(01),103-108.[0149]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例和一般说明而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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