用于与质谱接口的微流体系统的软件的制作方法

用于与质谱接口的微流体系统的软件
1.交叉引用
2.本技术要求于2020年9月15日提交的美国临时专利申请no.63/078,856、于2020年5月6日提交的美国临时专利申请no.63/021,020、于2020年1月27日提交的美国临时专利申请no.62/966,372以及于2019年11月25日提交的美国临时专利申请no.62/940,071的权益，出于所有意图和目的，每项申请都通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.本公开涉及化学分析领域，并且具体地涉及混合物中分析物的分离及其后续的通过质谱(ms)的分析。基于分析物的固有质量从更复杂的分析物混合物中分离分析物组分并提供富集该质量的状态的馏分(fraction)的集合是分析化学的关键部分。以这种方式简化复杂的混合物降低了下游分析的复杂性。但是，当试图将已知的富集方法和/或设备与分析装备和/或技术接口时，会出现复杂情况。
4.已经使用了多种方法，例如，将蛋白质样本制备技术与下游检测系统(诸如质谱仪)接口。常见的方法是使用液相色谱制备样本并收集用于质谱(lc-ms)的馏分。这样做的缺点是要求将蛋白质样本消化成肽片段，从而导致必须分析的大量样本馏分以及运行后的复杂数据重建。虽然某些形式的液相色谱可以耦合到质谱仪，例如肽图反相色谱，但这些已知技术仅限于使用肽片段，而不是完整的蛋白质，这限制了它们的实用性。
5.将样本引入质谱仪的另一种方法是电喷雾电离(esi)。在esi中，通过在毛细管尖端或发射器尖端与质谱仪源板之间施加电场，从包括电喷射特征(诸如发射器尖端或孔口)的毛细管或微流体设备的远端发射样本和溶液的小液滴。液滴在这个感应出的电场中拉伸和膨胀以形成锥形发射(即，“taylor锥”)，其包括越来越小的液滴，这些液滴蒸发并产生气相离子，这些气相离子被引入质谱仪以进行进一步的分离和检测。通常，发射器尖端由毛细管形成，这为esi提供方便的液滴体积。但是，毛细管仅限于线性流路径，这不允许进行多步样本处理。esi还取决于esi尖端处的电压在整个分析过程中保持恒定，这在许多测定中可以是个挑战，因为内部流体电阻会随时间改变，从而更改电路的不同部分中的电压降，从而改变esi尖端处的电压。
6.微流体设备的其它工作已经开展。微流体设备可以通过各种已知技术生产并提供既定维度的流体通道，这些流体通道可以构成被设计为执行不同流体操纵的通道网络。与毛细管相比，这些设备提供了附加级别的控制和复杂性，使其成为样本制备的更好选择。但是，与毛细管一样，这些工具常常在引入质谱仪(如果有的话)之前对分离的分析物馏分提供有限的表征。而且，具有毛细管或微流体设备的系统一般不提供用于校准系统以在操作期间重新建立taylor锥的工具。
7.描述了用于改进电喷雾电离质谱(esi-ms)数据的质量的方法、设备、系统和软件，以及用于实现更定量表征和化学分离数据与质谱数据之间的改进相关性的方法、设备、系统和软件。


技术实现要素：

8.在一方面，本文公开了一种计算机实现的方法，包括：(a)使用处理器接收时间序列成像数据集，该数据集包括在分离通道中执行的等电聚焦分离的多个图像，其中多个图像中的每个图像与不同的时间点对应；(b)使用处理器将多个图像中的每个图像转换成根据对应时间点沿着分离通道的长度的位置的强度或吸光度测量；以及(c)使用处理器生成根据沿着分离通道的长度的位置的和根据时间的强度或吸光度测量的热图或3维图。
9.在一些实施例中，时间序列成像数据集还包括在分离通道中分离的分析物峰的移动的多个图像。在一些实施例中，时间序列成像数据集包括多个紫外(uv)吸光度图像。在一些实施例中，时间序列成像数据集包括多个荧光图像。在一些实施例中，荧光图像包括天然荧光图像。在一些实施例中，时间序列成像数据集包括以每分钟至少一个图像的帧速率获取的多个图像。在一些实施例中，时间序列成像数据集包括以每30秒至少一个图像的帧速率获取的多个图像。在一些实施例中，时间序列成像数据集包括以每10秒至少一个图像的帧速率获取的多个图像。在一些实施例中，该方法还包括在执行等电聚焦分离的同时对分离通道进行成像，其中在获取图像时迭代地执行(a)-(c)。在一些实施例中，热图或3维图被用于执行选自以下的一项或多项任务：将等电聚焦分离与附加的等电聚焦分离进行比较，将移动反应与等电聚焦分离进行比较，将移动反应与附加的移动反应进行比较，确定等电聚焦分离的完成，监视移动反应的进展，确定电渗流的存在，确定分离性能参数。在一些实施例中，分离性能参数是分离分辨率。
10.在另一方面，本文提供了一种计算机实现的方法，包括：(a)使用处理器接收：(i)第一数据集，包括来自在分离通道中执行的等电聚焦分离的根据沿着分离通道的长度的多个强度或吸光度测量；
11.(ii)第二数据集，包括根据时间的多个质谱仪总离子测量；(b)使用处理器将第二数据集转换成第三数据集，该第三数据集包括根据质量的离子计数测量；以及(c)使用处理器覆盖第一数据集和第三数据集的图。
12.在一些实施例中，(c)还包括使用处理器用第一数据集和第三数据集的图覆盖第二数据集的图。在一些实施例中，(c)包括对第二数据集进行去卷积以生成第三数据集。在一些实施例中，在(c)中，将第一数据集的强度或吸光度的第一峰映射到第三数据集的峰的集合。在一些实施例中，第二数据集被用于将第一数据集映射到第三数据集的峰的集合。在一些实施例中，计算机实现的方法还包括使用处理器将第一峰与峰的集合相关以确定所述第一峰的至少一种分析物种类的质量分布和等电点。在一些实施例中，第一峰与分析物峰对应并且产生关于分析物峰中的一种或多种分析物种类的等电点的信息。在一些实施例中，峰的集合与分析物峰中的一种或多种分析物种类的质量分布对应。在一些实施例中，计算机实现的方法还包括使用处理器来确定对于给定的等电点的分析物峰中的一种或多种分析物种类的身份。在一些实施例中，一种或多种分析物种类包括不同的蛋白质同种型。在一些实施例中，蛋白质同种型包括蛋白质的不同翻译后修饰。在一些实施例中，覆盖图示出(i)根据沿着分离通道的长度的多个强度或吸光度测量的强度或吸光度测量和(ii)根据质量的离子计数测量的时间序列。在一些实施例中，计算机实现的方法还包括使用耦合到质谱仪的单个集成微流体设备执行等电聚焦分离、移动和电喷雾电离以获得第一数据集和第二数据集。在一些实施例中(b)和(c)在esi-ms的1分钟内或与esi-ms并发地执行。在一些实
施例中(b)或(c)作为用于获取或处理电喷雾电离-质谱(esi-ms)数据的软件包的一部分自动执行。在一些实施例中，(b)和(c)作为用于获取或处理电喷雾电离-质谱(esi-ms)数据的软件包的一部分自动执行。
13.在另一方面，本文提供了一种方法，包括：使用(i)用于一种或多种分析物种类的质谱数据和(ii)一种或多种分析物种类的等电聚焦数据来向一种或多种分析物种类指派翻译后修饰。
14.在一些实施例中，翻译后修饰选自：羟基化、甲基化、脂化、乙酰化、二硫键、苏糖酰化、泛素化、糖基化、糖化、氨基酸添加或去除、酰胺化、脱酰胺化、异构化、氧化、岩藻糖基化、唾液酸化和磷酸化。在一些实施例中，该方法还包括对包括一种或多种分析物种类的分析物的混合物执行等电聚焦分离以生成等电聚焦数据，移动一种或多种分析物种类，以及执行电喷雾电离质谱(esi-ms)以生成质谱数据。在一些实施例中，等电聚焦分离和移动是使用包括分离通道和集成的电喷雾尖端的单个微流体设备执行的。在一些实施例中，等电聚焦数据包括根据沿着分离通道的距离的一个或多个强度或吸光度测量，并且其中强度或吸光度测量中的峰与包括具有相同的给定等电点的一种或多种分析物种类的分析物峰对应。在一些实施例中，该方法还包括，对于给定的等电点，使用质谱数据来区分一种或多种分析物种类的至少一种翻译后修饰。在一些实施例中，等电聚焦数据包括关于一种或多种分析物种类的等电点的信息，并且质谱数据包括关于一种或多种分析物种类的质量的信息。在一些实施例中，该方法还包括使用多个翻译后修饰的等电点移位和质量移位的已知值来将翻译后修饰指派给一种或多种分析物种类中的至少一种。在一些实施例中，翻译后修饰的指派发生在获取esi-ms数据的1分钟内。在一些实施例中，等电聚焦数据包括关于一种或多种分析物种类的一个或多个等电点的信息，其中质谱数据包括关于一种或多种分析物种类的一个或多个质量的信息，并且其中翻译后修饰是通过将一个或多个等电点和一个或多个质量与包括多个已知等电点和多个翻译后修饰的质量值的参考相匹配来指派的。在一些实施例中，参考包括公开可用的数据。
15.在另一方面，本文提供了一种用于在电喷雾电离(esi)尖端和质谱仪入口之间维持恒定电压差的方法，该方法包括：(a)向分离通道的近端施加第一电压，其中分离通道的远端与esi尖端流体连通及电连通；(b)向辅助流体通道的近端施加第二电压，其中辅助流体通道的远端与分离通道的远端流体连通及电连通；(c)执行分离反应以分离分析物的混合物，其中分离反应发生在分离通道内；(d)在反馈回路中监视分离通道的电阻的改变或esi尖端处的电压的改变，该反馈回路调整施加到质谱仪入口的第三电压以维持esi尖端和质谱仪入口之间的恒定电压差。在一些实施例中，分离通道是毛细管的内腔。在一些实施例中，毛细管包括微瓶喷嘴。在一些实施例中，分离通道是微流体设备内的流体通道。在一些实施例中，分离反应包括等电聚焦反应。在一些实施例中，分离反应包括电泳分离反应。在一些实施例中，将第一电压施加在耦合到分离通道的阴极处并且将第二电压施加在耦合到分离通道的阳极处。在一些实施例中，esi尖端或质谱仪入口处的电压保持接地。在一些实施例中，质谱仪入口处的电压保持在第三电压。在一些实施例中，通过将在esi尖端处测得的瞬态电压改变添加到第三电压来调整第三电压。在一些实施例中，esi尖端处的电压是使用电源测量的。在一些实施例中，电源耦合到分离通道。在一些实施例中，电源耦合到另一个通道，该另一个通道耦合到分离通道。在一些实施例中，电源被设置为0微安。在一些实施
例中，esi尖端处的电压是使用部署在esi尖端处的电极测量的，并且其中电极被配置为输出0微安的电流。在一些实施例中，反馈回路以至少0.1hz的频率操作。在一些实施例中，反馈回路以至少10hz的频率操作。在一些实施例中，反馈回路将esi尖端处的电压维持在预设值的
±
10％以内。在一些实施例中，反馈回路将esi尖端处的电压维持在预设值的
±
1％以内。在一些实施例中，反馈回路将esi尖端和质谱仪入口之间的恒定电压差维持在预设值的
±
10％以内。在一些实施例中，反馈回路将esi尖端和质谱仪入口之间的恒定电压差维持在预设值的
±
1％以内。
16.在另一方面，本文公开了一种用于在电喷雾电离(esi)尖端和质谱仪入口之间维持恒定电压差(δv
tip-ms
)的方法，该方法包括：(a)为δv
tip-ms
设置目标值(δv
target
)；(b)周期性地或连续地监视esi尖端处的第一电压，其中esi尖端与分离通道流体连通及电连通；(c)计算δv
tip-ms
的瞬时值；以及(d)使用反馈回路，周期性或连续地调整质谱仪入口处的第二电压，使δv
tip-ms
＝δv
target
。在一些实施例中，分离通道是毛细管的内腔。在一些实施例中，毛细管包括微瓶喷嘴。在一些实施例中，分离通道是微流体设备内的流体通道。在一些实施例中，在分离通道中进行的分离反应包括等电聚焦反应。在一些实施例中，在分离通道中执行的分离反应包括电泳分离反应。在一些实施例中，esi尖端处的第一电压或质谱仪入口处的第二电压保持接地。在一些实施例中，使用部署在esi尖端处的电极监视esi尖端处的第一电压。在一些实施例中，部署在esi尖端处的电极被配置为输出0微安的电流。在一些实施例中，使用与流体通道电连通并且被配置为输出0微安电流的电源监视esi尖端处的第一电压，该流体通道在靠近esi尖端的位置处与分离通道相交。在一些实施例中，反馈回路以至少0.1hz的频率运行。在一些实施例中，反馈回路以至少10hz的频率操作。在一些实施例中，反馈回路以至少100hz的频率操作。在一些实施例中，反馈回路将δv
tip-ms
维持在δv
target
的
±
10％以内。在一些实施例中，反馈回路将δv
tip-ms
维持在δv
target
的
±
1％以内。
17.在另一方面，本文公开了一种用于维持电喷雾电离(esi)尖端与质谱仪入口之间的恒定电压差的计算机实现的方法，该方法包括：(a)使用处理器接收esi尖端处的第一电压的测量，其中esi尖端与分离通道流体连通及电连通；(b)使用处理器接收质谱仪的入口处的第二电压的测量；以及(c)使用处理器将第一电压与第二电压进行比较，其中如果第二电压与第一电压不同，那么处理器使质谱仪的入口或esi尖端处的电压被调整，使得esi尖端处的电压与质谱仪的入口处的电压之间的差保持恒定。在一些实施例中，该方法还包括(d)使用反馈回路以指定的频率重复步骤(a)至(c)。在一些实施例中，分离通道包括(i)毛细管的内腔或(ii)微流体设备内的流体通道。在一些实施例中，毛细管包括微瓶喷嘴。在一些实施例中，在分离通道中执行分离反应，并且其中分离反应包括等电聚焦反应。
18.在一些实施例中，esi尖端处的电压或质谱仪的入口处的电压保持接地。在一些实施例中，esi尖端处的电压是使用放置在esi尖端处的电极来测量的。在一些实施例中，用与在esi尖端附近与分离通道相交的流体通道电连通并且被配置为输出0微安电流的电源来监视esi尖端处的电压。在一些实施例中，反馈回路以至少0.1hz的频率运行。在一些实施例中，反馈回路以至少10hz的频率操作。
19.本文还公开了用于在执行分离反应时将电喷雾电离(esi)尖端维持在相对于地的恒定电压的方法，该方法包括：a)将第一电压施加到分离通道的近端，其中分离通道的远端与esi尖端流体连通及电连通；b)向辅助流体通道的近端施加第二电压，其中辅助流体通道
的远端与分离通道的远端流体连通及电连通；c)执行分离反应以分离分析物的混合物，其中分离反应发生在分离通道内；以及d)在反馈回路中监视分离通道的电阻的改变或esi尖端的电压变化，该反馈回路调整第一电压及第二电压以维持跨分离通道的恒定电压降以及esi尖端处的恒定电压。在一些实施例中，分离通道是毛细管的内腔。在一些实施例中，毛细管包括微瓶喷嘴。在一些实施例中，分离通道是微流体设备内的流体通道。在一些实施例中，分离反应包括等电聚焦反应。在一些实施例中，分离反应包括电泳分离反应。在一些实施例中，第一电压施加在阴极处并且第二电压施加在阳极处。在一些实施例中，esi尖端处的电压保持接地。在一些实施例中，esi尖端处的电压保持在第二电压处。在一些实施例中，对第一和第二电压的调整包括从第一电压和第二电压中减去在esi尖端处测得的瞬态电压改变。在一些实施例中，使用提供第一或第二电压的电源测量esi尖端处的电压。在一些实施例中，反馈回路以至少0.1hz的频率操作。在一些实施例中，反馈回路以至少10hz的频率操作。在一些实施例中，反馈回路将esi尖端处的电压维持在预设值的
±
10％以内。在一些实施例中，反馈回路将esi尖端处的电压维持在预设值的
±
1％以内。在一些实施例中，反馈回路将分离通道两端的电压降维持在预设值的
±
10％以内。在一些实施例中，反馈回路将分离通道两端的电压降维持在预设值的
±
1％以内。
20.本文还公开了方法，包括：a)提供包括两种或更多种分析物的混合物的样本；b)在包含样本的流体通道内执行分离，以从两种或更多种分析物的混合物中解析出各个分析物峰；c)计算在流体通道的内容物向流体通道出口移动时分析物峰的速度；以及d)使用分析物峰的速度来确定分析物峰到达流体通道出口的时间。在一些实施例中，流体通道是毛细管的内腔。在一些实施例中，流体通道是微流体设备的一部分。在一些实施例中，分离基于等电聚焦(ief)、毛细管区带电泳(cze)、毛细管凝胶电泳(cge)、毛细管等速电泳(citp)或胶束电动色谱(mekc)。在一些实施例中，分析物峰的速度是根据分析物峰从第一位置移动到第二位置所需的时间间隔计算的。在一些实施例中，第一位置、第二位置和时间间隔是由流体通道的一系列两个或更多个图像确定的。在一些实施例中，两个或更多个图像的系列包括紫外光吸光度图像、可见光吸光度图像或荧光图像。在一些实施例中，流体通道出口包括与质谱仪的电喷雾接口。在一些实施例中，分析物峰到达流体通道出口的时间被用于将质谱仪数据与分析物峰相关联。在一些实施例中，流体通道的内容物的移动包括使用电渗移动技术、化学移动技术、流体动力移动技术或其任何组合。在一些实施例中，两种或更多种分析物包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子、小有机化合物或其任何组合。在一些实施例中，为生物药物候选和参考药物的样本收集的质谱仪数据的比较被用于确定生物相似性。在一些实施例中，分析物峰的速度被用在反馈回路中以调整用于分析物峰的分离或移动的控制参数。在一些实施例中，控制参数是电压。在一些实施例中，反馈回路以至少0.1hz的频率操作。
21.本文公开的方法包括：a)提供包括两种或更多种分析物的混合物的样本；b)在包含样本的流体通道内执行分离，以从两种或更多种分析物的混合物中解析出各个分析物峰；以及c)经由与质谱仪的电喷雾接口收集从流体通道发射的两个或更多个个体分析物峰的质谱仪数据；其中用于质谱仪的数据收集模式在高质量扫描和低质量扫描之间交替。在一些实施例中，质谱仪以至少0.5hz的频率在高质量扫描和低质量扫描数据收集模式之间切换。在一些实施例中，流体通道是毛细管的内腔。在一些实施例中，流体通道是微流体设
备的一部分。在一些实施例中，分离基于等电聚焦(ief)、毛细管区带电泳(cze)、毛细管凝胶电泳(cge)、毛细管等速电泳(citp)或胶束电动色谱(mekc)。在一些实施例中，高质量扫描捕获用于生物大分子的质谱数据。在一些实施例中，生物大分子包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、核酸分子、还原蛋白质、融合蛋白质、蛋白质复合物或其任何组合。在一些实施例中，高质量扫描的m/z比范围是1500至6000。在一些实施例中，低质量扫描捕获用于执行等电聚焦分离的溶液相两性电解质的质谱数据。在一些实施例中，低质量扫描的m/z比范围是150至1500。在一些实施例中，一种或多种溶液相两性电解质的质谱用于校准在高质量扫描中识别出的生物大分子的等电点(pi)。
22.本文公开的方法包括：a)在包含样本的流体通道内执行分离，其中样本包含两种或更多种分析物的混合物，并且其中分离从两种或更多种分析物的混合物中解析各个分析物峰；b)将流体通道的内容物朝着流体通道出口移动，其中流体通道出口包括与质谱仪的电喷雾接口；以及c)同时或交替地对以下成像：(i)流体通道的至少一部分以监视(a)和(b)期间分析物峰的位置，以及(ii)存在于流体通道出口和质谱仪的入口之间的taylor锥以监视电喷雾性能。在一些实施例中，分析物峰在流体通道的至少一部分的两个或更多个图像中的位置被用于计算分析物峰的速度。在一些实施例中，分析物峰的速度被用于确定分析物峰将到达流体通道出口的时间。在一些实施例中，分析物峰到达流体通道出口的时间被用于将质谱仪数据与分析物峰相关联。在一些实施例中，得自taylor锥的成像的数据用在反馈回路中以调整电喷雾性能。在一些实施例中，反馈回路以至少0.1hz的频率操作。在一些实施例中，流体通道是毛细管的内腔。在一些实施例中，流体通道是微流体设备的一部分。在一些实施例中，分离基于等电聚焦(ief)、毛细管区带电泳(cze)、毛细管凝胶电泳(cge)、毛细管等速电泳(citp)或胶束电动色谱(mekc)。在一些实施例中，成像包括紫外光吸光度成像、可见光吸光度成像或荧光成像。在一些实施例中，流体通道的内容物的移动包括使用电渗移动技术、化学移动技术、流体动力移动技术或其任何组合。在一些实施例中，两种或更多种分析物包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子、小有机化合物或其任何组合。
23.本文公开了用于在执行分离反应时将电喷雾电离(esi)尖端维持在相对于地的恒定电压的计算机实现方法，该方法包括：a)使用处理器接收esi尖端处的电压的第一测量，其中分离通道的远端与esi尖端流体连通及电连通；b)使用处理器接收esi尖端处的电压的第二测量；c)使用处理器将第二测量与第一测量进行比较，其中如果第二测量不同于第一测量，那么处理器使得分离通道的近端处的电压和辅助流体通道的近端处的电压被调整，辅助流体通道包括与分离通道的远端流体和电连通的远端，使得esi尖端处的电压返回到第一测量值；以及d)以指定的频率重复步骤(a)至(c)。在一些实施例中，分离通道包括毛细管的内腔或微流体设备内的流体通道。在一些实施例中，分离反应包括等电聚焦反应。在一些实施例中，分离反应包括电泳分离反应。在一些实施例中，esi尖端处的电压保持接地。在一些实施例中，指定的频率至少是1hz。在一些实施例中，esi尖端处的电压维持在指定值的
±
5％以内。
24.本文还公开了计算机实现的方法，包括：a)使用处理器接收图像数据，该图像数据包括使用检测器获取的两个或更多个图像，该检测器被配置为对毛细管或微流体设备中的分离通道的全部或部分进行成像；b)使用相同或不同的处理器处理图像数据以确定分析物
峰在两个或更多个图像中的分离通道内的位置；c)使用相同或不同的处理器，基于分析物峰在两个或更多个图像中的位置和两个或更多个图像的获取之间的已知时间间隔计算分析物峰的速度；以及d)使用相同或不同的处理器确定分析物峰到达分离通道出口的时间。在一些实施例中，在分离通道内执行的分离反应包括等电聚焦(ief)、毛细管区带电泳(cze)、毛细管凝胶电泳(cge)、毛细管等速电泳(citp)或胶束电动色谱(mekc)。在一些实施例中，两个或更多个图像包括紫外光吸光度图像、可见光吸光度图像或荧光图像。在一些实施例中，分离通道出口与质谱仪流体连通或包括与质谱仪的电喷雾接口。在一些实施例中，分析物峰到达分离通道出口的时间被用于将质谱仪数据与分析物峰相关联。在一些实施例中，分析物从混合物中分离并且包括蛋白质、蛋白质-药物缀合物、肽、核酸分子、碳水化合物分子、脂质分子、代谢物分子或小的有机化合物。在一些实施例中，为生物药物候选和参考药物的样本收集的质谱仪数据的比较被用于确定生物相似性。在一些实施例中，分析物峰的速度被用在反馈回路中以调整用于在分离通道中执行的分离反应的控制参数。在一些实施例中，控制参数是电压。在一些实施例中，反馈回路以至少0.1hz的频率操作。
25.通过引用并入
26.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本文，其程度就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地通过引用整体并入。如果本文中的术语与并入参考文献中的术语发生冲突，那么以本文中的术语为准。
附图说明
27.本发明的新颖特征在所附权利要求中特别阐述。通过参考以下阐述说明性实施例的详细描述，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中利用了本发明的原理，以及附图：
28.图1a-b提供了根据本公开的一个实施例的用于自动加载的样本的等电聚焦(ief)和电喷雾电离(esi)的设备的示意图。图1a示出了设备的示意图。图1b示出了设备的另一个示意图。
29.图2提供了用于计算分离的分析物带的等电点的计算机实现的方法的示例流程图。
30.图3提供了用于确定一个或多个分离的分析物带的速度并计算退出时间的计算机实现的方法的另一个示例流程图。
31.图4提供了用于实现基于成像的反馈和控制esi-ms分析系统的一个或多个操作参数的计算机实现的方法的另一个示例流程图。
32.图5提供了用于所公开系统的一个实施例的硬件组件的示意性框图。
33.图6提供了用于所公开系统的一个实施例的软件组件的示意性框图。
34.图7a-b图示了用在本发明的一些实施例中的微流体设备。图7a提供了示例性微流体设备的流体通道网络的示意图。图7b提供了组装的微流体设备的计算机辅助设计(cad)图。图7a中所示的流体通道层夹在两个透明层之间以密封流体通道。
35.图8提供了分离样本的移动期间taylor锥和电喷雾电离(esi)羽流的图像。
36.图9a-f提供了在使用等电聚焦分离分析物的混合物中的分析物后样本的移动的数据的非限制性示例。图9a示出了t＝0分钟(完成等电聚焦)时的吸光度曲线。图9b示出了t
＝1分钟时的吸光度曲线。图9c示出了t＝2分钟时的吸光度曲线。图9d示出了t＝3分钟时的吸光度曲线。图9e示出了t＝4分钟时的吸光度曲线。图9f示出了t＝5分钟时的吸光度曲线。
37.图10a-b提供了被设计为执行等电聚焦以分离分析物和分离的分析物混合物的后续移动的微流体设备的代表性电路图。图10a提供了在esi尖端将保持接地或靠近地的情况下图7a中所示的微流体设备在等电聚焦期间的代表性电路图。图10b示出了图7a中所示的微流体设备在分离的分析物混合物的化学移动期间的代表性电路图。在这个示例中，假设通道114(在图7a中示出)的电阻可忽略不计。
38.图11a-b提供了移动的代表性数据，同时将esi尖端保持在0v。图11a示出了电压随时间变化的曲线。图11b示出了电流随时间变化的曲线。
39.图12提供了电压反馈回路的示例流程图，其中esi尖端保持在+3000v。
40.图13a-e提供了本公开的微流体设备的代表性电路图的示例。图13a提供了图7a中所示的微流体设备在化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将使用附加电阻器保持在正电压以将电流吸收到地。图13b示出了图7a中所示的微流体设备在化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将使用附加电阻器将电流保持在正电压以将电流吸收到第三电源。图13c示出了图7a中所示的微流体设备在化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将使用场效应晶体管(fet)保持在正电压以吸收电流。图13d示出了图7a中所示的微流体设备在化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将使用双极结晶体管(bjt)保持在正电压以吸收电流。图13e提供了图7a中所示的微流体设备在分离的分析物混合物的化学流动期间的代表性电路图，其中esi尖端将保持接地或靠近地。
41.图14a-b提供了毛细管接头喷雾器的示意图。图14a提供了毛细管接头喷雾器的代表性图。图14b示出了图14a中毛细管接头喷雾器图的代表性电阻器电路图。
42.图15提供了计算机控制的电压反馈回路的示例性流程图，其中esi尖端保持在0v。
43.图16面板a-e提供了分析物分离数据的示例以及分离的分析物种类的对应质谱数据。图16面板a示出了分离的分析物混合物的电泳图。图16面板b示出了分离的种类的酸性峰的质谱图。图16面板c示出了图16面板a的电泳图中存在的主峰的质谱图。图16面板d和图16面板e示出了图16面板a中所示的电泳图的两个碱性峰的质谱。
44.图17a-b提供了分离数据的示例。图17a示出了成像的等电聚焦电泳图的代表性示例。图17b提供了分离通道内分离和移动的动态热图显示的代表性示例。
45.图18提供了多轴曲线的代表性示例，显示了组合的等电聚焦电泳图、质谱仪总离子色谱图和个体质谱图。
46.图19提供了被显示为三轴曲线图的分离和移动数据的动态热图的代表性示例，其中x轴绘制距离、y轴绘制时间和z轴绘制吸光度(任意单位)。
47.图20面板a-b提供了等电聚焦和质谱中单克隆抗体数据的代表性示例。图20面板a提供了电荷变体的等电聚焦数据和质谱色谱图。图20面板b示出了解卷积的质量数据的示例。
48.图21面板a-b提供了示例翻译后修饰以及对蛋白质质量和电荷的预期改变的表。图21面板a提供了列出翻译后修饰以及由于修饰而引起的蛋白质质量和电荷的预期改变的代表性表。图21面板b提供了可以导致相同的质量改变但对蛋白质电荷有不同的影响的修饰的代表性示例。
49.图22面板a-b提供了质谱的示例。图22面板a提供了通过等电聚焦分离的电荷变体的分析获得的解卷积质谱的代表性示例。图22面板b提供了从通过等电聚焦分离的电荷变体的分析中获得的解卷积的质谱的另一个代表性示例。
50.图23面板a-b提供了比较主要蛋白质电荷变体与酸性和碱性变体的解卷积的质量的代表性示例。图23面板a提供了主要蛋白质电荷变体与酸性变体的解卷积的质量的示例。图23面板b提供了主要蛋白质电荷变体与碱性变体的解卷积的质量的示例。
具体实施方式
51.本文描述的一些实施例涉及用于分析来自与质谱检测集成的基于毛细管和微流体的分离系统的数据并指导其操作的创新软件和系统。在一些实施例中，分析物在分离期间在毛细管中或在微流体设备上成像，并且在分离后在质谱仪中测量分子量或质荷比。所公开的方法、装置、系统和软件为分离的分析物峰提供更准确的表征，并用于实现化学分离数据和质谱(ms)数据之间的改进相关性。还公开了用于改进电喷雾电离质谱(esi-ms)数据质量的方法、设备、系统和软件。所公开的方法、设备、系统和软件在包括但不限于蛋白质组学研究、药物发现和开发以及临床诊断的各种领域中具有潜在应用。例如，在一些实施例中，所公开的方法、设备、系统和软件可以用于在开发和/或制造期间表征生物和生物仿制药，如下文将更详细讨论的。生物制品和生物仿制药是一类药物，其包括例如重组蛋白、抗体、活病毒疫苗、人血浆衍生蛋白、细胞药物、天然来源蛋白、抗体-药物偶联物、蛋白-药物偶联物和其它蛋白药物。
52.描述被设计为执行多种化学分离技术中的任何一种并且还包括用于执行下游基于质谱的分析的电喷雾电离接口的微流体设备。在优选实施例中，所公开的设备被设计为对蛋白质或其它生物大分子执行等电聚焦。在另一个优选实施例中，所公开的设备被设计为与成像技术一起使用。用于将成像的微流体分离与质谱集成的设备和方法先前已在例如公开的pct专利申请公开no.wo 2017/095813和美国专利申请公开no.us 2017/0176386中进行了描述，这些通过引用并入本文用于所有目的。除其它外，这些申请尤其描述了结合ms分析执行成像分离的系统。此类微流体系统表示生物制品表征的重大进步。但是，为了使这种系统提供最大的益处，具有创新的软件和系统来帮助这些系统的操作以及成像的和ms数据的下游集成将是有益的，如本文所公开的。
53.因而，在优选实施例中，所公开的微流体设备可以与成像技术结合使用，例如，对已经从分析物的混合物在分离通道中等电分离以形成一系列富集馏分的一种或多种分析物进行等电点(pi)的准确确定，这些馏分包括基本上纯的各个分析物组分(在本文中也称为“峰”或“带”)。对分离通道的全部或一部分进行成像允许确定与待分离的样本一起注入的两个或更多个pi标准品(或pi标记)的位置，从而允许通过外推法为每个分离的分析物峰计算更准确的pi以确定局部ph值。在一些实施例中，在执行分离的同时对分离通道内的分析物混合物执行成像，并且可选地，对正在被分离的分析物中的一种或多种的等电点执行确定并且在执行分离的同时迭代更新。在一些实施例中，在分离完成之后，对已经被等电聚焦的一种或多种分析物的等电点进行基于成像的确定。在一些实施例中，在分离完成之后，并且在分离的分析物混合物已经朝着电喷雾尖端移动之前，对已经被等电聚焦的一种或多种分析物进行基于成像的等电点确定。在一些实施例中，本文公开的基于成像的方法可以
与基于毛细管的esi-ms系统一起使用，而不是与基于微流体设备的esi-ms系统一起使用。在一些实施例中，一个或多个分析物峰的等电点的确定可以通过计算机实现的方法来执行。
54.在另一个优选实施例中，所公开的微流体设备可以与成像技术结合使用，以便在分离的分析物混合物移动之后，即，当峰移出分离通道并朝着电喷雾尖端移动时，对分离的分析物峰进行成像。在一些实施例中，成像的移动步骤与成像的分离步骤是相同的步骤，诸如当实现包括毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、等速电泳、毛细管电动色谱、胶束电动色谱、流动平衡毛细管电泳、或通过差速分离分析物混合物组分的任何其它分离技术的分离步骤时。在一些实施例中，将分析成像的移动步骤以将成像的分离中的富集馏分与质谱相关联。移动的分析物峰的成像可以被用于例如基于它们在一系列移动图像中的位置确定一个或多个分析物峰的速度，然后可以将其用于确定(一个或多个)分析物峰将退出分离通道或被电喷雾尖端发射的时间点，并且因此可以被用于将质谱仪数据与特定分析物峰相关联。在一些情况下，(一个或多个)分析物峰的速度是根据分析物峰移动某个位移值(例如，从第一位置到第二位置)所需的时间间隔来计算的。在一些实施例中，移动的分析物峰的成像可以允许在(一个或多个)峰通过流体通道并由电喷雾尖端发射时直接监视峰，并且因此可以被用于将质谱仪数据与特定分析物峰直接关联。在一些实施例中，本文公开的基于成像的方法可以与基于毛细管的esi-ms系统一起使用，而不是与基于微流体设备的esi-ms系统一起使用。在一些实施例中，一个或多个分析物峰的速度、它们的实际或预测的分离通道退出时间和/或它们的电喷雾发射时间的确定可以通过计算机实现的方法来执行。
55.在一些实施例中，分离的分析物峰的移动可以通过微流体设备中的电场或流参数的改变来发起。在一些实施例中，将电源连接到微流体设备的一个或多个电极将被连接或断开以通过计算机实现的方法发起移动。在一些实施例中，在电喷雾尖端处形成的taylor锥可以在移动步骤期间被成像。在一些实施例中，计算机实现的图像分析可以被用于识别稳定的电喷雾操作条件。在一些实施例中，图像分析可以由操作者执行。在一些实施例中，可以使用自动图像处理软件来执行图像分析。在一些实施例中，将调整已知影响电喷雾性能的操作参数中的一个或多个以重新获得稳定的电喷雾操作条件。可以被调整的操作参数的示例包括但不限于电泳电压、流速、从电喷雾尖端到ms入口的距离、ms电压等。在一些实施例中，可以使用计算机实现的方法调整电喷雾参数。
56.在一些实施例中，可以使用多于一个电源来生成电泳电场。在一些实施例中，可以使用具有正极性的两个电源。在一些实施例中，一个或多个电源可以具有负极性。在一些实施例中，可以一致地改变电源上的电压设置以在用于电泳分离的分离通道中维持相同的电压梯度。在一些实施例中，可以改变电源上的电压设置以在电喷雾尖端维持恒定电压。在一些实施例中，多个电源可以是单个多通道电源中的不同通道。在一些实施例中，可以在分离通道中执行等电聚焦，并且通道中的电阻可以随时间增加。在一些实施例中，可以在分离通道中执行化学移动，并且通道中的电阻可以随时间降低。在一些实施例中，可以执行压力驱动的移动，并且通道中的电阻可以随着新试剂被推入通道中而随时间改变。在一些实施例中，电喷雾尖端可以保持接地。在一些实施例中，电喷雾尖端可以相对于质谱仪保持在特定电压。在一些实施例中，电喷雾尖端可以相对于地保持在特定电压。在一些实施例中，计算机实现的方法可以调整电压以维持分离通道中的恒定电场强度(或阳极和阴极之间的恒定
电压降)以及电喷雾尖端处的恒定电压。在一些实施例中，可以使用电压表测量尖端处的电压。在一些实施例中，可以使用位于尖端处或内部的电极测量尖端处的电压。在一些实施例中，可以使用电流控制将附加电源设置为0μa并用作电压表以读取尖端电压。在一些实施例中，计算机实现的方法将读取尖端处的电压值并调整电压以维持分离通道中的恒定电场强度(或阳极和阴极之间的恒定电压降)并在尖端处维持恒定电压。在一些实施例中，计算机实现的方法将基于流过分离电场电路的电流流来计算esi尖端处的电压。在一些实施例中，将调整跨分离通道的电压降，使得在分离通道中施加恒定功率或最大功率，其中在分离通道中施加的功率计算如下：
57.功率＝跨分离通道的电压x分离通道中的电流其中电流可以在分离期间持续或周期性测量，并且电流测量可以被用于调整跨分离通道的电压。这种控制分离通道中的功率的方法对于管理分离通道中的温度效应可以是有用的。
58.在一些实施例中，分离路径将是一定长度的线性涂覆或未涂覆的毛细管、管或管线，其入口插入包含酸性阳极电解液和正极或碱性阴极电解液和负极的小瓶中。在一些实施例中，分离路径的出口将插入接头喷雾器中。在一些实施例中，接头喷雾器容纳用于辅助管、管线或毛细管的三通，该三通可以将另一种导电补充溶液引入毛细管出口，从而提供液体到液体的电接触和液体流以支持电喷雾和将从分离通道出现的分析物运输到尖端以通过电喷雾电离引入质谱仪。在一些实施例中，系统可以在分离路径入口处配置有阳极电解液和正电极，并且分离路径的接头或远侧部分可以在聚焦之前加载阴极电解液。在聚焦完成之后，可以通过流体动力或电渗力将具有竞争性阴离子的移动剂引入接头中。在一些实施例中，分离路径入口可以浸没在具有阴极电解液和负电极的小瓶中，并且毛细管的接头或远端部分可以在聚焦之前装载阳极电解液。在聚焦完成之后，可以通过流体动力或电渗力将具有竞争性阳离子的移动剂引入接头中。在一些实施例中，分离通道将是一段线性毛细管，一端插入到将毛细管连接到正极的阳极液储器中，另一端插入到将毛细管连接到负极的阴极液储器中以进行等电聚焦。在一些实施例中，在聚焦之后，毛细管的阴极液端将从阴极液中移除并插入到质谱仪附近的接头喷雾器(例如，微瓶喷雾器)中，如图14a中所示。在一些实施例中，接头喷雾器可以提供一定体积的移动剂以使esi中的分析物充电并移动聚焦的分析物。在一些实施例中，接头喷雾器可以提供电连接以完成移动电路。在一些实施例中，将调整阳极电解液和接头喷雾器处的电压，使得阳极电解液和接头喷雾器之间的电压(δv)或电场的改变保持恒定，并且esi尖端处的电压保持恒定。在一些实施例中，阳极电解液和接头喷雾器之间的δv或电场可以随时间波动或改变，并且esi尖端处的电压可以改变。在此类情况下，可以调整施加到质谱仪入口的电压或电位，以使esi尖端和质谱仪入口之间的电压差(δv
tip-ms
)保持恒定。
59.在一些实施例中，分离通道(例如，毛细管)包括微瓶，其可以促进将流动的流出物转移到esi。微瓶可以是毛细管的一部分或可以附加和/或融合到分离通道。微瓶可以是esi尖端的一部分。在一些情况下，微瓶可以包括接头喷雾器或者是接头喷雾器的一部分。微瓶可以在通道的一部分中或在esi尖端处提供流体流路径(例如，用于鞘液)。
60.在一些实施例中，一个电源可以连接到电阻器以产生电流吸收器。在一些实施例中，电阻器可以通过将电泳电路接地来吸收电流。在一些实施例中，电阻器是场效应晶体管(fet)可调电阻器。在一些实施例中，电阻器可以是精密可变电阻器、继电器电阻器网络、梯
形电阻器或能够对吸收电流提供路径的任何其它电阻性元件。在一些实施例中，电流吸收器可以是fet，其中fet被控制以使得它提供流过fet的恒定电流或者可以被控制以在需要时用作开路或短路。在一些实施例中，双极结型晶体管(bjt)可以用于电流吸收功能。在一些实施例中，电阻器可以通过将电泳电路连接到电流吸收电源来吸收电流。在一些实施例中，电流吸收电源的电压设置将随着分离通道中的电阻随时间改变而被调整。在一些实施例中，电流吸收电源上的电压将被调整以维持跨电阻器的恒定电流。在一些实施例中，电阻器或电阻器的集合、电阻性电路等可以用作电流吸收器。
61.在一些实施例中，被扫描的质荷比(m/z)范围可以在移动/esi步骤期间改变。在一些实施例中，可以使用计算机实现的方法在高m/z范围和低m/z范围之间切换。在一些实施例中，一个m/z范围内的质谱可以用作用于分离不同质量范围内的分析物的内标。这个谱可以包括用于自由溶液等电梯度两性电解质的数据，其可以用作等电点(pi)的标准，或者这个谱可以包括可以用作电泳(例如毛细管区带电泳)的标准的电泳迁移率标准的数据。在一些情况下，这个谱可以包括可以在分离步骤中解析的任何分子的数据，例如，通过pi、荷质比、凝胶声誉、电泳迁移率等，其质量范围不同于感兴趣的分析物。
62.在一些实施例中，电荷变体峰与质谱数据的相关性可以允许确认翻译后修饰或其它蛋白质或肽修饰。例如，可以在质谱仪分析期间检测两个分子之间的质量差异。在一些情况下，可以存在可能导致检测到的质量差异的多种修饰。在一些情况下，可能已知某些修饰会造成分子的特定电荷移位(或等电点的改变)。在一些情况下，知道与质量差异相关联的电荷移位可以允许排除特定修饰或修饰的集合。在一些实施例中，知道电荷移位并检测相同或相似的质量(在质谱仪的质量准确性限制内)可以允许排除特定修饰或修饰的集合。在一些情况下，知道电荷移位并检测相同或相似的质量(在质谱仪的质量准确性范围内)可以允许将特定修饰或修饰的集合指派给分子。在一些情况下，知道与质量差异相关联的电荷移位可以允许将特定修饰或修饰的集合指派给分子。
63.本公开的系统可以包括以下一项或多项：(i)毛细管或微流体设备，其被设计为执行分析物分离，例如基于等电聚焦的分离，其提供与质谱仪的电喷雾接口，(ii)质谱仪，(iii)成像设备或系统，(iv)处理器或计算机，(v)用于协调基于毛细管或微流体设备的分析物分离操作与图像获取的软件，(vi)用于在执行分离的同时、在分离完成之后或将pi标准品和分析物峰朝着电喷雾尖端移动之后处理图像并确定分离通道中一个或多个pi标准品或分析物峰的(一个或多个)位置的软件；(vii)用于处理图像并确定一个或多个pi标准品或分析物峰的速度、退出时间和/或电喷雾发射时间的软件，(viii)用于同时或交替获取分离通道的图像以监视分析物峰的位置和存在于电喷雾尖端和质谱仪的入口之间的taylor锥以监视电喷雾性能的软件；(ix)用于处理taylor锥的图像并调整电喷雾尖端相对于质谱仪入口的位置、流经电喷雾尖端的流体、电喷雾尖端和质谱仪之间的电压中的一项或多项或其任何组合以影响质谱仪数据质量的改变的软件；(x)用于控制从电喷雾接口发射的各个分析物峰的质谱仪数据的收集的软件，其中质谱仪的数据收集模式在高质量扫描和低质量扫描之间交替；(xi)用于读取电喷雾尖端和/或质谱仪入口处的电压并调整(a)分离通道电压以维持通道中的恒定场强(或阳极和阴极之间的恒定电压降)同时维持尖端上的恒定电压和/或(b)施加到质谱仪入口的电压，以维持尖端和质谱仪入口之间的恒定电压的软件；或其任何组合。在一些实施例中，系统可以包括集成系统，其中这些功能组件的选
择被打包在固定配置中。在一些实施例中，系统可以包括模块化系统，其中可以改变功能组件的选择以便为新应用重新配置系统。在一些实施例中，这些功能系统组件中的一些，例如毛细管或微流体设备，是可更换的或一次性的组件。
64.要理解的是，前述一般概述和以下描述都只是示例性和解释性的，并且不限制本文描述的方法和设备。
65.定义：除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语与本公开所属领域的本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
66.如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。除非另有说明，否则本文对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。类似地，短语“包括”和“包含”不旨在进行限制。
67.如本文所使用的，术语“大约”一个数字是指该数字加上或减去该数字的10％。在范围的上下文中使用的术语“大约”是指该范围减去其最低值的10％和加上其最大值的10％。
68.分析物：如上所述，所公开的方法、设备、系统和软件使得能够更准确地表征分离的分析物峰，并改进化学分离数据和质谱数据之间的相关性。在一些情况下，这些分析物可以是例如释放的聚糖、碳水化合物、脂质或其衍生物(例如，细胞外囊泡、脂质体等)、dna、rna、完整蛋白质、消化蛋白质、蛋白质复合物、抗体-药物缀合物、抗体、抗体片段、蛋白质-药物缀合物、肽、代谢物、有机化合物或其它生物学相关分子，或其任何组合。在一些情况下，这些分析物可以是小分子药物。在一些情况下，这些分析物可以是蛋白质混合物中的蛋白质分子，诸如生物蛋白质药物和/或从培养或体内分离的细胞中收集的裂解物。
69.样本：所公开的方法、设备、系统和软件可以被用于从多种生物或非生物样本中的任何一种获得的分析物的分离和表征。示例包括但不限于组织样本、细胞培养样本、全血样本(例如，静脉血、动脉血或毛细血管血样本)、血浆、血清、唾液、间质液、尿液、汗液、泪液、源自工业酶或生物药物制造过程的蛋白质样本、环境样本(例如，空气样本、水样本、土壤样本、表面擦拭样本)等。在一些实施例中，在使用所公开的方法和设备进行分析之前可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何技术用于综合化学分离和质谱表征。例如，在一些实施例中，可以处理样本以提取蛋白质或核酸。可以从多种来源或受试者中的任何一种收集样本，例如细菌、病毒、植物、动物或人类。
70.样本体积：在所公开的方法和设备的一些实施例中，可以通过使用微制造技术实现的小型化使得能够处理非常小的样本体积。在一些实施例中，用于分析的样本体积可以在大约0.1μl至大约1ml的范围内。在一些实施例中，用于分析的样本体积可以是至少0.1μl、至少1μl、至少2.5μl、至少5μl、至少7.5μl、至少10μl、至少25μl、至少50μl、至少75μl、至少100μl、至少250μl、至少500μl、至少750μl、或至少1ml。在一些实施例中，用于分析的样本体积可以是至多1ml、至多750μl、至多500μl、至多250μl、至多100μl、至多75μl、至多50μl、至多25μl、至多10μl、至多7.5μl、至多5μl、至多2.5μl、至多1μl或至多0.1μl。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些实施例中，用于分析的样本体积可以在大约5μl至大约500μl的范围内。本领域技术人员将认识到用于分析的样本体积可以具有这个范围内的任何值，例如大约10μl。
71.分离技术：所公开的方法、设备、系统和软件可以利用本领域技术人员已知的多种
分析物分离技术中的任何一种。例如，在一些实施例中，成像的分离可以是从分析物混合物中产生一种或多种分离的分析物馏分的电泳分离，诸如等电聚焦、毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、等速电泳、毛细管电动色谱、胶束电动色谱、流动平衡毛细管电泳、电场梯度聚焦、动态场梯度聚焦等。
72.毛细管等电聚焦(cief)：在一些实施例中，分离技术可以包括等电聚焦(ief)，例如毛细管等电聚焦(cief)。等电聚焦(或“电聚焦”)是通过分子等电点(pi)(即，它们具有净零电荷的ph)的差异来分离分子的技术。cief涉及将两性电解质(两性电解质)溶液添加到包含阳极或阴极的试剂容器之间的样本通道，以在分离电压跨其施加的分离通道(即，连接含电极的阱的流体通道)内生成ph梯度。两性电解质可以是溶液相或固定在通道壁的表面上。带负电的分子通过介质中的ph梯度朝着正极迁移，而带正电的分子朝着负极移动。在低于其等电点(pi)的ph范围内的蛋白质(或其它分子)将带正电，因此将朝着阴极(即带负电的电极)迁移。蛋白质的总净电荷将随着其通过增加ph的梯度迁移而减少(例如，由于羧基或其它带负电荷的官能团的质子化)，直到它到达与其pi对应的ph区域，此时它没有净电荷，因此迁移停止。因此，蛋白质的混合物基于其酸性和碱性残基的相对含量分离，并聚焦成尖锐的固定带，每个蛋白质定位在与其pi对应的ph梯度中的点处。该技术对于蛋白质具有极高的分辨率，不同之处在于单个电荷被分成分离的带。在一些实施例中，等电聚焦可以在已经永久或动态涂覆例如中性和亲水聚合物涂层的分离通道中执行，以消除电渗流(eof)。合适的涂层的示例包括但不限于氨基改性剂、羟丙基纤维素(hpc)和聚乙烯醇(pva)、(alcor bioseparations)、线性聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷(pvp)、甲基纤维素、羟乙基纤维素(hec)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、三乙胺、丙胺、吗啉、二乙醇胺、三乙醇胺、二氨基丙烷、乙二胺、壳聚糖、聚乙烯亚胺、尸胺、腐胺、亚精胺、二亚乙基三胺、四亚乙基五胺、纤维素、葡聚糖、聚环氧乙烷(peo)、醋酸纤维素、支链淀粉、乙基吡咯烷甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸二甲酯、二十二烷基二甲基溴化铵、brij 35、磺基甜菜碱、1,2-二月桂酰n-磷脂酰胆碱、1,4-二癸基-1,4-重氮二环[2,2,2]辛烷二溴化物、琼脂糖、聚(n羟乙基丙烯酰胺)、pole-323，超支化聚氨基酯，普鲁兰多糖，甘油，吸附涂层，共价涂层，动态涂层等。在一些实施例中，可以在分离介质中使用添加剂(诸如甲基纤维素、甘油、尿素、甲酰胺、表面活性剂(例如，triton-x 100、chaps、洋地黄皂苷))执行等电聚焦(例如，在未涂覆的分离通道中)以显著降低电渗流，允许更好的蛋白质溶解，并通过增加电解质的粘度来限制流体通道的毛细管内的扩散。
[0073]
如上所述，用于毛细管等电聚焦技术的ph梯度是通过使用两性电解质(即，含有酸性和碱性基团的两性分子并在一定的ph范围内主要以两性离子的形式存在)生成的。电解质溶液的位于分离通道阳极侧的部分被称为“阳极液”。电解质溶液的位于分离通道阴极侧的部分被称为“阴极液”。多种电解质可以用在所公开的方法和设备中，包括但不限于磷酸、氢氧化钠、氢氧化铵、谷氨酸、赖氨酸、甲酸、二甲胺、三乙胺、乙酸、哌啶、二乙胺和/或其任何组合。电解质可以任何合适的浓度使用，诸如0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％等。电解质的浓度可以至少是0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。电解质的浓度最多可以是90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％，0.0001％。可以使用一系列浓度的电解质，例如，0.1％-2％。两性
电解质可以选自任何商业或非商业载体两性电解质混合物(例如，servalyt ph 4-9(serva，heildelberg，德国)、beckman ph 3-10(beckman instruments，fullerton，ca，usa)、ampholine 3.5
–
9.5和pharmalyte 3
–
10(均来自法国orsay的general electric healthcare)、aeslytes(aes)、fluka两性电解质(thomas scientific，swedesboro，nj)、biolyte(bio-rad，hercules，ca))等。载体两性电解质混合物可以包括含有多个脂肪族氨基和羧酸酯基团的小分子(大约300
–
1000da)的混合物，这些基团具有紧密间隔的pi值和良好的缓冲能力。在存在施加的电场的情况下，载体两性电解质分成从阳极到阴极逐渐增加的平滑的线性或非线性ph梯度。
[0074]
各种pi标准中的任何一种都可以用在所公开的方法和设备中，用于计算分离的分析物峰的等电点。例如，可以使用cief应用中一般使用的pi标记，例如蛋白质pi标记和合成小分子pi标记。在一些情况下，蛋白质pi标记可能是具有普遍接受的pi值的特定蛋白质。在一些情况下，pi标记可以是可检测的，例如，经由成像。可以使用多种或组合的可商购获得的蛋白质pi标记或合成小分子pi标记，例如可从advanced electrophoresis solutions公司(cambridge，ontario，加拿大)获得的小分子pi标记、proteinsimple、由shimura设计的肽库和slais染料(alcor biosepartions)。
[0075]
移动技术：在一些实施例中，例如，在采用等电聚焦的那些情况下，分离的分析物带可以朝着与下游分析设备(例如，与质谱仪接口的电喷雾电离)接口的分离通道的末端移动。在一些实施例中，例如，在采用毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、等速电泳、毛细管电动色谱、胶束电动色谱、流动平衡毛细管电泳或通过差速分离分析物混合物的组分的任何其它分离技术的那些情况下，分离步骤可以被视为移动步骤。
[0076]
在一些实施例中，分析物带的移动可以通过向分离通道的一端施加流体动力压力来实现。在一些实施例中，分析物带的移动可以通过将分离通道定向在垂直位置来实现，从而可以采用重力。在一些实施例中，分析物带的移动可以使用eof辅助的移动来实现。在一些实施例中，分析物带的移动可以使用化学移动来实现。在一些实施例中，可以采用这些移动技术的任何组合。
[0077]
在一个实施例中，用于等电聚焦的分析物带的移动步骤包括化学移动。与基于压力的移动相比，化学移动具有通过克服由使用压力引起的流体动力抛物线流动剖面而表现出最小的带展宽的优点。可以通过将包含完全或部分聚焦的ph梯度的分离路径的入口或出口引入到导电溶液中来实现化学移动，该导电溶液具有与水合氢离子或羟基竞争用于电泳进入分离路径的离子。这通过破坏近似零净电荷状态导致ph梯度组分的逐步电动位移。在阴极化学移动的情况下，可以用含有竞争性阴离子的移动溶液代替提供的羟基，即，阴极电解液。竞争性阴离子可以造成分离路径中的ph下降，从而在ph梯度组分上产生正电荷，从而允许它们朝着阴极迁移。相应地，在供应水合氢离子的阳极移动中，阳极液溶液被含有竞争阳离子的流动溶液代替，这增加了分离中的ph值，从而使ph梯度组分带负电荷，从而允许它们朝着阳极迁移。在一些实施例中，可以使用酸性电解质(诸如甲酸、乙酸、碳酸、磷酸等)以任何合适的浓度发起阴极移动。在一些实施例中，可以使用碱性电解质(诸如氢氧化铵、二甲胺、二乙胺、哌啶、氢氧化钠等)来发起阳极移动。在一些实施例中，可以通过向阳极电解液或阴极电解液添加盐(诸如氯化钠或任何其它盐)来发起化学移动。
[0078]
在优选的实施例中，化学移动步骤可以在微流体设备内发起，该微流体设备被设
计为通过改变设备内的电场以将迁移电解质电泳到分离通道中来将cief与esi-ms集成。在一些实施例中，电场的改变可以通过连接或断开附接到一个或多个电源的一个或多个电极来实现，其中一个或多个电极定位在设备上的试剂阱中或与设备的流体通道集成。在一些实施例中，一个或多个电极的连接或断开可以使用计算机实现的方法和可编程开关来控制，使得移动步骤的定时和持续时间可以与分离步骤、电喷雾电离步骤和/或质谱数据收集协调。在一些实施例中，一个或多个电极与分离电路的断开可以通过使用电流控制并将电流设置为0μa来实现。
[0079]
毛细管区带电泳(cze)：在一些实施例中，分离技术可以包括毛细管区带电泳，一种在施加的电场中分离溶液中带电分析物的方法。带电分析物分子的净速度受分离系统表现出的电渗流(eof)迁移率μ
eof
和单个分析物的电泳迁移率μ
ep
的影响(取决于分子的尺寸、形状和电荷)，使得表现出不同尺寸、形状或电荷的分析物分子表现出不同的迁移速度并分离成带。
[0080]
毛细管凝胶电泳(cge)：在一些实施例中，分离技术可以包括毛细管凝胶电泳，一种基于大分子(例如，dna、rna和蛋白质)及其片段的尺寸和电荷对其分离和分析的方法。该方法包括使用填充凝胶的分离通道，其中凝胶在带电分析物分子在施加的电场中的电泳移动期间充当抗对流和/或筛分介质。凝胶用于抑制由于施加电场而造成的热对流，同时也充当阻碍分子的通过的筛分介质，从而导致不同尺寸或电荷的分子的迁移速度不同。
[0081]
毛细管等速电泳(citp)：在一些实施例中，分离技术可以包括毛细管等速电泳，这是一种分离带电分析物的方法，该方法使用合适维度或流体通道的毛细管内的两种电解质(称为前导电解质和终止电解质)的不连续系统。前导电解质可以包含具有最高电泳迁移率的离子，而终止电解质可以包含具有最低电泳迁移率的离子。待分离的分析物混合物(即，样本)可以夹在这两种电解质之间，并且施加电场导致毛细管或流体通道内的带电分析物分子分区到紧密相邻的区带中，以降低电泳迁移率。这些区带在所施加的电场中以恒定速度移动，使得可以利用检测器(例如，电导检测器、光电检测器或成像设备)来记录它们沿着分离通道的通过。与毛细管区带电泳不同，在使用毛细管等速电泳执行的单个分析中同时确定或检测阴离子和阳离子分析物是不可行的。
[0082]
毛细管电动色谱(cec)：在一些实施例中，分离技术可以包括毛细管电动色谱，一种基于液相色谱和电泳分离方法的组合来分离分析物混合物的方法。cec提供毛细管电泳(ce)的效率以及填充毛细管高效液相色谱(hplc)的选择性和样本容量。因为cec中使用的毛细管填充有hplc填料，所以cec中也提供了hplc中可用的各种分析物选择性。这些填料的高表面积使cec毛细管能够容纳相对大量的样本，从而使随后洗脱的分析物的检测比毛细管区带电泳(cze)中的检测任务更简单。
[0083]
胶束电动色谱法(mekc)：在一些实施例中，分离技术可以包括胶束电动色谱法，一种基于表面活性剂胶束(假固定相)和周围水性缓冲溶液(流动相)之间的差异分区来分离分析物混合物的方法。在mekc中，缓冲溶液可以含有浓度大于临界胶束浓度(cmc)的表面活性剂，使得表面活性剂单体与胶束平衡。mekc可以在开放的毛细管或流体通道中使用碱性条件执行，以生成强电渗流。在mekc应用中可以使用多种表面活性剂，例如，十二烷基硫酸钠(sds)。例如，sds的阴离子硫酸盐基团造成表面活性剂和胶束具有与强电渗流方向相反的电泳迁移率。因此，表面活性剂单体和胶束迁移缓慢，尽管它们的净移动仍在电渗流的方
向上，即，朝着阴极。在mekc分离期间，分析物可以分布在胶束的疏水内部和亲水缓冲溶液之间。不溶于胶束内部的亲水性分析物以电渗流速uo迁移，并将在缓冲液的保留时间tm处被检测到。完全溶解在胶束内的疏水性分析物以胶束速度uc迁移，并在最终洗脱时间tc处洗脱。
[0084]
流抗平衡毛细管电泳(fcce)：在一些实施例中，分离技术可以包括流抗平衡毛细管电泳，一种提高利用压力诱导的逆流主动延迟、停止或逆转分析物通过毛细管的电动迁移的毛细管电泳的效率和解析能力的方法。通过跨检测窗口来回延迟、停止或移动分析物，感兴趣的分析物可以有效地被限制在分离通道中比正常分离条件下更长的时间，从而提高分离的效率和解析能力。
[0085]
分离时间和分离分辨率：一般而言，实现完全分离所需的分离时间将根据所使用的具体分离技术和操作参数(例如，分离通道长度、微流体设备设计、缓冲液成分、施加的电压等)而变化。在一些实施例中，软件将基于分析物峰的基于成像的分析来确定分离何时完成，如共同未决的美国专利申请no.16/261,382中所述。在一些实施例中，分离时间可以在大约0.1分钟至大约30分钟的范围内。在一些实施例中，分离时间可以是至少0.1分钟、至少0.5分钟、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟，或至少30分钟。在一些实施例中，分离时间可以是至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟、至多5分钟、至多1分钟、至多0.5分钟，或最多0.1分钟。本段中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些实施例中，分离时间可以在从大约1分钟至大约20分钟的范围内。分离时间可以具有这个范围内的任何值，例如，大约7分钟。
[0086]
类似地，使用所公开的方法和设备实现的分离效率和分辨率可以根据所使用的特定分离技术和操作参数(例如，分离通道长度、微流体设备设计、缓冲液组合物、施加的电压等)而变化。在一些实施例中，实现的分离效率(例如，理论板的数量)可以在大约1,000至1,000,000的范围内。在一些情况下，分离效率可以是至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少60,000、至少70,000、至少80,000、至少90,000、至少100,000、至少200,000、至少300,000、至少400,000、至少500,000、至少600,000、至少700,000、至少800,000、至少900,000或至少1,000,000。效率的分离分辨率可以根据混合物中分析物的一种或多种特性(例如，分子质量、扩散率、电泳或等电迁移率等)而变化。
[0087]
微流体设备设计和制造：在所公开的方法、设备和系统的一些实施例中，分析物与混合物的分离以及可选地使用esi-ms对它们的后续分析可以使用被设计为集成一个或多个样本制备步骤(例如，过滤、预浓缩或提取步骤等)和/或分离步骤(例如，如上所述)与电喷雾电离步骤的微流体设备来执行。
[0088]
在一些实施例中，所公开的微流体设备可以包括一个或多个样本或试剂端口(也称为入口端口、样本阱或试剂阱)、一个或多个废物端口(也称为出口端口)、将所述入口和出口彼此连接或与中间流体通道(例如，分离通道)连接的一个或多个流体通道，或其任何组合。在一些实施例中，所公开的微流体设备还可以包括一个或多个反应室或混合室、一个或多个微型制造的阀、一个或多个微型制造泵、一个或多个排气结构、一个或多个膜(例如，过滤膜)，一个或多个微柱结构(例如，填充有色谱分离介质的流体通道或改进的流体通
道)，或其任何组合。
[0089]
在优选实施例中，所公开的微流体设备结合了电喷雾孔口或电喷雾尖端以提供与质谱仪的电喷雾电离界面。在共同未决的美国专利申请公开no.u.s.2017/0176386a1和u.s.2018/0003674a1中描述了这种接口的一个非限制性示例。图1a和1b图示了微流体设备的一个非限制性示例，该设备被设计为执行等电聚焦，然后进行esi-ms表征。图1a和1b中所示的流体通道网络由一块钠钙玻璃制成，使用标准光刻蚀刻技术，其具有280nm光的非常低的透射率。该设备包括连接到入口412的样本入口通道414、富集通道418和移动通道438。阳极416与阳极液阱426电接触。分离(或富集)通道418的深度与玻璃层402的厚度相同，即，富集通道418从玻璃板402的顶部到底部一直穿过。设备400可以被部署在设备400一侧的光源照亮，并由部署在设备400的相对侧的检测器成像。因为基板402是不透明的，但富集通道418定义了光学狭缝，所以基板402可以阻挡不通过富集通道418的光，从而阻挡杂散光并提高成像过程的分辨率。玻璃层402被夹在两个熔融的石英板之间，这两个熔融的石英板对280nm的光是透射的(例如，透明的)。顶板包含用于仪器和用户与通道网络接口的通孔，而底板是实心的。三块板在520℃下键合在一起达30分钟。入口和出口管道由键合到通道网络的切割毛细管(100μm id，polymicro)制成。该设备在执行蛋白质等电聚焦和随后的质谱表征中的操作将在下面的示例1中描述。
[0090]
本领域技术人员已知的多种流体致动机构中的任何一种都可以用于控制样本和试剂通过设备的流体流。用于所公开的方法、设备和系统的合适的流体致动机构的示例包括但不限于向一个或多个入口端口或出口端口施加正压或负压、重力或离心力、电动力、电润湿力，或其任何组合。在一些实施例中，可以直接施加正压或负压，例如，通过使用耦合到入口和/或出口端口的机械致动器或活塞以致动样本或试剂流过流体通道。在一些实施例中，机械致动器或活塞可以在用于密封入口和/或出口端口的柔性膜或隔膜上施加力。在一些实施例中，可以间接施加正压或负压，例如，通过使用与一个或多个入口和/或出口连接的加压气体管线或真空管线。在一些实施例中，与一个或多个入口和/或出口端口连接的泵(例如，可编程注射泵、hplc泵或蠕动泵)可以被用于驱动流体流。在一些实施例中，可以通过使用电场和控制设备内的表面特性来施加电动力和/或电润湿力。电场可以借助于插入一个或多个入口和/或出口端口中的电极，或借助于集成在设备内的一个或多个流体通道中的电极来施加。电极可以与一个或多个dc或ac电源连接，以控制设备内的电压和/或电流。
[0091]
一般而言，所公开的微流体设备的入口端口、出口端口、流体通道或其它组件，包括设备的主体，可以使用多种材料中的任何一种来制造，包括但不限于玻璃、熔融石英、硅、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、环状烯烃共聚物(coc)或环状烯烃聚合物(cop)、聚二甲基硅氧烷(pdms)或其它弹性体材料。合适的制造技术一般将取决于材料的选择，反之亦然。示例包括但不限于cnc加工、光刻和化学蚀刻、激光烧蚀、注塑成型、热压印、模切、3d打印等。在一些实施例中，微流体设备可以包括分层结构，例如，其中包括流体通道的流体层夹在上层和/或下层之间以密封通道。上层和/或下层可以包括与射流层中的流体通道对准的开口以创建入口和/或出口端口等。两个或更多个设备层可以夹在一起以形成可以拆卸或可以永久键合的设备。合适的键合技术一般取决于用于制造层的材料的选择。示例包括但不限于阳极键合、热键合、激光焊接或使用可固化粘合剂(例如，热或光可固化粘合剂)。
[0092]
在一些实施例中，微流体设备内的入口端口、出口端口或流体通道中的所有或一部分可以包括用于修改电渗流特性的表面涂层(例如，hpc或pva涂层)和/或入口端口、出口端口或流体通道壁的疏水性/亲水性特性(例如，聚乙二醇(peg)涂层)。
[0093]
所公开的设备的入口和/或出口端口可以制造成各种形状和尺寸。适当的入口和/或出口几何形状包括但不限于球形、圆柱形、椭圆形、立方体、圆锥形、半球形、矩形或多面体(例如，由几个平面组成的三维几何形状，例如长方体、六棱柱、八棱柱、倒三角锥、倒四棱锥、倒五棱锥、倒六棱锥或倒截棱锥)或其任何组合。
[0094]
入口和/或出口端口维度可以根据平均直径和深度来表征。如本文所使用的，入口或出口端口的平均直径是指可以内接在入口和/或出口端口几何形状的平面横截面内的最大圆。在本公开的一些实施例中，入口和/或出口端口的平均直径可以在大约0.1mm至大约10mm的范围内。在一些实施例中，入口和/或出口端口的平均直径可以是至少0.5mm、至少1mm、至少2mm、至少4mm、至少8mm或至少10mm。在一些实施例中，平均直径可以是至多10mm、至多8mm、至多6mm、至多4mm、至多2mm、至多1mm或至多0.5mm。本段中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开内容内的范围，例如，在一些实施例中，平均直径可以在从大约2mm至大约8mm的范围内。本领域技术人员将认识到入口和/或出口端口的平均直径具有这个范围内的任何值，例如，大约5.5mm。
[0095]
在一些实施例中，入口和/或出口端口(例如，样本或试剂阱)的深度可以在大约5μm至大约500μm的范围内。在一些实施例中，深度可以是至少5μm、至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm，或至少500μm。在一些实施例中，深度可以是至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多50μm、至多25μm、至多10μm或至多5μm。本段中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些实施例中，入口和/或出口端口的深度可以在大约50μm至大约200μm的范围内。本领域技术人员将认识到深度可以具有这个范围内的任何值，例如，大约130μm。在一些实施例中，入口和/或出口端口(例如，样本或试剂阱)的深度可以在从大约500μm至大约50mm的范围内。在一些实施例中，深度可以是至少1mm、至少5mm、至少10mm、至少15mm、至少20mm或至少50mm。在一些实施例中，深度可以是至多50mm、至多20mm、至多15mm、至多10mm、至多5mm或至多1mm。本段中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些实施例中，入口和/或出口端口的深度可以在从大约50μm至大约5mm的范围内。
[0096]
在一些实施例中，所公开的设备的流体通道可以具有多种横截面几何形状中的任何一种，诸如正方形、矩形、圆形等。一般而言，流体通道的横截面几何形状将取决于用于创建它们的制造技术，反之亦然。在一些实施例中，流体通道的横截面维度(例如，非矩形横截面的流体通道的高度、宽度或平均直径，其中平均直径被定义为可以内接在流体通道的横截面几何形状内的最大圆的直径)可以在从大约5μm至大约500μm的范围内。在一些实施例中，流体通道的维度可以是至少5μm、至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm或至少1000μm。在一些实施例中，流体通道的尺寸可以是至多1000μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多50μm、至多25μm、至多10μm、或至多5μm。本段中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些实施例中，流体通道的维度可以在从大约75μm
至大约300μm的范围内。本领域技术人员将认识到，该维度可以具有这个范围内的任何值，例如，大约95μm。在一些实施例中，流体通道的深度可以等于设备的入口和/或出口端口的深度。
[0097]
成像技术：在所公开的方法和设备的一些实施例中，分析物分离步骤和/或移动步骤的成像可以使用光学检测技术来执行，诸如紫外(uv)光吸光度、可见光吸光度、荧光、傅立叶变换红外光谱、傅立叶变换近红外光谱、raman光谱、光学光谱等。在一些实施例中，分离(或富集)通道的全部或一部分、连接分离通道的末端和下游分析仪器或电喷雾孔口或尖端、电喷雾孔口或尖端本身的接头或连接通道，或其任何组合可以被成像。在一些实施例中，分离(或富集)通道可以是毛细管的内腔。在一些实施例中，分离(或富集)通道可以是微流体设备内的流体通道。
[0098]
用于检测分离的分析物带的(一个或多个)波长范围通常将取决于成像技术的选择以及制造设备或其部分的(一种或多种)材料。例如，在uv光吸光度被用于对分离通道的全部或一部分或微流体设备的其它部分进行成像的情况下，在大约220nm(由于肽键的天然吸光度)和/或大约280nm(由于芳香族氨基酸残基的天然吸光度)的检测可以允许人们在分离和/或移动期间可视化蛋白质带，前提是该设备的至少一部分(例如，分离通道)在这些波长处对光是透明的。在一些实施例中，待经由esi-ms分离和表征的分析物可以在分离之前用例如荧光团、化学发光标签或其它合适的标签进行加标签，使得它们可以使用荧光成像或其它合适的成像技术进行成像。在一些实施例中，例如，其中分析物包括由商业制造过程产生的蛋白质，蛋白质可以被基因工程改造以掺入绿色荧光蛋白(gfp)结构域或其变体，从而可以使用荧光对它们进行成像。在一些实施例中，可以对蛋白质进行标记或加标签。可以配置加标签的蛋白质，使得标签不会干扰或扰乱所选择的分离技术所基于的分析物特性。在一些实施例中，不必为成像进行更改，并且uv成像的荧光可以在天然蛋白质、肽或其它分析物上执行。
[0099]
为了实现所公开的方法、设备和系统的目的，可以使用多种成像系统组件中的任何一个。示例包括但不限于一种或多种光源(例如，发光二极管(led)、二极管激光器、光纤激光器、气体激光器、卤素灯、弧光灯等)、聚光透镜、物镜、反射镜、滤波器、分束器、棱镜、图像传感器(例如，ccd图像传感器或相机、cmos图像传感器或相机、二极管阵列、热成像传感器、ftir等)等，或其任何组合。取决于所使用的成像模式，光源和图像传感器可以定位在微流体设备的相对侧，例如，以便可以获取基于吸光度的图像。在一些实施例中，例如，光源和图像传感器可以定位在微流体设备的同一侧，从而可以获取落射荧光图像。
[0100]
图像可以在分离、移动和/或电喷雾步骤期间连续获取，或者可以以随机或指定的时间间隔获取。在一些实施例中，连续地、以随机时间间隔或以指定时间间隔获取一系列一个或多个图像。在一些实施例中，一系列的一个或多个图像可以包括视频图像。
[0101]
用于在电喷雾之前确定蛋白质等电点的pi标记的成像：在一些实施例中，如上所述，两个或更多个pi标记在包括已经历cief的分离的分析物混合物的分离通道的图像中的位置可以被用于确定一个或多个个体分析物峰(例如，蛋白质分析物峰)的等电点。在一些实施例中，一个或多个分析物峰的等电点基于局部ph与沿着分离通道的位置之间的假设的线性关系从两个或更多个pi标记的位置计算。在一些实施例中，用于一个或多个分析物峰的等电点基于描述局部ph与沿着分离通道的位置的关系的非线性拟合函数(例如，非线性
多项式)从三个或更多个pi标记的位置计算。在一些实施例中，用于一种或多种分析物的等电点是基于2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个pi标准的位置计算的，这些pi标准是从分离通道的图像确定的。
[0102]
在一些实施例中，用于确定两个或更多个pi标记的位置的图像在分析物混合物被分离时被获取，并且用于每个分析物带的pi的计算随着分离的继续而被迭代更新。在一些实施例中，用于确定两个或更多个pi标记的位置的图像是在分离完成之后并且在发起移动步骤之前获取的。在一些实施例中，用于确定两个或更多个pi标记的位置的图像是在分离的混合物被移动并通过电喷雾尖端或孔口排出时获取的。在一些实施例中，用于确定两个或更多个pi标记的位置的图像是在分离的混合物通过将分离通道连接到下游分析仪器的流体通道移动和排出时获取的。
[0103]
在一些实施例中，用于确定分离混合物中两个或更多个pi标记和(一个或多个)分析物带的位置的图像是使用计算机实现的方法(例如，软件包)获取的。在一些实施例中，两个或更多个pi标记以及(一个或多个)分析物带的位置是使用包括自动图像处理的计算机实现的方法来确定的。在一些实施例中，计算机实现的方法还包括基于从自动化图像处理中得出的位置数据来执行用于一个或多个分析物带的等电点的计算。
[0104]
图2提供了计算机实现的方法的示例过程流程图，该方法获取分离通道(或微流体设备的其它部分)的(一个或多个)图像，确定(一个或多个)图像中pi标记和分析物带的位置(即，在分离步骤包括cief的情况下)，并计算分离的分析物的混合物中一个或多个分析物带的pi。在一些实施例中，计算机实现的方法可以包括控制一系列一个或多个图像的获取，然后对这些图像进行处理以识别pi标记的位置和分离的分析物带。下面将更详细地讨论合适的自动图像处理算法的示例。在一些实施例中，关于pi标记的预测位置(例如，从仅包含pi标记的“对照”样本的图像确定的pi标记的位置)的预定知识可以被用于区分与pi标记对应的带和与分离的分析物对应的带。在一些实施例中，可以在不同波长或使用与用于获取分离的分析物带的图像的成像模式不同的成像模式来获取pi标记的图像。如图2中所示，如果图像处理步骤无法确定已知数量的pi标记和/或分离的分析物带的位置，那么系统可以被指示获取(一个或多个)新图像，以便图像处理步骤可以重复。一旦确定了pi标记的位置和分离的分析物带，pi标记的位置的数据就将拟合到用户选择的ph梯度的模型(例如，线性或非线性模型)并且结果得到的局部ph与沿着分离通道的位置之间的拟合的关系然后被用于计算一个或多个分析物带的等电点。
[0105]
在一些实施例中，计算机实现的方法可以是迭代过程，其中检测pi标记和分析物带位置、将位置数据拟合到ph梯度模型以及计算一个或多个分析物带的等电点的步骤被重复，以便后者不断地被更新和精炼(例如，通过几次确定的求平均)。在一些实施例中，可以在足够短的时间内完成包括图像获取和处理、检测pi标记和分析物带位置、将pi标记位置数据拟合到ph梯度模型以及计算一个或多个分析物带的等电点的步骤的循环，等电点的计算可以至少以0.01hz、0.1hz、0.2hz、0.3hz、0.4hz、0.5hz、0.6hz、0.7hz、0.8hz、0.9hz、1hz、10hz、100hz或1000hz或任何其它相关速率(例如，至少为nyquist速率的速率)被更新和精炼。
[0106]
成像分离和移动：在一些实施例中，可以监视峰通过分离通道的移动(例如，在分离期间、在移动期间等)。成像可以是uv成像、荧光成像、透射光成像或另一种成像模式。在
一些实施例中，可以以定义的速率记录分离和移动的图像。例如，成像速率可以是每分钟一个图像、每30秒一个图像、每10秒一个图像、每5秒一个图像、每秒一个图像、每毫秒一个图像等。在一些实施例中，各个图像可以组合为“电影”中的单个帧，示出峰形成和移动。图9a-f示出了可以被组合以生成电影的图像的子集。在一些实施例中，这个电影可以被保存为gif、avi、mov、mp4或能够保存数字视频数据的任何其它数字格式。在一些实施例中，成像可以实时地执行，例如，在执行分离时、在执行移动时、在执行电喷雾时等。
[0107]
在一些实施例中，诸如图17b中所示的动态热图可以被用于显示一系列图像(例如，在分离通道中执行的分离和/或移动的时间序列成像数据集，其中该系列的每个图像与不同的时间点对应)。作为示例，在图17b中，不是一起显示峰的图形表示(例如，在单个曲线上叠加根据沿着分离通道的长度(即，像素位置)的多个强度或吸光度曲线)，峰被表示为沿着成像的通道的长度的成像的分析物带(每个都包含强度或吸光度测量)并被根据时间绘制。图17b中图像(热图)的每一行都显示出在聚焦和移动期间单个时间点处的分析物带的位置。例如，线1704示出了动态热图中的示例像素行；每一行与分离通道的图像对应并且可以被用于生成(或可以从其生成)给定时间点的电泳图(例如，如图17a中所示)。图17a中的分析物峰1702由图17b中的亮像素(也标记为1702)表示。对于图17a中的每个分析物峰，图17b显示了分析物峰迁移的时间过程。例如，在ief分离期间，分析物(或多种分析物)可以从通道的两端迁移到分析物的(或多种分析物的)一个或多个等电点。在(一个或多个)等电点处，当聚焦完成时(例如，在与线1704对应的时间)，分析物可以被富集，从而产生明亮的峰(像素1702)。另外，在移动开始时(在这种情况下，图17b中线1704上方的部分)，可以发生每个峰朝着芯片孔口和质谱仪的加速迁移。时间序列的相继图像垂直堆叠，因此图17b的列轴(y轴)表示时间，而x轴表示每个时间点的带的空间分辨率(例如，分析物的位置根据沿着分离通道的长度的位置)。在一些实施例中，带的相对强度可以由灰度或色标表示。在一些实施例中，增加或减少色阶或灰度可以与增加的信号、强度或吸光度相关。在一些实施例中，带的速度可以通过测量带在经修饰的热图中随时间进展的斜率来确定。在一些实施例中，经修饰的热图可以用于显示来自聚焦、移动或两者的成像数据。分离数据的这种显示在比较或表征分离和/或移动的逐轮可变性、比较分离和移动反应(例如，完成分离和移动反应的时间尺度、分离期间实现的分离分辨率、移动期间维持的分离分辨率等)、确定分离何时完成、监视或检测分离通道中的故障、监视电渗流的存在和/或确定分离性能特点(例如，分离分辨率、ph梯度的线性等)方面可以特别有用。
[0108]
在一些实施例中，时间序列成像数据可以绘制在三维或三轴曲线图上，如图19中所示。曲线图的一个轴可以表示距离(例如，沿着分离通道的长度的物理距离或像素位置)，并且一个轴可以表示时间。在一些情况下，第三轴可以被用于表示信号强度、强度或吸光度，其可以可替代地或附加地由色阶或灰度表示。在一些实施例中，x轴可以被用于表示距离，y轴表示时间，并且z轴表示信号或吸光度。将认识到的是，轴可以被用于表示任何参数(例如，沿着通道的距离或位置、pi、强度或吸光度、时间等)。
[0109]
成像数据和数据绘制(或其它图像处理)可以在完成分离和质谱分析之后执行，或者在一些情况下，在执行分离、移动和质谱分析的同时执行。例如，计算机实现的方法或软件可以被配置为接收所获得的成像数据，处理成像数据(例如，以获得根据通道长度的强度图)并绘制ief数据(例如，在3维图或热图中迭代或增量绘制)。
[0110]
如本文所述，计算机实现的方法或软件可以被用于以指定的扫描速率收集质谱。在一些实施例中，计算机实现的方法可以被用于以色谱图的形式汇总质谱数据。例如，可以生成曲线，其中x轴表示时间，并且y轴表示质谱数据中的信号的总和(例如，总离子计数)，诸如图18中的线迹线1834。y轴可以表示个体质谱中所有信号的总和(总离子色谱图)、特定基峰或提取的离子的信号总和(基峰色谱图、提取的离子色谱图)或任何其它子集质谱数据。
[0111]
分析物带的成像以确定速度：在一些实施例中，如上所述，一个或多个分析物带的位置可以从分离通道(或微流体设备的其它部分)的一系列两个或更多个图像中确定，使得用于一个或多个分析物带的速度可以根据其在两个或更多个图像中的相对位置的差异以及两个或更多个图像的获取时间之间的已知时间间隔来计算。在一些实施例中，可以在执行分离步骤的同时获取分离通道的至少一部分的两个或更多个图像。在一些实施例中，可以在移动步骤期间获取两个或更多个图像。在一些实施例中，可以在分离的样本通过将分离通道的末端连接到下游分析仪器的流体通道排出时获取两个或更多个图像。在一些实施例中，可以在分离的样本通过电喷雾尖端或孔口排出以形成taylor锥的同时获取两个或更多个图像。在一些实施例中，为一个或多个分析物带确定的速度可以被用于计算给定分析物带离开分离通道的时间。在一些实施例中，例如，当存在将分离通道的末端与出口端口(例如，电喷雾孔口或尖端)连接的一个或多个互连流体接头或流体通道时，为一个或多个分析物带确定的速度可以被用于计算给定分析物带到达出口端口并离开设备的时间。在一些实施例中，为一个或多个分析物带确定的速度可以被用于计算给定分析物带离开电喷雾尖端或电喷雾孔并进入形成在电喷雾尖端或孔口与质谱仪的入口之间的taylor锥的时间。
[0112]
在一些实施例中，用于确定一个或多个分析物带的速度的图像序列可以使用计算机实现的方法(例如，软件包)来获取。在一些实施例中，一个或多个分析物带的速度是使用包括自动化图像处理的计算机实现的方法来确定的。在一些实施例中，计算机实现的方法还包括执行给定分析物带将退出分离通道的时间的计算。在一些实施例中，计算机实现的方法还包括执行给定分析物带将到达出口端口并退出设备的时间的计算。在一些实施例中，计算机实现的方法还包括执行给定分析物带将退出电喷雾尖端或电喷雾孔口并进入在电喷雾尖端或孔口与质谱仪入口之间形成的taylor锥的时间的计算。在一些实施例中，为一个或多个分析物带确定的(一个或多个)退出时间被用于将特定分析物带与质谱数据或使用其它分析仪器收集的数据相关联。
[0113]
图3提供了计算机实现的方法的另一个示例过程流程图，该方法用于获取分离通道(或微流体设备的其它部分)的(一个或多个)图像，确定一个或多个分析物带的速度，并在给定分析物带到达设备中指定点(例如，分离通道的末端、分离通道和第二流体通道之间的接头点、设备的出口端口或电喷雾尖端或孔口)的时间。在一些实施例中，计算机实现的方法可以包括控制一系列一个或多个图像的获取，然后处理这些图像以识别分离的分析物带的位置。下面将更详细地讨论合适的自动图像处理算法的示例。如图3中所示，如果图像处理步骤未能确定分离的分析物带的位置，那么可以指示系统获取(一个或多个)新图像，从而可以重复图像处理步骤。一旦确定了一系列两个或更多个图像的分离的分析物带的位置，就基于它们在两个或更多个图像中的相对位置和两个或更多个图像的获取时间之间的(一个或多个)已知时间间隔来计算一个或多个分析物峰的速度。在一些实施例中，在一系
列图像中从一个图像到下一个图像的一个或多个分析物带的跟踪可以被用于区分几个分离的分析物带，并精炼速度计算(例如，通过对从系列中的几对图像计算的速度值求平均)。在一些实施例中，可以使用选择的成像模式检测的pi标记或其它内部标准可以被用作“速度标准”。如此确定的分析物带速度可以被用于计算给定带将到达设备中用户指定点(例如，分离通道的出口端口、设备内的特定流体接头、设备的出口端口、分析物进入taylor锥的电喷雾电离尖端或孔口等)的时间。
[0114]
在一些实施例中，计算机实现的方法可以是迭代过程，其中重复检测分析物带位置、确定分析物带速度和计算退出时间的步骤，使得退出时间预测是连续的更新并进一步改进化学分离数据与质谱数据(或其它类型的下游分析数据)的相关性。在一些实施例中，可以在足够短的时间内完成包括图像获取和处理、速度计算和(一个或多个)退出时间预测的步骤的循环，使得(一个或多个)退出时间预测可以以至少0.01hz、0.1hz、0.2hz、0.3hz、0.4hz、0.5hz、0.6hz、0.7hz、0.8hz、0.9hz、1hz、10hz、100hz或1000hz或任何其它相关速率(例如，以至少nyquist速率的速率)被更新。
[0115]
在一些实施例(例如，包括cief步骤的实施例)中，本公开的计算机实现的方法可以执行精确等电点的基于成像的确定和分离的分析物带的速度的基于成像的确定。
[0116]
分离数据与质谱数据的相关性：在一些实施例中，上述用于对等电聚焦的分析物带的准确等电点执行基于成像的确定的计算机实现的方法使人们能够将等电点数据与质谱数据(或其它分析数据)中的特定m/z峰相关联，从而改进数据集的信息内容(即使对于单次运行实验)并允许对分析物样本的更定量表征。计算机实现的方法可以被配置为接收(例如，使用处理器)ief数据(例如，根据沿着分离通道的长度的多个强度或吸光度测量，或针对特定峰的pi数据)和ms数据(例如，总离子色谱图、根据质量的多个离子测量等)。
[0117]
在一些实施例中，成像的分析物峰可以与质谱仪数据相关，以产生关于分析物峰中的一种或多种分析物的质量和电荷(或等电点)的信息。例如，在分离期间，可以以任何有用的成像速率获取分离通道的一个或多个图像，从而生成时间序列成像数据集。时间序列成像数据集可以包括分离通道的多个图像，其中每个图像与不同的时间点对应。在一些情况下，可以将ief数据(例如，时间序列的每个图像)绘制为电泳图，其可以示出根据沿着分离通道的长度的位置的信号、强度或吸光度。在一些情况下，如本文别处所述，ief数据可以用于生成热图或3维图(参见例如图17a-b和图19)。
[0118]
ief数据可以与ms数据一起绘制(例如，使用一个或多个处理器)。例如，图18中的线迹线1832示出了nist单克隆抗体分离的ief电泳图。线迹线1832的x轴示出空间分辨率或沿着分离通道的长度的位置(可以以距离、像素数或等电点为单位显示)，并且线迹线1832的y轴示出相对信号强度(例如，吸光度、强度等)。如图18中所示，ief电泳图绘制在表示ms数据的一个或多个色谱图上。例如，通过将ms数据(例如，总离子色谱图1834)的时间轴与线迹线1832中的等电聚焦峰对准，可以用ief电泳图绘制一个或多个ms扫描、平均的扫描、经处理的数据或去卷积的数据。在一个这样的示例中，线迹线1836表示由质谱仪以相等的时间间隔收集的解卷积的质谱的一个示例，该等时间间隔与总离子色谱图1834的时间片段和ief电泳图1832的pi片段对应。在一些情况下，解卷积的质谱可以从总离子色谱图1834解卷积或以其它方式生成。每条线迹线1836与质谱总离子色谱图1834和ief电泳图1832的x轴对准。线迹线1836示出了每个解卷积的质谱(沿着x轴)的质量(由垂直的y轴表示)和信号强度
(例如，离子计数)。每条质谱线迹线1836可以以两个参考标尺示出—较暗的线被归一化为跨所有质谱的最高信号，而较浅的迹线在每个单独的质谱中被归一化。这样的曲线提供了信号强度的显示，但也允许在线迹线1836中显示低信号。
[0119]
在一些实施例中，将ief数据和ms数据相关联在识别或区分具有相似特性(例如，具有相同电荷或等电点，或具有相同质量)和/或具有不同特性的一种或多种分析物种类时可以特别有用。例如，可以在质谱仪数据中识别具有不同质量的两种分子。两种分子可以具有不同的等电点(pi)并聚焦在ief中ph梯度的不同区域中，或者两种分子可以具有相同的等电点(pi)并聚焦在ief中ph梯度的相同区域中。在两种分子具有相同pi和不同质量的情况下，ief和ms数据的相关性可以被用于区分两种分子(例如，将它们识别为不同的种类或同种型)。
[0120]
举例来说，具有相同pi和不同质量(或者可替代地，相同质量但不同pi)的两种分子可以是两种蛋白质同种型，例如，其中pi或质量的差异由以下原因造成的同种型：翻译后修饰、翻译错误(例如，不正确的氨基酸添加、折叠、二硫键重排或其它翻译修饰)、转录或编码在dna序列中。在这种示例中，可以通过检查质量和电荷或pi差异(或相似性)来识别正确的翻译后修饰。例如，分离通道内的分析物峰(例如，ief分析物峰)可以包括具有相同等电点但质量不同的一种或多种分析物种类。如本文所述，可以通过对分析物峰执行ms来辨别不同的质量。通过使用pi和质量信息两者，可以消除偏离特定同种型的已知或预期pi和质量的某些同种型。因而，可以使用质量的差异来识别一种或多种分析物种类，即使它们具有相同的等电点。可替代地或相结合地，可以使用pi的差异来识别一种或多种分析物种类，即使它们具有相同的质量。
[0121]
ief数据和ms数据(例如，根据质量的总离子色谱图和时间序列离子测量)的覆盖对通过将pi映射到一种或多种分析物种类的质量来识别蛋白质同种型可以是有用的。例如，参考图18，可以将ief数据(例如，ief电泳图1832)映射到总离子色谱图1834。总离子色谱图1834的每个点(例如，时间间隔)可以被去卷积以生成线迹线1836，其示出质量分布和相对强度。因而，对于总离子色谱图1834中的每个时间间隔，可以确定对应的去卷积质量分布数据和等电点。类似地，对于每个等电点，可以获得对应的质量分布。
[0122]
例如，图20示出了来自nist单克隆抗体分析的示例等电聚焦和质谱数据。图20面板a示出了插图中电荷变体的等电聚焦数据(标记为酸性1、酸性2、主要、碱性1和碱性2)，而较大的曲线图示出了与插图中的电荷变体对应的引入到质谱仪的电荷变体的质谱基峰色谱图。图20面板b示出了解卷积质量数据，其显示每个时间间隔的基峰色谱样本的质量指派，每个时间间隔可以映射回沿着分离通道的长度的位置(例如，从酸性结束到碱性结束)。图20面板b中峰分布的差异示出了在等电聚焦过程中分离的不同电荷变体峰中种类的质量和相对丰度的差异。
[0123]
ief数据和ms数据可以被用于指派翻译后修饰。图21面板a示出了翻译后修饰以及修饰所预期的电荷和质量改变的示例的列表。这些值可以从公开可用的来源(例如，已发表的数据、蛋白质数据库等)获得，或者可以根据经验得出。在示例中，在图21面板a中，糖化和半乳糖(糖基化)修饰都会导致分子质量增加162道尔顿。但是，糖化事件可以与糖基化事件区分开来，因为糖化会使得分子变得更加酸性并移至ief中的较低等电点或cze中的不同洗脱时间。图21面板b中概述了这个示例和其它示例，但蛋白质分析物中可能有修饰的许多其
它组合。例如，翻译后修饰可以是羟基化、甲基化、脂化、乙酰化、二硫键、苏甲酰化、泛素化、糖基化、糖化、氨基酸添加或去除、酰胺化、脱酰胺化、异构化、氧化、岩藻糖基化、唾液酸化、磷酸化或其组合，或其它翻译后修饰。已知的翻译后修饰特性(例如，电荷、质量、pi改变等)可以从公开可用的来源(例如，uniprot、blast或其它蛋白质数据库)获得。
[0124]
图22面板a示出了从碱性2、碱性1和主峰(来自ief分离的分析物峰)的质谱分析计算出的解卷积的质量。碱性1和主要中的峰示出每个分子连续增加162道尔顿，指示连续的糖基化步骤导致质量差异但没有电荷(或pi)差异。如图23面板b中所示，不同质量分子的相对丰度在碱性1和主要之间没有变化，只有图22面板a中示出的128道尔顿偏移量，指示碱性1峰中的分子上存在附加的赖氨酸。同样，在图22面板b中，当比较从主要、酸性1和酸性2峰(来自ief分离的分析物峰)的质谱分析计算出的解卷积的质量时，我们可以在每个电荷变体峰中看到分子中一致的162道尔顿移位系列。但是，当主要酸性1和酸性2剖面覆盖在图23面板a中时，可以观察到酸性电荷变体峰中较大质量的相对增加，这指示除了碱性1和主要峰中看到的糖基化序列之外的糖化。
[0125]
计算机实现的方法：如本文所述，一种或多种数据呈现和分析算法可以使用计算机实现的方法来实现。计算机算法可以用于执行多种功能，包括但不限于：接收ief和ms数据、转换或处理数据、生成数据的曲线图或曲线、覆盖ief和ms数据，以及分析ief数据，例如，评估电荷和质量改变以正确指派翻译后修饰。在一些实施例中，可以使用神经网络或其它人工智能算法来评估电荷和质量变化或相似性，以便正确指派翻译后修饰。在一些情况下，计算机实现的方法可以被配置为存储多个参考值(例如，针对不同翻译后修饰的预期或已知的电荷和/或质量改变)。这些存储的参考值随后可以被一个或多个处理器用于匹配ief和ms数据以确定或识别分析物峰中的翻译后修饰。
[0126]
一种或多种计算机实现的方法可以被配置为自动执行一个或多个功能(例如，无需人工交互)。例如，一种或多种计算机实现的方法可以是用于获取数据(例如，执行成像)、接收数据(例如，分离、移动和/或ms数据)的软件包的一部分，处理数据、显示数据等。数据的处理或呈现可以与成像基本同时执行，或者可以在成像完成之后发生。类似地，可以在esi-ms期间或在esi-ms之后执行数据的处理或呈现。例如，翻译后修饰的确定或指派可以在获取esi-ms数据的1秒内、1分钟内、10分钟内、1小时内等执行。
[0127]
在一些实施例中，上述用于使用图像派生的数据来计算速度和预测分离的分析物带的退出时间(使用多种不同分离技术中的任一种)的计算机实现的方法使得能够改进化学分离数据(例如，保留时间、电泳迁移率、等电点等)与质谱数据(或其它分析数据)中的特定m/z峰之间的时间相关性，从而改进数据集的信息内容(即使对于单个运行实验)并允许对不同样本运行收集的数据、不同样本或在不同仪器上收集的数据进行更定量的比较，因为能够校正分离时间的实验间或仪器间差异。
[0128]
因此，所公开的方法、设备和系统对于各种代谢组学、蛋白质组学和药物开发或制造应用可以特别有利。将认识到的是，虽然上述示例涉及耦合到质谱仪的等电聚焦，但在引入质谱仪之前执行的分离可以是电泳、色谱或其它分离，如本文别处所述。
[0129]
质谱和电喷雾电离：在一些实施例中，本公开的方法、设备和系统可以被配置用于执行分离的分析物混合物的电喷雾电离并将其注入质谱仪。质谱(ms)是一种分析技术，它通过电离并基于质荷比(m/z)对生成的离子进行分类来测量样本中分析物分子的“质量”。
与前期液相或气相样本分离系统相结合，质谱提供了可用于分析包含多种低丰度分析物的复杂样本的最有效手段之一，例如在生物样本中常见的。
[0130]
所有质谱仪都要求离子在引入质量分析仪之前处于气相状态。已经开发出多种样本电离模式，包括但不限于基质辅助激光解吸和电离(maldi)和电喷雾电离(esi)。在maldi技术中，样本(例如，包括蛋白质的混合物的生物样本)与能量吸收基质(eam)(诸如芥子酸或-氰基-4-羟基肉桂酸)混合并结晶到金属板上。表面增强的激光解吸和电离(seldi)是该技术的常见变体，它在金属板上结合附加的表面化学物质以促进某些类别的蛋白质的特异性结合。将板插入真空室，然后用来自氮激光的光脉冲撞击基质晶体。被基质分子吸收的能量被转移到蛋白质，使它们解吸、电离，并在气相中产生一团离子，这些离子在电场的存在下被加速并被吸入飞行管，在那里它们漂移直到它们撞上一个记录飞行时间的检测器。飞行时间进而可以被用于计算电离的种类的m/z比。在所公开的设备的一些实施例中，设备的出口端口可以包括毛细管或用于将分离的分析物带(或其部分)沉积到maldi板上以便为质谱分析做准备的其它特征，例如关联用于特定分析物带的等电点与maldi质谱仪数据。
[0131]
电喷雾电离(esi；在本文中也简称为“电喷雾”)也可以被使用，因为它与质谱仪连接液相色谱或电动色谱分离技术的固有兼容性。如上所述，在电喷雾电离中，通过在尖端或孔口与质谱仪源板之间施加电场，从包括电喷雾特征(例如，发射器尖端或孔口)的毛细管或微流体设备的远端发射样本和溶液的小液滴。然后液滴在这个感应出的电场中拉伸和膨胀以形成锥形发射(即，“taylor锥”)，其包括越来越小的液滴，这些液滴蒸发并产生气相离子，这些气相离子被引入质谱仪以进行进一步分离和检测。发射器尖端可以由毛细管或角落或内置在微流体芯片设计中的esi尖端形成，这为esi提供了方便的液滴体积。可以使用研磨轮、锉刀、加工工具、cnc加工工具、水射流切割或其它工具或工艺对发射器尖端进行锐化以提供小表面和液滴体积，以使esi尖端成形以提供小表面体积等。在一些实施例中，可以通过加热和拉伸芯片的尖端部分来绘制尖端。在一些实施例中，然后可以将尖端切割成期望的长度或直径。在一些实施例中，电喷雾尖端可以涂有疏水涂层，该疏水涂层可以最小化尖端上形成的液滴的尺寸。在一些实施例中，当没有分析物从设备洗脱时，系统可以在分离步骤期间电喷雾移动剂、阴极电解液或任何其它液体。
[0132]
在所公开的方法、设备和系统的一些实施例中，使用其它电离方法，诸如电感耦合激光电离、快速原子轰击、软激光解吸、大气压化学电离、二次离子质谱、火花电离、热电离等。
[0133]
关于电喷雾电离，在一些实施例中，所公开的微流体设备包括被设计为促进高效电喷雾电离和方便与下游质谱分析接口的特征，如图1中所示。从微流体设备(例如，生物或生物类似物)排出并引入质谱仪的分析物的质荷比(或“质量”)可以使用多种不同的质谱仪设计中的任何一种来测量。示例包括但不限于飞行时间质谱、四极质谱、离子阱或轨道阱质谱、飞行距离质谱、傅立叶变换离子回旋共振、共振质量测量和纳米机械质谱。
[0134]
在一些实施例中，微流体设备的电喷雾特征可以与分离通道成一列。在一些实施例中，微流体设备的电喷雾特征可以相对于分离通道以直角或中间角定向。在所公开的方法的一些实施例中，来自在毛细管或微流体设备中执行的最终分离或富集步骤的基本上所有分离和/或富集的分析物馏分都以连续流从电喷雾尖端或特征中排出。在一些实施例中，分析物混合物的一部分(例如，感兴趣的馏分)可以经由被配置为与分析仪器(诸如质谱仪
或被配置为分馏和/或富集样本的至少一部分的另一种设备)接口的出口从微流体设备排出。可以经由废物通道排出分析物混合物的另一部分(例如，包含除感兴趣的馏分以外的馏分)。
[0135]
在一些实施例中，使用压力、电力、电离或这些的任何组合来执行从毛细管或微流体设备的排出。在一些实施例中，排出与如上所述的移动步骤一致。在一些实施例中，用于电喷雾电离的鞘液用作电泳分离的电解质。在一些实施例中，提供雾化气体以将分析物馏分减少为精细喷雾。
[0136]
电喷雾电离性能的基于成像的反馈：使用毛细管或微流体设备的常规esi-ms系统一般不提供用于校准系统以在操作期间重新建立taylor锥的工具。维持稳定的taylor锥会因跨微流体设备或毛细管中的分离通道施加的电泳电场而变得复杂。运行之间或运行期间试剂的电导率的改变会改变与质谱仪的界面处的电压电位。界面处电位的改变会对taylor锥产生不利影响并且会导致电喷雾电离效率的损失。本文公开了用于改进电喷雾电离性能并因此提高为基于毛细管或基于微流体设备的esi-ms系统收集的质谱数据的质量的方法和系统。在一些实施例中，例如，电喷雾电离装置中taylor锥的成像可以用在计算机实现的方法中，以提供对一个或多个操作参数的反馈控制，使得taylor锥的形状、密度或其它特点维持在指定的范围内。在一些实施例中，可以通过这种反馈过程控制的操作参数包括但不限于电喷雾尖端或孔口与质谱仪入口的对准、电喷雾尖端与质谱仪入口之间的距离(例如，通过将包括集成的电喷雾特征的毛细管尖端或微流体设备安装在可编程精密x-y-z平移台上)、分析物样本通过电喷雾尖端的流速(例如，通过调整用于驱动分析物样本的排出的压力、电场强度或其组合)，例如施加在通道近端(例如，在电喷雾尖端或孔口与质谱仪入口之间)的电压、鞘液的体积流速或围绕排出的分析物样本的鞘气，或其任何组合。
[0137]
图4提供了计算机实现方法的示例过程流程图，该方法用于：(i)获取taylor锥的图像(使用各种图像传感器中的任何一种，例如ccd图像传感器或cmos图像传感器)，(ii)处理图像以确定taylor锥的形状、密度或其它特征，(iii)将taylor锥的形状、密度或其它特点与指定的或目标值的集合进行比较，以及(iv)基于所述比较，使用将taylor锥的形状、密度或其它特点与一个或多个操作参数相关联的数学算法来确定对一个或多个操作参数的适当调整，以将taylor锥恢复到指定的的或目标值。在一些实施例中，除了从taylor锥图像导出的数据之外，还可以使用从质谱仪获取的数据(例如，总离子电流数据)来监视系统性能并对一个或多个操作参数进行调整。
[0138]
在一些实施例中，图4中所示的循环过程包括以下步骤：图像获取和处理、taylor锥特点的识别、所述taylor锥特点与目标值的集合的比较以及对于一个或多个esi-ms系统操作参数所需的调整的计算，可以在足够短的时间内完成，以使一个或多个操作参数可以以至少0.01hz、0.1hz、0.2hz、0.3hz、0.4hz、0.5hz、0.6hz、0.7hz、0.8hz、0.9hz、1hz、10hz、100hz或1000hz或任何其它相关速率(例如，至少为nyquist速率的速率)的速率被更新。
[0139]
交替的高质量/低质量扫描：在所公开的方法、设备和系统的一些实施例中，质谱仪可以被设置为在高质量扫描范围(例如，大约1500
–
6000m/z的范围)或“高质量扫描”与低质量扫描范围(例如，大约150
–
1500m/z的范围)或“低质量扫描”之间交替，使得低质量扫描可以被用于识别低质量标记，例如，在执行等电聚焦分离步骤的情况下的自由溶液两性电解质，其可以在质谱数据中被识别并用于关于由低质量标记(例如，在检测游离溶液两性电
解质、肽、小分子标记物的情况下的特定范围的等电点)指示的特性对其进行校准。高质量扫描和低质量扫描之间的切换以及扫描速率相对于分析物样本从电喷雾接口的流出来说应当是快速的。在一些情况下，高质量扫描和低质量扫描之间的切换速率可以在从大约0.5hz至大约50hz的范围内。在一些情况下，切换速率可以是至少0.5hz、至少1hz、至少5hz、至少10hz、至少20hz、至少30hz、至少40hz或至少50hzhz。
[0140]
更改高和低分离/移动电压以保持esi尖端电压恒定：在一些实施例中，质谱仪上的esi离子源将具有能够在质谱仪上设置负电压的可调电源。在一些实施例中，质谱仪上的esi离子源将具有能够在质谱仪上设置正电压的可调电源。在一些实施例中，质谱仪上的esi离子源将保持接地。在一些实施例中，毛细管或微流体设备上的esi尖端将保持接地或靠近地，以在esi尖端和质谱仪上的带电esi离子源之间生成电场。在一些实施例中，毛细管或微流体设备上的esi尖端将保持在正电压或负电压以在esi尖端和质谱仪上接地的esi离子源之间生成电场。
[0141]
图15提供了计算机控制的反馈回路的示例性流程图，以在移动期间维持阳极和阴极之间3000v的恒定电压降，同时将esi尖端电压保持在0v。在一些实施例中，当质谱仪esi离子源相对于地设置为正电压或负电压(例如，-3500v)时，可以实现这个反馈回路。在这个示例中，通过在图7a中将阳极电解液端口108初始设置为+3000v并将移动剂端口104设置为0v，阳极电解液端口108和移动剂端口104之间的δv保持在3000v。在一些实施例中，可以通过将阳极液端口108设置为不同的值来设置不同的δv。在一些实施例中，可以使用阳极移动，并且端口108将是被设置为例如-3000v的阴极液端口。在图15中概述的示例中，在移动期间，分离通道112中的电阻由于分离中的分析物和两性电解质重新获得电荷而下降。这造成跨通道112的电压降下降，从而导致esi尖端116处的电压增加，根据等式1：
[0142]v116
＝(
△v108-104
)*(r
105
)/(r
109
+r
112
+r
105
)
[0143]
但是，通过测量或计算esi尖端电压116，可以调整阳极电解液端口108和移动剂端口104处的电压设置。通过从阳极液端口108和移动剂端口104设置中减去esi尖端电压116，δv
108-104
保持3000v，因此移动不受影响，但根据等式2，esi尖端116电压设置为0：
[0144]v116
＝(
△v108-104
)*(r
105
)/(r
109
+r
112
+r
105
)+v
104
[0145]
这个反馈回路继续操作直到移动完成，以规则的频率(例如，nyquist速率或大约0.2hz)将esi尖端116的电压调整为0。在一些情况下，esi尖端116处的电压可以以至少0.01hz、0.1hz、0.2hz、0.3hz、0.4hz、0.5hz、0.6hz、0.7hz、0.8hz、0.9hz、1hz、10hz、100hz或1000hz的速率调整到0。维持esi尖端116处恒定的稳定电压对于在移动过程期间维持稳定的电喷雾至关重要。
[0146]
在一些情况下，反馈回路操作以将esi尖端处的电压维持在预设值的指定百分比范围以内。例如，在一些情况下，反馈回路操作以将esi尖端处的电压维持在预设值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％内。在一些情况下，反馈回路操作以将esi尖端电压维持在预设值的1000v、500v、100v、75v、50v、25v、10v、5v或1v以内。
[0147]
在一些实施例中，质谱仪esi离子源保持接地，并且esi尖端116将需要保持在恒定的正或负电压以便在esi尖端116和质谱仪之间创建电场。在一些实施例中，esi尖端电压(例如，预设值)可以是大约+5000v、大约+4000v、大约+3500v、大约+3000v、大约+2500v、大约+2000v、大约+1500v、大约+1000v、大约+500v，或大约-5000v、大约-4000v、大约-3500v、
大约-3000v、大约-2500v、大约-2000v、大约-1500v、大约-1000v或大约-500v。图12提供了计算机控制的反馈回路的示例流程图，以在移动期间维持阳极和阴极之间3000v的恒定电压降，同时将esi尖端电压保持在3000v。除了阳极电解液端口108和移动剂端口104处的电压偏移了+3000v(这将esi尖端116处的电压偏移到+3000v，仍然遵循等式2)之外，计算机控制的反馈回路的操作与图15中的相同。在一些实施例中，可以使用模拟电路来实现对电场强度的控制。在一些实施例中，可以通过使用一个、两个、三个或四个或更多个独立的高压电源来控制与基于毛细管或基于微流体设备的分离系统接触的一个或多个电极处的电压。在一些情况下，可以例如通过使用单个多路复用的高压电源来控制与基于毛细管或基于微流体设备的分离系统接触的一个或多个电极处的电压。
[0148]
在一些情况下，反馈回路操作以将分离通道内的电场强度或阳极和阴极之间的电压降维持在预设值的指定百分比以内。例如，在一些情况下，反馈回路操作以将分离通道内的电场强度或阳极和阴极之间的电压降维持在预设值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％以内。在一些情况下，反馈回路操作以将分离通道内的电场强度或阳极和阴极之间的电压降维持在预设值的1000v、500v、100v、75v、50v、25v、10v、5v或1v的范围内。
[0149]
更改质谱仪入口电位以保持esi尖端与质谱仪入口之间的电压差恒定：在一些实施例中，质谱仪可以具有与其耦合的可调电源，该可调电源能够在质谱仪(例如，在入口处)设置负电压。在某些实施例中，质谱仪可以具有与其耦合的可调电源，该可调电源能够在质谱仪上(例如，在入口处)设置正电压。在各种实施例中，质谱仪或质谱仪入口可以保持接地。在一些情况下，毛细管或微流体设备上的esi尖端可以保持接地或靠近地，以在esi尖端与质谱仪上的带电esi离子源之间生成电场。在某些情况下，毛细管或微流体设备上的esi尖端可以保持在正或负电压，以在esi尖端与质谱仪之间(例如，在入口处)生成电场。在各种情况下，可以调整施加到质谱仪的电位，例如，在反馈回路中，以维持esi尖端与质谱仪入口之间的恒定电压差(δv
tip-ms
)。在一些情况下，电压差(δv
tip-ms
)可以设置为目标值(δv
target
)或目标值范围。在某些情况下，可以调整esi尖端的电位和质谱仪的电压或电位(例如，在入口处)，例如，以保持esi尖端与质谱仪之间的电压降恒定或在目标值的范围内。
[0150]
在各种情况下，计算机控制的反馈回路可以被用于维持esi尖端与质谱仪之间的恒定电压降。在一些实施例中，当质谱仪esi离子源设置为相对于地的正电压或负电压(例如，-3500v)时，可以实现这个反馈回路。在这个示例中，参考图7a，通过将阳极电解液端口108设置为+3000v并将移动剂端口104设置为0v，可以将阳极电解液端口108和移动剂端口104之间的δv设置为3000v的初始电压。在某些实施例中，可以通过将阳极液端口108设置为不同的值来设置不同的δv。在一些实施例中，可以使用阳极移动，并且端口108将是阴极液端口，设置为例如-3000v。在一些情况下，在移动期间，分离通道112中的电阻可以由于分离通道中的分析物和两性电解质重新获得电荷而下降。根据以下等式，这会使得跨通道112的电压下降，从而导致esi尖端116处的电压增加：
[0151]v116
＝(
△v108-104
)*(r
105
)/(r
109
+r
112
+r
105
)
[0152]
通过测量或计算esi尖端116电压，可以调整质谱仪电压。例如，可以将esi尖端116处的电压的增加添加到施加到质谱仪的电压，使得质谱仪入口与esi尖端116之间的电压差，即，δv
tip-ms
，保持相同。在一些情况下，可以调节esi尖端116和质谱仪的电压。反馈回路
可以继续操作直到移动完成，从而以规则的频率(例如，nyquist速率或大约0.2hz)调整质谱仪电压(例如，在入口处)以匹配esi尖端116的电压。在一些情况下，可以将施加到质谱仪的电压以至少0.01hz、0.1hz、0.2hz、0.3hz、0.4hz、0.5hz、0.6hz、0.7hz、0.8hz、0.9hz、1hz、10hz、100hz或1000hz的速率调整到0。在esi尖端116与质谱仪入口之间维持恒定的稳定电压差可以在分析物移动到质谱仪的过程期间维持稳定的电喷雾。
[0153]
在一些情况下，反馈回路可以操作以将质谱仪入口、esi尖端或两者的电压维持在预设值的指定百分比内。例如，在一些情况下，反馈回路可以操作以将质谱仪处的电压维持在预设值(例如，δv
target
)的至少10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％以内。在另一个示例中，在一些情况下，反馈回路可以操作以将esi尖端与质谱仪之间的电压降保持在预设值(例如，δv
target
)的至少10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％以内。在一些情况下，反馈回路可以操作以将质谱仪电压维持在预设值的至少1000v、500v、100v、75v、50v、25v、10v、5v或1v(例如，δv
target
)以内。在一些情况下，反馈回路可以操作以将质谱仪与esi尖端之间的电压差维持在预设值(例如，δv
target
)的至少1000v、500v、100v、75v、50v、25v、10v、5v或1v以内。
[0154]
在一些实施例中，esi尖端116可以保持接地，并且质谱仪或质谱仪入口可以保持在恒定的正或负电压以在esi尖端116与质谱仪入口之间产生电场。在一些实施例中，质谱仪入口电压(例如，预设值)可以是大约+5000v、大约+4000v、大约+3500v、大约+3000v、大约+2500v、大约+2000v、大约+1500v、大约+1000v、大约+500v、或大约-5000v、大约-4000v、大约-3500v、大约-3000v、大约-2500v、大约-2000v、大约-1500v、大约-1000v或大约-500v。虽然图12图示了计算机控制的反馈回路的示例流程图，以在移动期间维持阳极与阴极之间3000v的恒定电压降，同时将esi尖端电压保持在3000v，但是将认识到的是，类似的计算机控制的反馈回路可以被用于在移动期间维持esi尖端与质谱仪入口之间的恒定电压降，例如3000v的电压差。在此类情况下，可以测量esi尖端的电压(例如，经由测量芯片上或esi尖端上的电阻、电流或电压)，并且可以调整质谱仪入口的电压以匹配esi尖端处的电压的变化。在一些实施例中，可以对尖端处的电位进行测量并用于预测后续运行中电位的改变。然后可以基于预测的改变调整质谱仪和/或芯片电位，以维持esi尖端与质谱仪之间的恒定电压。在一些实施例中，芯片中通道中电压和电流的测量可以被用于计算电阻，并且这些电阻可以在后续运行中被用于计算尖端处或特定通道中的电压。
[0155]
可以使用多种方法或机制测量esi尖端处的电压，包括使用电源或电极。例如，微流体设备可以包括附加的通道，该附加的通道可以与分离通道相交或流体或电连通(例如，在esi尖端附近)。例如，附加通道可以与分离通道相交的位置距离esi尖端大约为0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm。附加的电源可以连接到这个附加的通道并设置为0微安的电流。附加的电源可以被用于测量esi尖端处的电位，而无需向微流体设备引入附加的电路系统。可替代地或附加地，电极可以放置在esi尖端附近。例如，电极可以放置的位置距离esi尖端大约0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、
800μm、900μm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm。电极还可以被配置为不供给电力或电流，从而允许在不添加附加电路系统的情况下测量esi尖端，因而，允许调整施加到质谱仪入口、esi尖端的电位(例如，经由电位应用于阳极液和阴极液端口，或阳极液和流动端口)，或两者，以维持恒定的δv
tip-ms
。
[0156]
在一些实施例中，可以使用模拟电路系统来实现对电场强度的控制。在某些实施例中，与基于毛细管或基于微流体设备的分离系统接触的一个或多个电极处的电压的控制可以通过使用一个、两个、三个、四个或更多个独立的高压电源来提供。在一些情况下，可以例如通过使用单个多路复用的高压电源来控制与基于毛细管或基于微流体设备的分离系统接触的一个或多个电极处的电压。
[0157]
在某些情况下，反馈回路可以操作以将分离通道内的电场强度、阳极与阴极之间的电压降，或设备(例如，在esi尖端处)与质谱仪入口之间的电压降维持在预设值的指定百分比之内。例如，在一些情况下，反馈回路可以操作以将分离通道内的电场强度、阳极与阴极之间的电压降，或设备(例如，在esi尖端处)与质谱仪入口之间的电压降维持在预设值的至少10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％以内。在一些情况下，反馈回路可以操作以将分离通道内的电场强度、阳极与阴极之间的电压降，或设备(例如，在esi尖端处)与质谱仪入口之间的电压降维持在预设值的至少1000v、500v、100v、75v、50v、25v、10v、5v或1v以内。
[0158]
系统硬件：图5提供了用于所公开的方法、设备和系统的一个实施例的系统硬件框图的示意图。如图所示，本公开的系统可以包括以下硬件组件中的一个或多个：(i)化学分离系统(例如，被设计为执行分析物分离的毛细管或微流体设备，例如，基于等电聚焦的分离，以及一个或多个高压电源)，(ii)用于质谱仪的电喷雾接口，在一些情况下，其可以直接与分离系统集成(如虚线所指示的)，(iii)质谱仪，(iv)成像设备或系统，(v)处理器或计算机，以及(vi)计算机存储器设备，或其任何组合。在一些实施例中，系统还可以包括一个或多个毛细管或微流体设备流量控制器(例如，可编程注射泵、蠕动泵、hplc泵等)、温度控制器，其被配置为对于毛细管或微流体设备、附加的光传感器或图像传感器(例如，光电二极管、雪崩光电二极管、cmos图像传感器和相机、ccd图像传感器和相机等)、光源(例如，发光二极管(led)、二极管激光器、光纤激光器、气体激光器、卤素灯、弧光灯等)、其它类型的传感器(例如，温度传感器、流量传感器、ph传感器、电导率传感器等)、计算机存储器设备、计算机显示设备(例如，包括图形用户界面)、数字通信设备(例如，内联网、互联网、wifi、或其它硬连线或无线通信硬件)等的全部或一部分维持指定的温度。
[0159]
在一些实施例中，系统可以包括集成系统，其中功能硬件组件的选择被打包在固定配置中。在一些实施例中，系统可以包括模块化系统，其中可以改变功能硬件组件的选择以便为新应用重新配置系统。在一些实施例中，这些功能系统组件中的一些(例如，毛细管或微流体设备)是可更换的或一次性的组件。
[0160]
如上所述，可以在所公开系统的不同实施例中使用多种不同质谱仪中的任一种，包括但不限于飞行时间质谱仪、四极质谱仪、离子阱或轨道阱质谱仪、飞行距离质谱仪、傅立叶变换离子回旋共振光谱仪、共振质量测量光谱仪和纳米机械质谱仪。
[0161]
系统和应用软件：如图6中所示，本公开的系统可以包括多个软件模块。例如，系统可以包括系统控制软件模块、数据获取软件模块、数据处理软件模块，或其任何组合。一般
而言，这些软件模块将被配置为在由计算机处理器托管的操作系统或环境内操作，并且可以彼此和/或与操作系统进行通信和共享数据。
[0162]
在一些实施例中，系统控制软件模块可以包括用于以下的软件：
[0163]
(i)协调基于毛细管或微流体设备的分析物分离系统的操作与通过成像系统的图像获取，(ii)协调基于毛细管或微流体设备的分析物分离系统与质谱仪系统的数据获取，(iii)协调通过成像系统的图像获取与基于毛细管或微流体设备的分析物分离系统和/或质谱仪系统的操作，(iv)基于从分离通道和/或taylor锥的成像中得出的数据，提供对电喷雾电离装置和/或质谱仪的一个或多个操作参数的反馈控制，(v)控制通过质谱仪的数据获取，同时以交替的方式在高质量和低质量扫描范围之间切换，(vi)监视esi尖端处的电压并调整分离电路电压以维持恒定的分离电场强度(或阳极与阴极之间的电压降)和esi尖端处的恒定电压，(vii)监视esi尖端处的电压并调整分离电路电压和/或质谱仪电路电压以维持esi尖端与质谱仪(例如，在入口处)之间的恒定电场强度(或电压降)，或其任何组合。
[0164]
在一些实施例中，数据获取模块可以包括用于以下的软件：(i)控制通过一个或多个图像传感器或成像系统的图像获取、存储所述图像数据以及提供与系统控制和/或数据处理软件模块的软件接口，以及(ii)控制通过一个或多个质谱仪系统的数据获取，存储所述质谱仪数据(或其它下游分析仪器)，并提供与系统控制和/或数据处理软件的软件接口，或其任何组合。
[0165]
在一些实施例中，数据处理模块可以包括用于以下的软件：(i)在执行分离的同时、在分离完成之后，或在pi标准品和分析物峰朝着分离通道出口或电喷雾尖端移动之后，处理图像并确定分离通道中的一个或多个pi标准品或分析物峰的(一个或多个)位置，(ii)处理图像并确定一个或多个pi标准品或分析物峰的速度、退出时间和/或电喷雾发射时间，(iii)处理分离通道的图像以监视分析物峰的位置和taylor锥的图像以监视电喷雾性能，其中分离通道和taylor锥的图像是或者同时或者交替获取的，(iv)处理taylor锥的图像，确定taylor锥的形状、密度或其它特点，并计算要对一个或多个操作参数进行的调整，参数包括电喷雾尖端或孔口相对于质谱仪入口的位置(即，对准和/或分离距离)、通过电喷雾尖端或孔口的流体流速、电喷雾尖端或孔口与质谱仪之间的电压等，或其任何组合，以影响质谱仪数据的质量的改变；或其任何组合。
[0166]
可以使用本领域技术人员已知的多种编程语言和环境中的任何一种来实现所公开的系统和应用软件。示例包括但不限于c、c++、c#、pl/i、pl/s、pl/8、pl-6、sympl、python、java、labview、visual basic、.net等。
[0167]
图像处理软件：在一些实施例中，如上所述，数据处理模块可以包括图像处理软件，用于确定pi标记或分离的分析物带的位置，用于表征taylor锥的形状、密度或其它视觉指示器等。本领域技术人员已知的各种图像处理算法中的任何一种都可以被用于图像预处理或图像处理，以实现所公开的方法和系统。示例包括但不限于canny边缘检测方法、canny-deriche边缘检测方法、一阶梯度边缘检测方法(例如，sobel算子)、二阶微分边缘检测方法、相位一致性(phase coherence)边缘检测方法、其它图像分割算法(例如，强度阈值化、强度聚类方法、基于强度直方图的方法等)、特征和模式识别算法(例如，用于检测任意形状的广义hough变换、圆形hough变换等)，以及数学分析算法(例如，傅立叶变换、快速傅立叶变换、小波分析、自相关、savitzky-golay平滑、特征分析等)或其任何组合。
[0168]
处理器和计算机系统：一个或多个处理器或计算机可以被用于实现本文公开的方法。一个或多个处理器可以包括硬件处理器，诸如中央处理单元(cpu)、图形处理单元(gpu)、通用处理单元或计算平台。一个或多个处理器可以由多种合适的集成电路中的任何一种组成(例如，专门为实现深度学习网络体系架构而设计的专用集成电路(asic)或现场可编程门阵列(fpga)以加速计算时间等，和/或促进部署)、微处理器、新兴的下一代微处理器设计(例如，基于忆阻器的处理器)、逻辑器件等。虽然本公开是参考处理器描述的，但其它类型的集成电路和逻辑器件也可以适用。处理器可以具有任何合适的数据操作能力。例如，处理器可以执行512位、256位、128位、64位、32位或16位数据操作。一个或多个处理器可以是单核或多核处理器，或被配置用于并行处理的多个处理器。
[0169]
用于实现所公开的方法的一个或多个处理器或计算机可以是更大计算机系统的一部分和/或可以在通信接口的帮助下可操作地耦合到计算机网络(“网络”)以促进数据的传输和共享。网络可以是局域网、内联网和/或外联网、与互联网通信的内联网和/或外联网，或互联网。在一些情况下，网络是电信和/或数据网络。网络可以包括一个或多个计算机服务器，在一些情况下，这启用分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，在计算机系统的帮助下，网络可以实现对等网络，这可以使耦合到计算机系统的设备能够充当客户端或服务器。
[0170]
计算机系统还可以包括存储器或存储器位置(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存、optane
tm
技术)、电子存储单元(例如，硬盘)、通信接口(例如，网络适配器)用于与一个或多个其它系统和外围设备(诸如高速缓存、其它存储器、数据存储装置和/或电子显示适配器)通信。存储器、存储单元、接口和外围设备可以通过例如在主板上找到的通信总线与一个或多个处理器(例如，cpu)通信。(一个或多个)存储单元可以是用于存储数据的(一个或多个)数据存储单元(或数据储存库)。
[0171]
一个或多个处理器(例如，cpu)执行一系列机器可读指令，这些指令实施在程序(或软件)中。指令存储在存储器位置。指令针对cpu，指令随后对cpu进行编程或以其它方式配置cpu以实现本公开的方法。cpu执行的操作的示例包括获取、解码、执行和写回。cpu可以是诸如集成电路之类的电路的一部分。系统的一个或多个其它组件可以包括在电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(asic)。
[0172]
存储单元存储文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元存储用户数据，例如，用户指定的偏好和用户指定的程序。在一些情况下，计算机系统可以包括在计算机系统外部的一个或多个附加的数据存储单元，诸如位于通过内联网或互联网与计算机系统通信的远程服务器上。
[0173]
本文提供的方法和系统的一些方面通过存储在计算机系统的电子存储位置中(诸如例如在存储器或电子存储单元中)的机器(例如，处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码以软件的形式提供。在使用期间，代码由一个或多个处理器执行。在一些情况下，从存储单元中检索代码并将其存储在存储器中以供一个或多个处理器随时访问。在一些情况下，电子存储单元被排除在外，并且机器可执行指令存储在存储器中。代码可以被预编译和配置用于与具有一个或多个处理器的机器一起使用，该处理器适于执行代码，或者可以在运行时编译。代码可以以被选择以使代码能够以预编译或编译后的方式执行的编程语言供给。
[0174]
所公开的方法和设备的各个方面可以被认为是“产品”或“制品”，例如“计算机程序或软件产品”，通常以机器(或处理器)可执行代码和/或存储在一种类型的机器可读介质中的相关联的数据，其中可执行代码包括用于控制计算机或计算机系统执行本文公开的方法中的一个或多个的多条指令。机器可执行代码可以存储在光学存储单元中，该光学存储单元包括诸如光盘、cd-rom、dvd或蓝光光盘之类的光学可读介质。机器可执行代码可以存储在电子存储单元中，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘上。“存储”类型介质包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关联模块，诸如各种半导体存储器芯片、光学驱动器、带驱动器、盘驱动器等，它们可以对本文公开的方法和算法进行编码的软件在任何时间提供非暂态存储。
[0175]
软件代码的全部或一部分有时可以经由互联网或各种其它电信网络进行通信。例如，此类通信使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，用于传送软件编码指令的其它类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种大气链路使用的那些介质。携带此类波的物理元件(诸如有线或无线链路、光学链路等)也被认为是传送用于执行本文公开的方法的软件编码的指令的介质。如本文所使用的，除非限于非暂态的、有形的“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”之类的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
[0176]
计算机系统通常包括电子显示器，或者可以与电子显示器通信，以提供例如由机器视觉系统捕获的图像。显示器通常还能够提供用户界面(ui)。ui的示例包括但不限于图形用户界面(gui)、基于web的用户界面等。
[0177]
应用：如上所述，所公开的方法、设备、系统和软件在包括但不限于蛋白质组学研究、药物发现和开发以及临床诊断的各种领域中具有潜在应用。例如，使用所公开的方法对分析物样本进行基于分离的esi-ms分析可以实现改进的信息内容和数据质量，这对于在开发和/或制造期间表征生物和生物仿制药物可以非常有益。其它应用可以包括但不限于分析环境污染物、农药、小分子、代谢物、肽、翻译后修饰、糖型、抗体-药物偶联物、融合蛋白、病毒、过敏原、单细胞生物和其它应用。
[0178]
生物制品和生物仿制药是一类药物，其包括例如重组蛋白、抗体、活病毒疫苗、人血浆衍生蛋白、细胞药物、天然来源蛋白、抗体-药物偶联物、蛋白-药物偶联物和其它蛋白质药物。fda和其它监管机构要求使用逐步的方法来证明生物相似性，这可以包括关于结构、功能、动物毒性、人体药代动力学(pk)和药效学(pd)方面对拟议产品和参考产品进行比较、临床免疫原性和临床安全性和有效性(参见“scientific considerations in demonstrating biosimilarity to a reference product:guidance for industry”，美国卫生与公众服务部食品和药物管理局，2015年4月)。蛋白质产品可能需要的结构表征数据的示例包括一级结构(即，氨基酸序列)、二级结构(即，形成α螺旋或β折叠结构的折叠的程度)、三级结构(即，通过折叠多肽骨架和二级结构域产生的蛋白质的三维形状)和四级结构(例如，形成活性蛋白质复合物所需的亚基数，或蛋白质的聚集状态))。在许多情况下，如果不采用费力、耗时且成本高昂的技术(诸如x射线晶体学)，那么可能无法获得这个信息。因此，需要允许方便、实时和相对高通量地表征蛋白质结构的实验技术，以建立候选生物药物与参考药物之间的生物相似性。
[0179]
在一些实施例中，所公开的方法、设备和系统可以被用于为生物药物候选物(例如，单克隆抗体(mab))和参考生物药物提供结构比较数据，以建立生物相似性。例如，在一些情况下，候选药物和参考药物的等电点数据和/或质谱数据可以提供重要的证据来支持生物相似性的证明。在一些实施例中，已经在相同反应条件下用位点特异性蛋白酶处理的候选药物与参考药物的等电点数据和/或质谱数据可以提供重要的证据来支持生物相似性的证明。在一些实施例中，所公开的方法、设备和系统可以被用于监视生物药物制造过程，以通过分析在生产过程中不同点抽取的样本或从不同生产运行抽取的样本来确保产品的质量和一致性。在一些实施例中，所公开的方法、设备和系统可以被用于评估制剂缓冲液的稳定性。在一些实施例中，所公开的方法、设备和系统可以被用于评估克隆细胞系的生物药物候选物的生产和质量。
[0180]
示例
[0181]
提供这些示例仅用于说明目的，而不是限制本文提供的权利要求的范围。
[0182]
示例1
–
执行质谱分析之前芯片上蛋白质电荷的表征
[0183]
上面已经描述了图1中所示的微流体设备的制造。操作时，该设备安装在包含氮气源、加热器、正压泵(例如，parker，t5-1ic-03-1eep)、端接于两个铂-铱电极(例如，sigma-aldrich，357383)的电泳电源(gamm high voltage，mc30)、uv光源(例如，led、qphotonics、uvtop280)、ccd相机(例如，thorlabs、340uv-ge)和用于将样本加载到设备上的自动采样器的仪器上。电源与质谱仪共享共用大地。仪器通过软件(例如，lab view)进行控制。
[0184]
蛋白质样本与两性电解质ph梯度和pi标记物预先混合，然后放入小瓶并加载到自动采样器中。它们经由入口412从自动采样器通过富集通道418连续加载到微流体设备400上，并通过出口434从设备排出到废物430。
[0185]
将鞘液/阴极液(50％meoh，n4oh/h2o)加载到两个阴极液阱404、436上，将阳极液(10mm h3po4)加载到阳极液阱426上，并将加热的氮气源连接到两个气阱408、440。
[0186]
在加载所有试剂之后，通过将电极连接到阳极电解液阱426和阴极电解液阱404、436以发起等电聚焦来将+600v/cm的电场从阳极电解液阱426施加到阴极电解液阱404、436。uv光源对准富集通道418下方，并且相机放置在富集通道418上方以测量通过富集通道418的光，从而借助于它们的吸光度检测聚焦蛋白。由钠钙玻璃构成的玻璃板402用于阻挡来自相机的任何杂散光，因此抑制不通过富集通道418的光到达相机，这增加了测量的灵敏度。
[0187]
聚焦蛋白的图像可以在ief期间连续和/或周期性地被捕获。当当聚焦完成时，将从入口412施加低压，使ph梯度朝着孔口424移动。此时可以维持电场以维持高分辨率的ief分离。在esi过程期间继续对富集通道418进行成像可以被用于确定每种蛋白质从孔口424排出时的pi。
[0188]
随着富集的蛋白质馏分从富集通道418移动到汇合处420，它将与鞘液混合，鞘液可以从阴极液阱404、436通过鞘/阴极液通道406、438流到汇合处420。将富集的蛋白质馏分与鞘液混合可以将蛋白质馏分置于质谱兼容的溶液中并恢复聚焦蛋白质的电荷(ief将蛋白质驱动到不带电状态)，从而改进电离。
[0189]
然后富集的蛋白质馏分继续到孔口424，孔口424可以由玻璃板402的沉头表面422定义。一旦在鞘液阱底与质谱仪负极之间的电场中被捕获，富集的蛋白质馏分可以产生
taylor锥。
[0190]
随着溶液继续从富集通道418推动taylor锥，小液滴将从taylor锥中排出并飞向质谱仪入口。氮气(例如，在150℃)可以从气体阱408、440、沿着气体通道410、432下行并形成位于taylor锥侧面的氮气射流，该射流可以将从taylor锥发出的液滴转化为细小液滴以在离开微流体设备之前形成细雾，这有助于质谱仪中的检测。调整来自入口412的压力可以根据需要调整taylor锥尺寸以改进质谱仪中的检测。
[0191]
示例2-分析物峰离开微流流体芯片并进入质谱仪时的跟踪速度
[0192]
对于这个示例，图7a中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环状烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度是250微米，因此它一直穿过250微米的层。所有其它通道的深度都是50微米。如图7b中所示，通道层夹在两个透明的环烯烃聚合物层之间，以制造平面微流体设备。端口102、104、106、108和110提供对通道网络的访问，用于从外部储器和电触点引入试剂。端口102连接到真空源，从而允许通道103充当废物通道，从而使得能够通过通道网络启用其它试剂的装填以“浪费”。酸(1％甲酸)通过端口108装填到通道109、112、114和103，并流出端口102。样本(4％pharmalyte 3-10、12.5mm pi标准品3.38(纯化肽，序列：trp-asp-asp-asp)、12.5mm pi标准品10.17(纯化肽，序列：trp-tyr-lys-arg)、nist单克隆抗体标准品(零件号8671，nist))通过端口106装填到通道107、112、114和103中并引出端口102。这留下了包含样本分析物的通道112。碱(1％二甲胺)通过端口104装填到通道105、114和103中并流出端口102。移动剂(1％甲酸，49％甲醇)通过端口110装填到通道111、114和103中，并从通道103引出至端口102。
[0193]
通过向端口108施加4000v电压并将端口110接地，对通道112中的分析物样本进行电泳。分析物样本中的两性电解质建立了跨越通道112的ph梯度。使用与通道112对准的280nm光源执行分离的吸光度成像，并用ccd相机测量通过通道112的280光的透射。软件通过比较分离或移动期间的光透射与分析物运行前在没有聚焦分析物的情况下进行的“空白”参考测量来计算吸光度，然后显示通道112长度上的每个像素的吸光度。标准品或分析物聚焦的位置被显示为峰，如图9a
–
9f中所指示的。
[0194]
一旦分析物完成聚焦，就捕获最终聚焦的吸光度图像。软件将识别pi标记的空间位置并在标记之间插值以计算聚焦的分析物馏分峰的pi。此时，控制软件将触发继电器断开端口110处的接地，并将端口104连接到地，并在连接到端口104的移动剂储器上设置压力，以建立通过端口104进入通道105和114并在孔口116处流出芯片的移动剂溶液的100nl/min的流。孔口116定位在距离质谱仪esi入口2mm处，入口电压为-3500v至-4500v。
[0195]
当压力驱动的流将移动剂从端口104引导至孔口116时，移动剂试剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105通过通道112在端口108处电泳至阳极。当甲酸盐通过通道112时，它将破坏等电ph梯度，导致两性电解质、标准品和分析物样本增加电荷并以电泳方式从通道112迁移到通道114，在那里来自端口104的压力驱动的流将它们带入喷出孔口116的esi。
[0196]
当移动发生时，软件继续捕获吸光度图像，并识别峰，跟踪它们从成像通道112到通道114中的迁移。通过跟踪每个峰离开成像通道112的时间、其速度和通道114中的流速，软件可以计算峰穿过通道114通过孔口116引入质谱仪的时间，从而允许原始聚焦的峰与结果所得的质谱之间的直接关联。
[0197]
图9a-f提供了一系列吸光度迹线的示例，间隔1分钟，示出了从分离通道的图像确定的等电点(pi)标准的移动。图9a示出了在五个pi标准品(峰915、920、925、930、935)的等电聚焦完成之后，在移动之前，吸光度910作为通道距离905的函数的曲线。如图9b中所示，在移动1分钟之后，与pi＝9.99标准品对应的峰915位于成像系统视场的边缘。如图9c中所示，在移动2分钟之后，峰915(pi＝9.99标准品)已退出正被成像的通道的部分。如图9d中所示，在移动3分钟之后，峰920(pi＝8.40标准品)已退出正被成像的通道的部分。如图9e中所示，在移动4分钟之后，峰925(pi＝7.00标准品)已退出正被成像的通道的部分。如图9f中所示，在移动5分钟之后，峰930(pi＝4.05标准品)已退出正被成像的通道的部分。
[0198]
示例3-使用反馈来调整ms和esi参数
[0199]
在示例3中，芯片、仪器和软件执行与示例2中相同的所有过程。此外，第二ccd相机被用于在esi期间对taylor锥进行成像，如图8中所示。这些图像被用于评估taylor锥的质量和一致性。评估质谱仪上的图像和/或总计数允许识别esi taylor锥故障和诊断原因。
[0200]
esi中taylor锥的形成取决于维持与蒸发和esi损失的流体速率相匹配的进入锥的输入流量。taylor锥的尺寸取决于流速、微流体设备与ms之间的电压梯度、微流体设备与ms之间的距离，以及微流体设备的esi尖端和局部环境的细微变化。
[0201]
taylor锥的成像允许诊断esi故障的原因。例如，taylor锥的损失指示流量不足，并且软件可以增加移动剂进入微流体设备的流量。同样，电晕放电指示电压太高，并且软件可以降低电压。esi云的膨胀指示电压太高，而形成液滴而不是taylor锥指示电压太低。这些差异以及任何其它视觉差异都可以在图像中识别出来，并且软件可以自动补偿以重建taylor锥。
[0202]
示例4-低质量扫描作为分离的标记
[0203]
在示例4中，芯片、仪器和软件执行与示例2中相同的所有过程。此外，一旦发生移动并且分析物峰开始迁移到ms，ms就将设置为在1500-6000和150-1500的m/z范围之间交替。1500-6000范围被用于识别nist抗体分析物馏分峰，因为它们被引入ms。150-1500m/z范围扫描被用于识别引入ms的自由溶液两性电解质(pharmalytes)。可以在质量扫描中识别两性电解质并用于校准来自ms的总离子色谱仪，因为特定两性电解质的存在定义了在任何时间点在ms中分析的等电ph梯度的一部分。
[0204]
示例5
–
更改高和低电压以维持尖端处的电场强度和恒定电压
[0205]
对于这个示例，图7a中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环状烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度是250微米，因此它一直穿过250微米的层。所有其它通道的深度都是50微米。如图7b中所示，通道层夹在两个透明的环烯烃聚合物层之间，以制造平面微流体设备。端口102、104、106、108和110提供对通道网络的访问，用于从外部储器和电触点引入试剂。端口102连接到真空源，允许通道103充当废物通道，从而使得能够通过通道网络启用其它试剂的装填以“浪费”。酸(1％甲酸)通过端口108装填到通道109、112、114和103，并流出端口102。样本(4％pharmalyte 3-10、12.5mm pi标准品3.38(纯化肽，序列：trp-asp-asp-asp)、12.5mm pi标准品10.17(纯化肽，序列：trp-tyr-lys-arg)、nist单克隆抗体标准品(零件号8671，nist))通过端口106装填到通道107、112和114中并引出端口102。这留下了包含样本分析物的通道112。碱(1％二甲胺)通过端口104装填通道105、114和103并流出端口102。移动剂(1％甲酸，49％甲醇)通过端口110装填到通道110、114和103中，然
后从通道102引出至端口102。将压力施加到碱储器以产生通过端口104进入通道105和114并流出孔116的100nl/分钟的流量。
[0206]
通过使用电源1005将2000v施加到端口108并将端口110连接到高压电源1010并施加-2000v来发起通道112中的分析物样本的等电聚焦。这建立了图10a中表示的电路，该电路包括高压电源1005和高压电源1010(在一些情况下，电源1005和电源1010可以包括单个多路复用的高压电源的两个通道)，以在阳极与阴极之间生成4000v的电压降。通道的电阻取决于通道的维度和试剂的电导率。在这个示例中，与通道109(参见图7a)对应的酸通道的电阻r109是10兆欧，与通道112(参见图7a)对应的样本通道的电阻r112从40兆欧开始，并且与通道111(参见图7a)对应的通道中的碱极的电阻r111是50兆欧。孔口116(参见图7a)和质谱仪1015之间的电喷雾电离(esi)界面的电阻r113是2千兆欧姆。通道109、112和111(参见图7a)的总电压降是4000v，并且由于这些通道表示三个串联电阻，因此尖端处的电压(v
116
)根据等式1计算：
[0207]v116
＝
△v108-110
*(r
111
)/(r
109
+r
112
+r
111
)+(高压电源1010电压设置)在等电聚焦开始时，v
116
＝0伏。孔口116(参见图7a)定位在距离质谱仪esi入口2mm处，入口电压为-3500v至-4500v以形成taylor锥。图10b示出了图10a中表示的电路的另一个实施例，包括通道105的电阻r105。
[0208]
分析物样本中的两性电解质建立了跨越通道112的ph梯度。使用与通道112对准的280nm光源执行分离的吸光度成像，并用ccd相机测量通过通道112的280nm光的透射。软件通过比较分离或移动期间的光透射与分析物运行之前在没有聚焦的分析物的情况下进行的“空白”参考测量来计算吸光度，然后显示通道112的长度上的每个像素的吸光度。标准品或分析物聚焦的位置被显示为峰，如图9a-9f中所示。
[0209]
随着样本聚焦，样本通道112的电阻增加，因为两性电解质、抗体异构体和标准品达到其等电点并失去电荷，而通道109和111以及esi界面处的电阻保持不变。计算机实现的方法监视电源1005处的电流并且可以计算通道112中任何时间点的电阻。计算机实现的方法使用这个信息来调整电源1005和1010。例如，当通道112中的电阻上升到140兆欧时，如果不调整电源，那么孔口116处的电压将是-1000v，这将破坏taylor锥。但是，通过将电源1005调整为+3000v，并将电源1010调整为-1000v，尖端将保持在0v，并且通道109、112和111上的总电压降将保持在4000v。这些调整是在通道112中的电阻改变时即时进行的。
[0210]
一旦分析物完成聚焦，就捕获最终聚焦的吸光度图像。软件将识别pi标记的空间位置并在标记之间插值以计算聚焦的分析物馏分峰的pi。此时，控制软件将触发继电器，断开端口110处的电源1010，并将端口104连接到电源1010，并在连接到端口104的移动剂储器上设置压力，以建立通过端口104进入通道105和114的移动剂溶液的100nl/min的流量，并在孔口116处流出芯片(参见图7a中的芯片示意图和图10b中所示的电路)。孔口116定位在距离质谱仪esi入口2mm处，入口电压是-3500v至-4500v。
[0211]
当压力驱动的流将移动剂从端口104引导至孔口116时，移动剂试剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105通过通道112在端口108处电泳至阳极。当甲酸盐通过通道112时，它将破坏等电ph梯度，导致两性电解质、标准品和分析物样本增加电荷并以电泳方式从通道112迁移到通道114，从端口104的压力驱动流将它们带入esi喷出孔口116。
[0212]
当发生移动时，通道112的阻力将下降。图11a-b示出了通道112的电压和电流数据
的示例，这些数据可以被用于导出通道的电阻。图11a示出了电压随时间变化的曲线。图11b示出了电流随时间变化的曲线。软件监视电流的改变并调整电源以保持阳极与阴极之间的电压降为3000v并且尖端116处是0v，如图15中所述。电压改变可以是瞬时的或稳定的。
[0213]
当发生移动时，软件继续捕获吸光度图像，并识别峰，跟踪它们从成像通道112迁移到通道114中。通过跟踪每个峰离开成像通道112的时间、其速度和通道114中的流速，软件可以计算峰穿过通道114通过孔116引入质谱仪的时间，从而允许原始聚焦的峰与结果得到的质谱之间的直接关联。
[0214]
图13a提供了图7a中所示微流体设备在化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将使用附加电阻器r120保持在正电压以将电流吸收到地。电路可以包括可以基本上类似于1005的高压电源1305，和可以基本上类似于1010的高压电源1310，以在阳极和阴极之间生成指定的电压降(例如，4000v)。电路还可以包括第三高压电源1307。通道的电阻取决于通道的维度和试剂的电导率。电路中还集成了与通道109(参见图7a)对应的酸通道r109的电阻、与通道112(参见图7a)对应的样本通道r112的电阻，以及与通道111(参见图7a)对应碱通道r111的电阻，以及孔口116(参见图7a)和可以基本上类似于1015的质谱仪1315的电压源之间的电喷雾电离(esi)r113界面的电阻。电路还可以包括通道105的电阻r105。电源1307可以连接到通道111(参见图7a)，并在移动期间使用设置为0μa的电流控制。这个电源可以读取尖端处的电压并用于实现计算机控制的反馈回路以维持尖端处的恒定电压。
[0215]
图13b示出了图7a中所示的微流体设备在化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将使用电阻器r120保持在正电压以将电流吸收到电源1320。图13c示出了图7a中所示的微流体设备在化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将使用场效应晶体管(fet)1325保持在正电压以吸收电流。该电路可以附加地包括放大器1330、电压参考1335和附加电阻器r200。图13d示出了图7a中所示的微流体设备在化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将使用双极结晶体管(bjt)1340保持在正电压以吸收电流。电源1307可以连接到通道111(参见图7a)并使用设置为0μa的电流控制。这个电源可以读取尖端处的电压并用于实现计算机控制的反馈回路以维持尖端处的恒定电压。图13e提供了图7a中所示的微流体设备在分离的分析物混合物的化学移动期间的代表性电路图，其中esi尖端将保持接地面或靠近地。电源1307可以连接到通道111(参见图7a)并使用设置为0μa的电流控制。这个电源可以读取尖端处的电压并用于实现计算机控制的反馈回路以维持尖端处的恒定电压。
[0216]
示例6
–
基于测量尖端电压更改高和低电压以维持尖端处的电场强度和恒定电压
[0217]
对于这个示例，图7a中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环状烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度为250微米，因此它一直穿过250微米的层。所有其它通道的深度都是50微米。如图7b中所示，通道层夹在两个透明的环烯烃聚合物层之间，以制造平面微流体设备。端口102、104、106、108和110提供对通道网络的访问，用于从外部储器和电触点引入试剂。端口102连接到真空源，从而允许通道103充当废物通道，从而使得能够通过通道网络启用其它试剂的装填以“浪费”。酸(1％甲酸)通过端口108装填到通道109、112、114和103，并流出端口102。样本(4％pharmalyte 3-10、12.5mm pi标准品3.38(纯化肽，序列：trp-asp-asp-asp)、12.5mm pi标准品10.17(纯化肽，序列：trp-tyr-lys-arg)、nist单克隆抗体标准品(零件号8671，nist))通过端口106装填到通道107、112和114中，并引出端口102。这留下了包含样本分析物的通道112。碱(1％二甲胺)通过端口104装填到通道105、
114和103中，并流出端口102。移动剂(1％甲酸，49％甲醇)通过端口110装填到通道110、114和103中，并从通道102流出至端口102(参见图7a的芯片示意图和图13e中所示的电路)。
[0218]
通过使用电源1305将1500v施加到端口108并将端口110连接到电源1307(设置为0v)来发起通道112中分析物样本的电泳。在5分钟之后，将电源1305增加到3000v，持续3分钟，以完成聚焦。
[0219]
分析物样本中的两性电解质建立了跨越通道112的ph梯度。使用与通道112对准的280nm光源执行分离的吸光度成像，并用ccd相机测量通过通道112的280光的透射。软件通过比较分离或移动期间的光透射与分析物运行前在没有聚焦分析物的情况下进行的“空白”参考测量来计算吸光度，然后显示通道112长度上的每个像素的吸光度。标准品或分析物聚焦的位置被显示为峰，如图9a
–
9f中所示。
[0220]
一旦分析物完成聚焦，就捕获最终聚焦的吸光度图像。软件将识别pi标记的空间位置并在标记之间插值以计算聚焦的分析物馏分峰的pi。此时，控制软件将触发继电器将端口104连接到电源1310，并在连接到端口104的移动剂储器上设置压力，以建立通过端口104进入通道105和114并在孔口116处流出芯片的移动剂溶液的100nl/min的流。孔口116定位在距离质谱仪esi入口1315 2mm处，入口电压是-3500v至-4500v。电源1307使用电流控制被设置为0μa，电源1305设置为3000v并且电源1310设置为0v，并且ms esi离子源设置在-3500v和-4500v之间。
[0221]
当压力驱动的流将移动剂从端口104引导至孔口116时，移动剂试剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105通过通道112在端口108处电泳到阳极。当甲酸盐通过通道112时，它将破坏等电ph梯度，导致两性电解质、标准品和分析物样本增加电荷并以电泳方式从通道112迁移到通道114中，在那里来自端口104的压力驱动的流将它们带入喷出孔口116的esi。
[0222]
当移动发生时，通道112的阻力将下降。设置为0μa的电源1307将等于图13e中v116处的电压，因为跨通道111的电压降现在是0(δv＝ir＝0*r111＝0v)。如图11a-b中的数据所示，在聚焦完成之后8分钟(480秒)，软件监视电流的改变，并调整电源以维持阳极与阴极之间的恒定电压降3000v以及尖端116处的0伏，如图15中所述。尖端处的电压(v116)由等式2描述：
[0223]v116
＝
△v108-110
*(r
111
)/(r
109
+r
112
+r
105
)+(电源1310电压设置)
[0224]
当移动发生时，软件继续捕获吸光度图像，并识别峰，跟踪它们从成像通道112迁移到通道114中。通过跟踪每个峰离开成像通道112的时间、其速度和通道114中的流速，软件可以计算峰穿过通道114通过孔口116引入质谱仪的时间，从而允许原始聚焦的峰与结果所得的质谱之间的直接关联。
[0225]
示例7-基于测量尖端电压和电阻器更改高和低电压以维持尖端处电场强度和恒定电压
[0226]
对于这个示例，图7a中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环状烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度是250微米，因此它一直穿过250微米的层。所有其它通道的深度都是50微米。如图7b中所示，通道层夹在两个透明的环烯烃聚合物层之间，以制造平面微流体设备。端口102、104、106、108和110提供对通道网络的访问，用于从外部储器和电触点引入试剂。端口102连接到真空源，允许通道103充当废物通道，从而使得能够通过通道
网络启用其它试剂的装填以“浪费”。酸(1％甲酸)通过端口108装填到通道109、112、114和103，并流出端口102。样本(4％pharmalyte 3-10、12.5mm pi标准品5.52(纯化肽，序列：trp-glu-his)、12.5mm pi标准品8.4(纯化肽，序列：trp-tyr-lys)、英夫利昔单抗生物类似单克隆抗体标准品(零件号mca6090，bio-rad))通过端口106装填到通道107、112和114中，并引出端口102。这留下了包含样本分析物的通道112。碱(1％二甲胺)通过端口104装填到入通道105、114和103中，并流出端口102。移动剂(1％甲酸，49％甲醇)通过端口110装填到通道110、114和103中，并从通道102流出至端口102(参见图7a的芯片示意图和图13b中所示的电路)。
[0227]
通道112中分析物样本的电泳通过使用电源1305将1500v施加到端口108并将端口110连接到电源1307(设置为0v)来发起。在5分钟之后，电源1305增加到3000v。
[0228]
分析物样本中的两性电解质建立了跨越通道112的ph梯度。使用与通道112对准的280nm光源执行分离的吸光度成像，并用ccd相机测量通过通道112的280光的透射。软件通过比较分离或移动期间的光透射与分析物运行前在没有聚焦分析物的情况下进行的“空白”参考测量来计算吸光度，然后显示通道112长度上的每个像素的吸光度。标准品或分析物聚焦的位置被显示为峰，如图9a
–
9f中所示。
[0229]
一旦分析物完成聚焦，英夫利昔单抗的电荷变体就会被分离，如图16面板a中所示，并捕获最终的聚焦吸光度图像。软件将识别pi标记的空间位置并在标记之间插值以计算聚焦的分析物馏分峰的pi。此时，控制软件将触发继电器将端口104连接到电源1310，并在连接到端口104的移动剂储器上设置压力，以建立通过端口104进入通道105和114并在孔口116处流出芯片的移动剂溶液的100nl/min的流。孔口116定位在距离质谱仪esi入口1315 2mm处。电源1307使用电流控制被设置为0μa，电源1305设置为7000v，电源1310设置为4000v，并且ms esi离子源1315保持接地。附加的电阻器r120连接到电源1310和通道105(r电流吸收器)之间的系统，并且电阻器r120的另一侧连接到电源1320，如图13b中所示。电源1320将被设置为比电源1310至少低4000v，以充当电流吸收器。电阻器r120可以代替地如图13a中那样将电路接地，可以是如图13c中所示的场效应晶体管(fet)，可以是如图13d中所示的双极结晶体管(bjt)，或可以从电源1310吸收电流以创建正常运作的电泳电路的任何其它电阻性元件。
[0230]
当压力驱动的流将移动剂从端口104引导至孔口116时，移动剂试剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105通过通道112在端口108处电泳至阳极。当甲酸盐通过通道112时，它将破坏等电ph梯度，导致两性电解质、标准品和分析物样本增加电荷并以电泳方式从通道112迁移到通道114中，在那里来自端口104的压力驱动的流将它们带入喷出孔口116的esi。
[0231]
当移动发生时，通道112的阻力将下降。设置为0μa的电源1307将等于v116处的电压，因为跨通道111的电压降现在是0(
△
v＝ir＝0*r111＝0v)。如图11a和11b中的数据所示，软件监视电流的改变，并调整电源以维持阳极与阴极之间的恒定电压降3000v以及尖端116处的3000v，如图12中所述。尖端处的电压(v116)由等式2描述：
[0232]v116
＝
△v108-110
*(r
111
)/(r
109
+r
112
+r
105
)+(电源1310电压设置)
[0233]
当移动发生时，软件继续捕获吸光度图像，并识别峰，跟踪它们从成像通道112迁移到通道114中。通过跟踪每个峰离开成像通道112的时间、其速度和通道114中的流速，软
件可以计算峰穿过通道114通过孔口116引入质谱仪的时间，从而允许原始聚焦的峰与结果所得的质谱之间的直接关联。例如，图16面板b示出了电喷雾到质谱仪中的糖型的质量，这些糖型包含在图16面板a中所示的电泳图的酸性峰中。图16面板c示出了来自图16面板a的英夫利昔单抗主峰中糖型的质量。图16面板d和图16面板e示出了来自图16面板a中所示的电泳图中的碱性峰的质量。
[0234]
示例8
–
在2步毛细管ief中更改高和低电压以维持电场强度和恒定电压
[0235]
在示例8中，2步ief(等电聚焦后跟着移动)在60cm毛细管中执行并通过接头喷雾器移动到esi-ms中，如图14a中概述的。分离毛细管1808浸入阳极液瓶1806。高压电源1802通过电极1804连接到阳极液瓶1806。毛细管1808的另一端通过三通1812连接到接头喷雾器1814。毛细管1808插入接头喷雾器1814中，因此毛细管出口非常靠近esi尖端1824。三通接头1812的第三臂连接到移动剂毛细管1816，该毛细管浸入加压的移动剂瓶1818中。加压的移动剂瓶1818也经由电极1817接地，因此它可以充当电流吸收器。此外，接头喷雾器1814通过电线1820连接到电源1810，电线1820连接到喷雾器1814的外部。在这个示例中，质谱仪离子源保持接地。
[0236]
试剂制备如下。阳极液瓶1806中装有1％甲酸水溶液，分离毛细管1808中装有水性样本(250μg/ml nist mab、1.5％pharmalyte 5-8两性电解质、1.5％pharmalyte 8-10.5、5mg/ml pi标准品7.00和10.17)，接头喷雾器室1826和移动剂毛细管1816中装有1％二乙胺水溶液，并且加压的移动剂瓶1818中装有1％甲酸、50％乙腈和49％水。
[0237]
在这个示例中，质谱仪离子源保持接地。为了发起聚焦，电源1802设置为+30kv，电源1810设置为4kv。来自移动剂瓶1818的压力驱动的流以100nl/min的速度被发起。以这种方式，使用接头喷雾器腔1826中的二乙胺发起esi，并且二乙胺还充当等电聚焦步骤的阴极液。
[0238]
随着在毛细管1808中聚焦进行，样本失去电荷承载能力，并且毛细管1808中的电阻增加。由于esi尖端电定位在毛细管1808和腔室1826中的二乙胺之间(参见图14b)，因此esi尖端电压(v
1824
)将根据等式3下降：
[0239]v1824
＝
△v1806-1814
*r
1826
/(r
1808
+r
1826
)+v
1814
[0240]
此外，随着毛细管1808中的电阻增加，通过毛细管的电流将减少，这可以在电源1802处测量。通过等式4，增加的电流将与毛细管1808中的电阻改变直接相关：
[0241]i1806
＝
△v1806-1814
/(r
1808
+r
1826
)
[0242]
使用如图12中描述的计算机控制的反馈回路，系统可以计算毛细管1808中的电阻的改变(以及因此定义esi尖端1824处的电压的毛细管1808两端的电压降的改变)，系统可以调整电源1802和1810以保持26kv的
△
v并维持4000kv的esi尖端电压。
[0243]
在聚焦完成之后(约30分钟)，加压的移动剂瓶1818中的移动剂溶液将取代接头喷雾器室1826中的二乙胺，从而发起毛细管1808中nist mab蛋白同种型的移动。以类似但与等电聚焦相反的方式，随着移动进行，毛细管1808中的电阻将下降，从而影响esi尖端1824处的电压。再一次，计算机控制的反馈回路将使用等式3和4来计算对电源1802和1810的必要改变，以维持26kv电场，同时将esi尖端1824电压保持在4kv。
[0244]
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员来说清晰的是，这些实施例仅作为示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现
在将想到许多变化、改变和替换。应当理解的是，在实践本发明时，可以以任何组合采用本文所述的本发明的实施例的各种替代方案。以下权利要求旨在定义本发明的范围，并且这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物由此被覆盖。