本发明属于凝血功能技术领域，具体涉及一种血小板聚集功能检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
血栓弹力图（teg）是一种对血小板聚集、凝血、纤溶等整个过程实施实时、动态、连续监测的凝血功能分析仪，对病人凝血状况做出定性或定量分析。
血栓弹力图仪于1948年由德国人harter发明，应用于指导临床术中输血，目前已成为检测凝血功能最重要的手段之一。血栓弹力图检测血液凝血功能的原理是将传感器探头浸入血液标本中，血液标本与传感器探头间存在粘滞力，该粘滞力随着血小板聚集、凝血、纤溶等变化而改变，传感器的悬垂丝在这种粘滞力的作用下发生扭转形变，这种扭转形变被检测单元检测到并转化为电信号反馈给控制系统，控制系统接收到变化的信号后进行运算，并将运算结果以曲线图形和实时数据的形式显示在计算机屏幕上。
血栓弹力图（teg）使用经抗凝处理的全血，从内外源性凝血途径激活凝血、纤溶系统系统，从而更全面、更真实地反映人体凝血因子、血小板、纤维蛋白及纤维蛋白溶解的整个过程。
血小板的主要功能是凝血、止血、修补破损的血管。血小板表面与凝血功能相关的受体adp受体、α及β-肾上腺受体、凝血酶（原）受体、胶原受体（gpⅰa/ⅱa、gpⅳ、gp-ⅵ）、txa2/pgh2受体、pgi2/pge1受体、5-羟基色胺受体、肝素受体、pfa（血小板激活因子）受体、纤维蛋白原受体、ca2+受体纤维连接蛋白受体、血小板因子4受体、血管紧张素ⅱ受体、ldl受体、hdl受体、vwf受体（gpⅰb/ⅸ）和gpⅱb/ⅲa（纤维蛋白原受体）等。血小板gpⅱb/ⅲa膜受体是位于血小板表面的的粘附性糖蛋白，是血小板表面数量最多的一种整合素，血小板表面约有5×104~8×104个gpⅱb/ⅲa膜受体。adp、aa、凝血酶等可以激活血小板，使其表面的gpⅱb/ⅲa膜受体构象发生变化，从而使gpⅱb/ⅲa膜受体对可溶性纤维蛋白原、vwf等亲和力增加，最终使血小板聚集在桥联纤维蛋白、vwf上，形成血小板血栓。
adp是人体内最重要的诱导血小板聚集的物质。一方面，adp与血小板膜受体p2y1受体结合后，与gq蛋白耦联激活磷酯酶c，使ca2+从细胞外流入细胞内，细胞内ca2+浓度的升高激活了蛋白激酶c，引起血小板变形和聚集；另一方面，adp与血小板p2y12膜受体结合，与gi蛋白耦联，抑制腺苷酸环化酶ac的活化，降低了血小板中camp的水平，诱发血小板的聚集。氯吡格雷经肝脏细胞色素p450酶代谢形成活性物质，不可逆地与血小板p2y12膜受体结合，阻断adp对腺苷酸环化酶ac的抑制作用，促进舒血管物质磷酸蛋白vasp（依赖于环磷酸腺苷、并被前列腺素e1所刺激）的磷酸化，抑制gpⅱb/ⅲa膜受体的活化，从而抑制血小板聚集。
氯吡格雷作为一种常见的抗血小板聚集药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、动脉硬化及血栓栓塞等引起的并发症。目前血栓弹力图（teg）在检测血小板聚集功能时缺乏足够的灵敏度，即对服用氯吡格雷类药物的患者标本不能有效检出，或者虽能有效检出，但和其他方法相比不能比较真实的反映血小板被抑制的程度。
技术实现要素：
针对目前的检测试剂对服用氯吡格雷类药物的患者标本不能有效检出，即使能有效检出，但和其他方法相比不能比较真实的反映血小板被抑制的程度的缺陷和问题，本发明提供一种血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂。
本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，包括二磷酸腺苷二钠和冻干保护剂。
上述的血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，所述二磷酸腺苷的添加量为0.012%。
上述的血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，所述冻干保护剂包括糖类冻干保护剂和聚合物类冻干保护剂。
上述的血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，所述糖类冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖中的一种或几种。
上述的血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，所述糖类保护剂为海藻糖，海藻糖的添加量为1%。
上述的血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，所述聚合物类冻干保护剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种。
上述的血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，所述聚合物类冻干保护剂为牛血清白蛋白，牛血清白蛋白的添加量为2%。
本发明还提供一种血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）按配方量量取冻干保护剂，加入蒸馏水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；
（2）按配方量称取二磷酸腺苷二钠，将其倒入冻干保护剂溶液中，混合均匀得到二磷酸腺苷检测试剂母液；
（3）将二磷酸腺苷检测试剂按照每瓶20-60微升分装至西林瓶中得到成品二磷酸腺苷检测试剂；
（4）将二磷酸腺苷检测试剂真空冷冻干燥得到二磷酸腺苷试剂冻干品。
上述的血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂的制备方法，二磷酸腺苷检测试剂按照每瓶40微升分装至西林瓶中。
本发明的有益效果：本发明充分考虑诊断试剂对抗血小板药物的不同反应性，对目前临床上常用的氯吡格雷、替格瑞洛和普拉格雷等均有较好的灵敏度。本发明二磷酸腺苷杯检测试剂用于服药后肝素钠抗凝血液检验，其检验结果准确性好，批内和批间精密度高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：本实施例提供一种血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，该检测试剂包括二磷酸腺苷二钠和冻干保护剂，其中冻干保护剂包括糖类冻干保护剂和聚合物类冻干保护剂，糖类冻干保护剂可以为海藻糖、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖中的任一种或任几种；聚合物类冻干保护剂可以为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的任一种或任几种。本实施选择海藻糖和牛血清白蛋白作为冻干保护剂。
本实施例的二磷酸腺苷杯检测试剂总量为40微升，按体积比各原料的用量分别为：二磷酸腺苷二钠0.012%、牛血清白蛋白2.0%、海藻糖1.0%，余量为蒸馏水。
制备方法：
（1）按配方量量取牛血清白蛋白和海藻糖，加入蒸馏水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；
（2）按配方量称取二磷酸腺苷二钠，将其倒入冻干保护剂溶液中，混合均匀得到二磷酸腺苷检测试剂母液；
（3）将二磷酸腺苷检测试剂按照每瓶40微升分装至西林瓶中得到成品二磷酸腺苷检测试剂；
（4）将二磷酸腺苷检测试剂真空冷冻干燥得到二磷酸腺苷试剂冻干品。
实施例2：本实施例的二磷酸腺苷杯检测试剂总量为60微升，按体积比各原料的用量分别为：二磷酸腺苷二钠0.02%、牛血清白蛋白3.0%、海藻糖2.0%，余量为蒸馏水。
制备方法：
（1）按配方量量取牛血清白蛋白和海藻糖，加入蒸馏水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；
（2）按配方量称取二磷酸腺苷二钠，将其倒入冻干保护剂溶液中，混合均匀得到二磷酸腺苷检测试剂母液；
（3）将二磷酸腺苷检测试剂按照每瓶60微升分装至西林瓶中得到成品二磷酸腺苷检测试剂；
（4）将二磷酸腺苷检测试剂真空冷冻干燥得到二磷酸腺苷试剂冻干品。
实施例3：本实施例的二磷酸腺苷杯检测试剂总量为40微升，按体积比各原料的用量分别为：二磷酸腺苷二钠0.008%、牛血清白蛋白1.0%、海藻糖1.0%，余量为蒸馏水。
制备方法：
（1）按配方量量取牛血清白蛋白和海藻糖，加入蒸馏水或纯化水充分溶解得到冻干保护剂溶液；
（2）按配方量称取二磷酸腺苷二钠，将其倒入冻干保护剂溶液中，混合均匀得到二磷酸腺苷检测试剂母液；
（3）将二磷酸腺苷检测试剂按照每瓶40微升分装至西林瓶中得到成品二磷酸腺苷检测试剂；
（4）将二磷酸腺苷检测试剂真空冷冻干燥得到二磷酸腺苷试剂冻干品。
试验例：本试验例提供一种血小板聚集功能二磷酸腺苷杯检测试剂，二磷酸腺苷二钠的添加量为0.001-0.02%，本试验例将其用量选取0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.012%、0.014%、0.016%、0.018%和0.02%十个水平，试验分组见表1：
从表2中各数据可以看出，编号6实验组中r、k、angle和ma与参比试剂测量结果的相对偏差最小，且满足相对偏差均不大于10%。所以本发明试剂中二磷酸腺苷二钠用量优选0.012%。
二磷酸腺苷杯检测试剂加入的糖类冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、葡聚糖和葡萄糖中的一种或几种，实验结果显示加入试剂质量体积0.5~2.5%的海藻糖时冻干效果最好，且对二磷酸杯检测试剂各指标无明显影响。加入不含还原基海藻糖，可起低温和脱水保护作用，更好的维持二磷酸腺苷二钠的结构。
二磷酸腺苷杯检测试剂加入的聚合物类冻干保护剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种，实验结果显示加入试剂质量体积0.1~3.0%的牛血清白蛋白时冻干效果最好，且对二磷酸腺苷杯检测试剂各指标无明显影响。加入牛血清白蛋白与海藻糖一起相互作用，使二磷酸腺苷二钠免受冻干过程中低温和脱水导致的变质失活。
用牛血清白蛋白、海藻糖做冻干保护剂，二磷酸腺苷二钠活性保持的效果最为理想。经初步预实验后，将各冻干保护剂用量暂定为：海藻糖选择1.0%、1.5%和2.0%三个水平；牛血清白蛋白选择1.0%、2.0%和3.0%三个水平；
各试验水平、因素组合如下表3所示。
以某进口试剂为参比试剂，每个样本分别用本发明试剂和参比试剂平行做三次，检测结果如下表4所示。
从表4中各数据可以看出，编号2实验组中r、k、angle和ma与参比试剂测量结果的相对偏差最小，且满足相对偏差不大于10%。所以本发明试剂中海藻糖用量优选1.0%、牛血清白蛋白用量优选2.0%。
可见本发明的最优选方案为：二磷酸腺苷二钠0.012%，牛血清白蛋白2.0%，海藻糖1.0%，余量为纯化水。
制备的二磷酸腺苷检测试剂能够用于全血检测和血栓弹力图技术中用于抗凝全血检测。
应用例：
本应用例将二磷酸腺苷检测试剂用于血栓弹力图的抗凝血检测，具体如下。
血栓弹力图（teg）检测特征量说明如下：
血凝时间r：凝血酶等凝血因子被充分激活，纤维蛋白凝血块形成开始，到血栓弹力图仪描计振幅达到2mm所需时间。r值延长，说明某些凝血因子缺乏；r值缩短，说明血液呈高凝状态。
血块成形时间k：从r值时间终点开始到血栓弹力图仪描计振幅达到20mm所需时间，反映纤维蛋白和血小板在凝血开始形成时的相互作用。k值的长短反映纤维蛋白原水平的高低。
血凝速率angle：血栓弹力图仪描计振幅曲线弧度最大点的切线与水平线的夹角，反映血凝块形成的速率。当血液处于重度低凝状态时，描计振幅达不到20mm，此时k值无法确定。
血块强度ma：血栓弹力图仪最大描计振幅，是纤维蛋白和血小板gpⅱb/ⅲa受体结合，表现纤维蛋白/血小板凝块的最大强度。
抑制率%：＜50，提示药物没能起到较好的抗凝效应，存在一定程度的药物抵抗。
抑制率%：≥50，提示药物起效，抑制明显。
本发明所述二磷酸腺苷杯检测试剂直接检测经过肝素钠处理的抗凝全血，采集的抗凝全血室温放置不得超过24小时，最好在2小时内使用。
二磷酸腺苷二钠：sigma；
海藻糖生产厂家：上海源叶生物科技有限公司；
牛血清白蛋生产厂家：bioruler；
称取配方规定量的牛血清白蛋白和海藻糖加入到容量瓶中，再加入纯化水，充分溶解，得到冻干保护剂溶液。
称取配方规定量的二磷酸腺苷二钠加到上述冻干保护剂溶液中，用纯化水定容。
将配好的二磷酸腺苷杯检测试剂冷冻干燥，冷冻干燥完成后放入2~8℃保存。
检测方法如下。
1）打开应用软件，在患者信息界面输入患者姓名，选择测试类型，普通杯“ck-citratedkaolin”，巴曲酶杯“a-activated”，二磷酸腺苷杯“adp-activated+adp”；
2）在血栓弹力图仪通道上装载普通杯、巴曲酶杯和二磷酸腺苷杯；注意和测试类型对应！
3）取出巴曲酶杯检测试剂、二磷酸腺苷杯检测试剂和纯化水，分别移取40μl纯化水加入试剂巴曲酶杯检测试剂、二磷酸腺苷杯检测试剂瓶中，盖上瓶盖，充分摇匀；
4）用lml移液器从枸橼酸钠抗凝全血样本中移取1ml到试剂1瓶中，上下颠倒试剂1瓶5次充分混匀，静置4分钟激活血液；
5）普通杯检测：移取20μl试剂2到普通杯杯底，再移取步骤4）中激活的血液340μl加到普通杯中，捏紧杯托，将普通杯推至顶端，测试杆拨至“测试”位，选中“ck-citratedkaolin”通道，点击软件界面“开始”或键盘f10，开始测试；
6）巴曲酶杯检测：从步骤2)复溶试剂a中移取10μl液体加入巴曲酶杯中，再加入360μl肝素化血样，于杯中抽吸三次混匀，将巴曲酶杯推至顶端，测试杆拨至“测试”位，选中“a-activated”通道，点击软件界面“开始”或键盘f10，开始测试；
7）二磷酸腺苷杯检测：从步骤2)复溶试剂a中移取10μl液体、复溶试剂c中吸取10μl液体加入二磷酸腺苷杯中，再加入360μl肝素化血样，于杯中抽吸三次混匀，将二磷酸腺苷杯推至顶端，测试杆拨至“测试”位，选中“adp-activated+adp”通道，点击软件界面“开始”或键盘f10，开始测试；
8）凝血过程约30分钟结束；
9）测试完成后，在软件界面点击“停止”，卸去测试杯，按实验室管理规定处置；
10）抑制率：在软件界面点击“复合”，选择普通杯、巴曲酶杯和二磷酸腺苷杯三个通道的测试结果图，点击“完成”即可查看二磷酸腺苷途径的抑制率信息。
11）检测完毕，关闭仪器电源开关。
结果见表5-9。
由表6和表7可以看出，随机3例健康人抗凝全血检测结果均在规定范围内，说明本发明试剂盒检测结果和患者实际情况相一致。
对本发明二磷酸腺苷检测试剂的批内精密度和批间精密度进行测定，结果见表8和表9。
从表8可以看出，普通杯杯、巴曲酶杯、二磷酸腺苷杯对新鲜枸橼酸钠和肝素钠抗凝全血批内精密度检测结果的变异系数均小于10%，批内精密度较高。
从表9可以看出，各特征量批间精密度的检测结果相对极差均小于10%，说明批间精密度较高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。