一种同时检测血清和尿液中视黄醇结合蛋白的试剂盒的制作方法

本申请涉及医学体外诊断
技术领域：
，特别涉及一种同时检测血清和尿液中视黄醇结合蛋白的试剂盒。
背景技术：
：视黄醇结合蛋白(retinol-bindingprotein,rbp)是肝脏分泌的一种低分子量蛋白(21000kd)，是血液中维生素的转运蛋白，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。测定视黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度，可作为肾功能早期损害和监护治疗的指标。正常情况下，rbp在尿中稳定性强，不易分解，不受ph和血压干扰，rbp排量甚微(100μg/d)。血浆中的rbp约有90％与甲状腺素结合前蛋白结合，形成高分子蛋白复合物，故而不被肾小球滤过膜滤过，当视黄醇被转运到靶细胞后，rbp便游离到血浆中，迅速被肾小球滤过，几乎全部被肾近曲小管重吸收而分解。但在肾近曲小管损伤时，rbp尿排量明显增加，故尿rbp排量增加可作为肾近曲小管损伤的标志物。血浆中rbp降低常见于维生素a缺乏症、低蛋白血症、吸收不良综合征、肝疾病(除外营养过剩性脂肪肝)、阻塞性黄疸、甲状腺功能亢进症、感染症、外伤等疾病。因此同时检测血、尿rbp可判断部分肾脏疾病的类型和动态监测受损程度，与其他项目联合检查更能为肾脏损伤部位及程度提供准确鉴别的诊断依据。目前临床对rbp4的检测方法主要都是基于免疫学，利用抗原抗体的特异性结合，定量检测血液中rbp4含量，比如酶联免疫吸附测定法、化学发光法、免疫比浊法。随着检测技术的进步以及临床检测需求的增大，前两种方法由于费用高或操作繁琐、周期长等劣势，逐渐淡出临床市场。而伴随着全自动生化分析仪的普及，生化比浊法凭借反应时间短，精密度好，易于自动化等优点，成为临床上主流检测方法。常规的免疫比浊法会出现假阴性、假阳性等缺点而且灵敏度较低，而采用胶乳增强免疫比浊法，虽然借助包被了特异性兔多抗的“胶乳”介质在一定程度上提高了灵敏度，但缺乏级联放大效应，在对尿液中rbp进行检测时，由于尿液中rbp含量较血清中低的多，依旧无法保证检测低值的准确度，所以，需要更高灵敏度的检测试剂。技术实现要素：针对相关的视黄醇结合蛋白检测试剂灵敏度较低的问题，本申请提供一种同时检测血清和尿液中视黄醇结合蛋白的试剂盒。本申请提供的一种同时检测血清和尿液中视黄醇结合蛋白的试剂盒，是通过以下技术方案得以实现的。一种同时检测血清和尿液中视黄醇结合蛋白的试剂盒，包括试剂r1和试剂r2；所述试剂r1包括以下组分：视黄醇结合蛋白生物素标记抗体0.1-0.2mg/ml；所述试剂r2包括以下组分：优选的，试剂1中生物素标记抗体浓度与试剂2中亲和素的浓度比为4-6:1。通过采用上述技术方案，本申请在借助胶乳介质增强免疫比浊法灵敏度的基础上，进一步引入生物素-亲和素系统，实现反应信号的级联放大，从而提高检测试剂盒的灵敏度和准确度。具体的，本申请试剂r1中生物素与视黄醇结合蛋白抗体结合，形成生物素标记的视黄醇结合蛋白抗体，结合后的抗体不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。同时，本申请试剂r2中偶联亲和素的胶乳微球中的每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的黄醇结合蛋白抗体，当样品中视黄醇结合蛋白与黄醇结合蛋白抗体结合后，结合物体积被多级放大，光通过后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而极大地提高检测方法的灵敏度。另外，亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，生物素-亲和素系统的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，生物素-亲和素系统结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。在稳定性方面，亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，生物素-亲和素系统的产物稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。综上所述，本申请应用生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应的原理提供了一种灵敏度高、特异性强、重复性好，准确度高、操作简便快捷，成本低的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，本申请试剂盒可同时测定血液和尿液中的视黄醇结合蛋白的含量，检测线性范围为0.5-150mg/l，最高可检测浓度为200mg/l的血液样本，最低可检测浓度为0.02mg/l的尿液样本。可选的，所述试剂盒还包括校准品和质控品，所述校准品和质控品为含有不同浓度的视黄醇结合蛋白抗原的样品。通过采用上述技术方案，本申请试剂盒中的校准品用于定标曲线的绘制，对检测样本进行检测时，采用全自动生化分析仪测定样本吸光度变化值并将其带入定标曲线便可得到待测样本的浓度，检测方法简单；本申请试剂盒中的质控品用于指示试剂盒中试剂r1和r2的有效性，从而确保检测结果具有较好的重复性，提高检测结果的准确性和可靠性。可选的，所述校准品和质控品中，视黄醇结合蛋白抗原稀释液包括以下组分：通过采用上述技术方案，本申请采用以上组分的视黄醇结合蛋白抗原稀释液，一方面，可以将视黄醇结合蛋白抗原稀释到合适的工作浓度，另一方面可以为视黄醇结合蛋白抗原提供一个稳定的贮存、工作环境，降低视黄醇结合蛋白抗原变性的发生率，从而绘制出更加准确的定标曲线，更真实的反应试剂的有效性程度。可选的，所述缓冲液选用所述缓冲液选用tris缓冲液、三乙醇胺、硼酸硼砂、hepes缓冲液的一种或几种。优选的，试剂r1和试剂r2选用ph7.2-7.4的硼酸硼砂缓冲液；视黄醇结合蛋白抗原稀释液选用ph7.2的tris缓冲液。通过采用上述技术方案，本申请的缓冲液能够很好的维持溶液的稳定性，提高试剂盒的使用寿命，提高检测结果的准确性。可选的，所述促凝剂选用peg6000、peg8000、peg10000的一种或几种。优选的，所述促凝剂选用peg6000。通过采用上述技术方案，本申请的促凝剂可以采用以上分子量的聚乙二醇，将其加入到试剂r1中，可与表面活性剂、保护剂和防腐剂共同作用，从而提高试剂r1的稳定性和均一性。可选的，所述表面活性剂选用吐温20、吐温80、曲拉通100、brijtml23聚氧乙烯月桂醚的一种或几种。优选的，所述表面活性剂选用吐温20。通过采用上述技术方案，本申请试剂r1和试剂r2中均加入上述表面活性剂中的一种或几种，表面活性剂的加入可以使试剂中的各组分充分分散，提高试剂的均一性，降低沉淀的形成量。可选的，所述保护剂选用蔗糖、海藻糖、peg6000、牛血清白蛋白中的一种或几种。优选的，所述试剂r1中的保护剂选用蔗糖；所述视黄醇结合蛋白抗原稀释液中的保护剂选用牛血清白蛋白。通过采用上述技术方案，本申请在试剂r1和视黄醇结合蛋白抗原稀释液中还加入保护剂，可以有效提高视黄醇结合蛋白生物素标记抗体、视黄醇结合蛋白抗原的稳定性，防止抗原、抗体活性的降低甚至是失活，从而为提高试剂盒的灵敏度奠定了基础。可选的，所述防腐剂选用proclin300、叠氮钠、硫柳汞中的一种或几种。优选的，所述防腐剂选用proclin300。通过采用上述技术方案，本申请试剂r1、试剂r2和视黄醇结合蛋白抗原稀释液中还加入上述防腐剂，防腐剂的加入可以延长试剂的有效性，延长试剂盒的使用期限，同时还降低了假阳性结果的发生率，检测结果准确可靠。可选的，所述胶乳微球选用羧基胶乳微球，直径为70-150nm。优选的，所述胶乳微球的直径为120nm。通过采用上述技术方案，本申请进一步限定胶乳微球的直径，直径在70-150nm的微球比表面积较大，使胶乳微球的表面尽可能多的与亲和素耦联，从而最大限度的实现反应信号的级联放大效果，提高检测的灵敏度。可选的，反应体系中，待测血样与试剂r1、试剂r2的体积比为3:225:75；待测尿样与试剂r1、试剂r2的体积比为10:225:75；检测波长为600nm。通过采用上述技术方案，本申请进一步限定反应体系和检测条件，在此反应体系和检测条件下对样本进行检测，可实现同时对低值样本和高值样本进行检测，检测的线性范围较宽。综上所述，本申请具有以下有益效果：1、本申请应用生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应的原理，极大地提高了检测试剂盒的灵敏度。本申请试剂盒的检测线性范围为0.5-150mg/l，最高可检测浓度为200mg/l的血液样本，最低可检测浓度为0.02mg/l的尿液样本；2、本申请试剂盒特异性强、重复性好、稳定性好、准确度高、操作简便快捷、成本低，适合临床大规模推广。附图说明图1是本申请实施例1试剂盒线性相关性图；图2是本申请实施例2试剂盒线性相关性图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。本申请的视黄醇结合蛋白抗体为多克隆抗体，购自北京德奥平生物技术有限公司；本申请的生物素为nh2-reactivebiotin，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；本申请的亲和素为链酶亲和素，购自sigma公司；本申请的胶乳微球购自日本jsr集团；本申请的视黄醇结合蛋白抗原购自北京德奥平生物技术有限公司；本申请的全自动生化分析仪采用日立7180全自动生化分析仪；本申请的市售血尿同测试剂盒购自北京九强生物技术股份有限公司；制备例12mg/ml视黄醇结合蛋白生物素标记抗体的制备过程，包括以下步骤：s1.溶解生物素：加入30uldmf至nh2-reactivebiotin瓶中，静置10min，待其充分溶解，获得浓度为10mm的生物素；s2.取1mg待标记视黄醇结合蛋白多克隆抗体于过滤管中，并加入相应体积的labelingbuffer，使抗体的终浓度为2mg/ml，12,000g离心10min(注：过滤管的最大体积为0.5ml)；s3.将步骤s1获得的13.3ulnh2-reactivebiotin和适量labelingbuffer加入至步骤s2离心后的过滤管中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀；放入37℃恒温箱中避光温育30min，再12,000g离心10min；s4.加入适量labelingbuffer至步骤s3离心后的过滤管中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀，12,000g离心10min；重复操作步骤s4一次；s5.加0.2mllabelingbuffer至过滤管中，轻轻吹打；将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000g离心10min；s6.收集离心管中的溶液，即为生物素标记的视黄醇结合蛋白多克隆抗体。制备例2胶乳微球偶联亲和素方法：取1ml质量分数为10％的胶乳微球，粒径为120nm，加入到含10mlph6.8的硼酸硼砂缓冲液的100ml玻璃瓶中混匀，加入15mg/mledc和60mg/ml的nhs，在37℃恒温培养箱中搅拌15min，活化胶乳微球；然后加入亲和素5mg，混匀2小时；离心，去掉上清，用10mlph6.8的硼酸硼砂缓冲液重悬，20％的功率超声10min，得到浓度为1％的亲和素偶联微球，于2-8℃冷藏备用。制备例3胶乳微球偶联亲和素方法：取1ml质量分数为10％的胶乳微球，粒径为150nm，加入到含10mlph6.8的硼酸硼砂缓冲液的100ml玻璃瓶中混匀，加入15mg/ml的edc和60mg/ml的nhs，在37℃恒温培养箱中搅拌15min，活化胶乳微球；然后加入亲和素2mg，混匀2小时；离心，去掉上清，用10mlph6.8的硼酸硼砂缓冲液重悬，20％的功率超声10min，得到浓度为1％的亲和素偶联微球，于2-8℃冷藏备用。实施例1试剂r1ph7.4硼酸硼砂缓冲液100mmol/l；peg600010g/l；氯化钠9g/l；吐温201g/l；蔗糖20g/l；proclin3000.5g/l；视黄醇结合蛋白生物素标记抗体0.2mg/ml；本实施例中的视黄醇结合蛋白生物素标记抗体为制备例1制备的2mg/ml视黄醇结合蛋白生物素标记抗体稀释所得；试剂r2ph7.2硼酸硼砂缓冲液50mmol/l；胶乳微球1g/l；亲和素50ug/ml；吐温200.5g/l；proclin3000.5g/l；本实施例中的亲和素和胶乳微球采用制备例2的方法进行预处理，并将其进行稀释所得；本申请实施例中，试剂1中生物素标记抗体浓度与试剂2中亲和素的浓度比为4:1。视黄醇结合蛋白抗原稀释液的配置方法：称取tris碱6.06g、氯化钠9g、牛血清白蛋白5g、proclin3000.5g，加水至950ml，调节溶液ph至7.2，最后定容至1l。校准品稀释方法：采用视黄醇结合蛋白抗原稀释液将视黄醇结合蛋白抗原稀释成150mg/l、100mg/l、50mg/l、25mg/l、0mg/l，共5个水平，每个水平测定两次，取平均值。质控品稀释方法：采用视黄醇结合蛋白抗原稀释液将视黄醇结合蛋白抗原稀释成40mg/l、80mg/l，共2个水平。反应体系中加入试剂r1225μl、试剂r275μl，待测样本3μl，采用全自动生化分析仪测定待测样本的吸光度，检测波长为600nm，两点终点法读取19-34两点读数并计算。1.定标准曲线的绘制将校准品在全自动生化分析仪进行吸光度检测，具体的检测数据参见表1。表1定标曲线结果水平s1s2s3s4s5校准品浓度0255010015011617062929479953932101716291647905364均值1317112922.54794.55378.52.线性度检测选择线性高值样本用低值样本稀释成150mg/l、120mg/l、60mg/l、30mg/l、10mg/l五个水平；使用全自动生化分析仪对每个样本进行三次吸光度检测，并带入定标曲线换算成检测浓度值，计算相对偏差和相关系数，具体的实验结果参见表2。以理论浓度为横坐标，检测浓度的平均值为纵坐标，绘制线性相关性图，参见图1。表2线性度检测结果从表2和图1中可以看出，采用本实施例试剂盒对模拟血液中视黄醇结合蛋白抗原含量的样本进行检测，得到的检测浓度与理论浓度非常相近，线性度非常好，线性范围在10-150mg/l之间，相关系数r≥0.999，检测结果准确可靠。3.重复性检测使用全自动生化分析仪对两个浓度水平的质控品进行吸光度检测，每个水平检测10次，带入定标曲线换算成检测浓度值，计算标准偏差和变异系数，具体的实验结果参见表3。表3重复性检测结果从表3可以看出，采用本实施例试剂盒对40mg/l、80mg/l样本进行重复检测，所得结果的变异系数cv＜5％，符合要求，重复性优异，检测结果的准确度高。4.最高检测浓度采用抗原稀释液稀释高值视黄醇结合蛋白抗原呈不同浓度梯度，使用全自动生化分析仪对不同浓度水平的样本进行吸光度检测，每个浓度检测3次，带入定标曲线换算成检测浓度值，将获得的平均检测浓度值与理论浓度进行比较，最终得到本实施例试剂盒的最高检测浓度，具体的实验结果参见表4。表4：最高检测浓度从表4中可以看出，当检测理论浓度为250mg/l样品时，所得检测浓度低于理论浓度，但当检测理论浓度为200mg/l样品时，理论浓度与检测浓度吻合。实验结果表明，本实施例试剂盒的最高检测浓度为200mg/l，检测结果可信，不会出现hook效应。实施例2试剂r1视黄醇结合蛋白生物素标记抗体0.1mg/ml；本实施例中的视黄醇结合蛋白生物素标记抗体为制备例1制备的2mg/ml视黄醇结合蛋白生物素标记抗体稀释所得；试剂r2本实施例中的亲和素和胶乳微球采用制备例3的方法进行预处理，并将其进行稀释所得；本申请实施例中，试剂1中生物素标记抗体浓度与试剂2中亲和素的浓度比为5:1。视黄醇结合蛋白抗原稀释液的配置方法：称取tris碱6.06g、氯化钠9g、牛血清白蛋白5g、proclin3000.5g，加水至950ml，调节溶液ph至7.2，最后定容至1l。校准品稀释方法：采用视黄醇结合蛋白抗原稀释液将视黄醇结合蛋白抗原稀释成20mg/l、10mg/l、5mg/l、2.5mg/l、0mg/l，共5个水平，每个水平测定两次，取平均值。质控品稀释方法：采用视黄醇结合蛋白抗原稀释液将视黄醇结合蛋白抗原稀释成0.8mg/l、5mg/l，共2个水平。反应体系中加入试剂r1225μl、试剂r275μl，待测样本10μl，采用全自动生化分析仪测定待测样本的吸光度，检测波长为600nm，两点终点法读取19-34两点读数并计算。1.定标准曲线的绘制将校准品在全自动生化分析仪进行吸光度检测，具体的检测数据参见表5。表5定标曲线结果水平s1s2s3s4s5校准品浓度02.55102011030541066013662113024126651365均值10.5303.5411662.51365.52.线性度检测选择线性高值样本用低值样本稀释成20mg/l、10mg/l、5mg/l、2.5mg/l、0.5mg/l五个水平；使用全自动生化分析仪对每个样本进行三次吸光度检测，并带入定标曲线换算成检测浓度值，计算相对偏差和相关系数，具体的实验结果参见表6。以理论浓度为横坐标，检测浓度的平均值为纵坐标，绘制线性相关性图，参见图2。表6线性度检测结果从表6和图2中可以看出，采用本实施例试剂盒对模拟尿液中视黄醇结合蛋白抗原含量的样本进行检测，得到的检测浓度与理论浓度非常相近，线性度非常好，线性范围在0.5-20mg/l之间，相关系数r≥0.999，检测结果准确可靠。3.重复性检测使用全自动生化分析仪对两个浓度水平的质控品进行吸光度检测，每个水平检测10次，带入定标曲线换算成检测浓度值，并计算标准偏差和变异系数，具体的实验结果参见表7。表7重复性检测结果从表7可以看出，采用本实施例试剂盒对0.8mg/l、5mg/l样本进行重复检测，所得结果的变异系数cv＜5％，符合要求，重复性优异，检测结果的准确度高。4.最低检出限将浓度为20mg/l的样本逐步进行2倍稀释，使用全自动生化分析仪对不同浓度水平的样本进行吸光度检测，带入定标曲线换算成检测浓度值，将获得的检测浓度值与理论浓度进行比较，最终得到本实施例试剂盒的最低检出限，具体的实验结果参见表8。表8检出限确定结果稀释倍数理论值检测值21010.5455.182.52.5161.251.24320.6250.61640.3130.311280.1560.142560.0780.075120.0390.0310240.0200.0220480.0100.02从表8可以看出，当20mg/l样本稀释1024倍时，理论浓度与检测浓度相吻合，实验结果准确；但当20mg/l样本稀释2048倍时，理论浓度与检测浓度相差较大。所以，本实施例试剂盒的最低检出限为0.02mg/l，灵敏度较高，即使待测样本(尿液)中含有较低含量的视黄醇结合蛋白抗原，本实施例试剂盒依旧能够检出，可以有效降低假阴性检测结果出现的概率，缩小患者病情延误的风险。对比实验采用本申请实施例1试剂盒和市售血尿同测试剂盒同时对临床40例血清样本和40例尿液样本中视黄醇结合蛋白浓度进行检测，检测结果参见表9。表9对比实验结果从表9可以看出，采用本申请试剂盒和市售血尿同测试剂盒同时检测40例血清样本，两种试剂盒检测结果的相关系数＞0.98；同时检测40例尿液样本，两种试剂盒检测结果的相关系数＞0.99。以上实验结果表明，本申请试剂盒与目前临床上大范围使用的试剂盒的检测结果相关度极高，符合临床检测要求，能够进行大规模临床应用。本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。当前第1页12