高效无损检测样本中肿瘤细胞数量与活性的方法与系统

本发明属于生物医疗领域，具体涉及一种高灵敏度检测样本中肿瘤细胞数量与活性的方法和系统。

背景技术：

外科手术中常因出血量大而需要输血，如果单纯使用异体血，常因“血荒”不能满足手术备血需求而延误手术时机；此外，同种异体血可导致感染、发热、溶血反应等输血相关并发症，且同种异体输血可能因抑制机体免疫反应进而导致肿瘤患者预后不佳。术中回收式自体血是一种减少甚至避免输注异体血的方法。但术中肿瘤破裂会引起回收血中肿瘤细胞增多，如果自体血清洗过程不能完全清除肿瘤细胞，就会增加肿瘤复发与转移的概率。加入白细胞滤器(受限于材料，白细胞滤器的孔径不同，最小在20-40μm)仍不能保证充分去除肿瘤细胞，且白细胞滤器容易刺激激肽类物质释放导致患者低血压；同时由于肿瘤细胞含量很少，如何高效精确且即时检测自体血中肿瘤细胞数量仍是有待解决的重要问题。

现有检测自体血中肿瘤细胞方法包括，流式细胞仪、pcr技术、免疫磁珠与荧光原位杂交、离心后获取细胞块制作切片并染色等方法。最常用的是采用流式细胞仪方法，但根据前期研究结果来看，不适合进行此类稀有且无特异性标记物的细胞测定。另外，还可以通过pcr与细胞块病理学，以及较为准确的免疫磁珠吸附与原位荧光杂交。但是这些方法都需要对自体血样本进行处理，处理过程包括离心、裂红、清洗、再离心等，然而离心方法所能回收的细胞数量非常有限，回收率不到10％，1ml中存在细胞数量为100个以内，当低于，低于100个/ml时，离心的方法基本无法找到目标细胞,而且会因为处理过程复杂，鉴定时间长，需要破坏细胞结构，难以保留生物活性，无法用于后续鉴定肿瘤细胞的活性。而循环血中所含有的肿瘤细胞一般在每毫升数十个乃至数个，常规方法很难检测。经过自体血及白细胞滤器处理后的血液样本中，肿瘤细胞数量急剧减少，更难探测。目前对于循环血肿瘤细胞的检测方法造价昂贵且耗费时间，难以满足术中即刻了解处理后血液能否回输应用的需求。此外，很多种肿瘤细胞没有特异性标记物，无法通过常规方法识别捕获，因而更增加血液样本中肿瘤细胞识别的难度。此外，已捕获的细胞无法继续进行下游相关研究。

因此，如何快速、精确确定肿瘤患者自体血中是否含有肿瘤细胞，其难点一在于肿瘤患者自体血中所含肿瘤细胞数量少，当前方法很难捕捉到；二是在自体血有肿瘤细胞的情况下如何避免检测过程中的破坏，无法准确判断肿瘤细胞的种类与确定肿瘤细胞真实的活性；三是如何检测经过滤的自体血是否达到回输标准；现有技术存在着检测下限太高，灵敏度太低的问题。缺乏能够解决以上问题的方法和装置，大大限制了自体血回输技术的应用。

为解决或部分解决以上问题，本发明提出了一种先通过parylenec滤膜装置捕集肿瘤细胞，后使用拉曼光谱鉴别的血液中肿瘤细胞数量与活性检测方法和系统。

在稀有的循环血肿瘤细胞的捕获与富集问题中，创新性引入parylenec滤膜过滤装置。parylenec滤膜具有柔性、高孔隙率、高通量特性、仅依赖流体自身重力即可高效过滤血液，并可根据目标细胞大小订制parylenec滤膜孔径，是一种能高效回收目标细胞的材料。其对肿瘤细胞数量≤3个/10ml灌洗液、来源于肺癌、肾癌患者血液中的肿瘤细胞均具有高回收率和高细胞活性保存性能。该材料在捕集ctc效果上，同传统离心方法或流式细胞仪检测方法相比，具有不可比拟的优势。

表面增强拉曼散射技术(surface-enhancedramanscattering,sers)已经被开发用于捕获循环血肿瘤细胞，但sers的检测试剂昂贵，重现性差，只能检测目标细胞的存在与否，而无法确定数量以及在检测后无法进一步分离ctc用于后续的表型鉴定分析。本发明中，检测系统包含显微共聚焦拉曼光谱仪与光谱数据分析软件。其中，使用显微共聚焦拉曼光谱仪采集单个细胞的拉曼光谱。拉曼光谱是分子光谱，可从分子水平上反映物质的组成与结构信息，可用作探测细胞及亚细胞结构并提供样本特异性指示内源性分子组成的指纹信息。通过直接采集细胞光谱，无需建模过程，对样品进行全性质测定(范围、浓度和信息无限制)，操作简易；针对液态样本进行分析的光谱数据分析软件，能够实现物质性质全息照相。同时，由于操作流程简化、可实现即时分析，高效智能化光谱研究。目前，在生物医学领域，本发明方法可用于循环血ctc的捕获与即时识别，并且可以对细胞死/活状态进行直接鉴别，不会对细胞造成损伤，具有极大研究价值和应用前途。

技术实现要素：

本发明的第一个方面提供了一种检测样本中肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：

使一定量的待测样本通过parylenec滤膜过滤装置；

使用显微共聚焦光谱仪对所述parylenec滤膜上拦截的细胞成分进行光谱数据采集；

使用数据分析软件基于分子光谱指纹信息确定肿瘤细胞或成团肿瘤细胞的类型和数量。

parylenec滤膜过滤装置指含有parylenec膜的过滤结构，膜上有滤孔。

进一步地，所述样本可以是需要检测的常见生物样本，例如各类血液样本，包括但不限于患者外周血、经自体血回输装置、或自体血回输装置与白细胞滤器处理后的术中回收的自体血。parylenec滤膜的孔隙大小和结构是根据所述不同肿瘤细胞的类型选定，在一个具体实例中，对于肾透明细胞癌，选择滤膜孔隙结构大小为8μm。

本发明的第二方面提供了一种检测术中回收式自体血中是否含有目标肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：

使得一定体积自体血(通过或不通过白细胞滤器处理后)，通过含有parylenec滤膜过滤结构，其中所述parylenec滤膜的空隙大小和结构是根据所述目标肿瘤细胞的类型选定的；

使用显微共聚焦光谱仪对所述parylenec滤膜上拦截的细胞成分进行光谱数据采集；

使用数据分析软件基于分子光谱指纹信息判断parylenec滤膜上是否存在肿瘤细胞。

其中，细胞的光谱数据图谱通过显微共聚焦拉曼光谱仪(但可以不限于拉曼光谱，例如使用红外光谱、近红外光谱)采集的。基于分子光谱指纹信息检测所述过滤结构是否存在肿瘤细胞或成团肿瘤细胞。分子光谱特征包括波数或频率、峰高、峰面积、峰宽，或不同特征峰的峰高或面积或峰宽的比值等。对肿瘤细胞识别的光谱处理方法包括使用微分或snv消除基线漂移，使用air-pls消除荧光背景，使用平滑或小波消除噪声。肿瘤细胞分类与鉴别方法是使用数据分析软件，使用不同判别分析方法或多种方法的组合(主成分分析，simca，svm和深度学习等方法的优化组合)。肿瘤细胞数量可以通过人工或者数据分析软件自动识别完成。

进一步地，可以将含有肿瘤细胞的parylenec滤膜一同放置于细胞培养液中以方便培养和观测细胞且不对细胞结构造成破坏。

本发明的第三方面提供了一种判断血液样本(外周血或术中回收及经白细胞滤器处理后的自体血)中肿瘤细胞活性的方法，其包括以下步骤：

使得一定量的血液通过parylenec滤膜过滤装置；

将parylenec滤膜过滤装置放置在细胞培养溶液中进行保存避免细胞在光谱分析过程中被破坏。

鉴于拉曼光谱能够对细胞死/活进行直接鉴定，因而在过滤后血液样本进行显微光谱检测时，同时对细胞的存活/死亡状态进行鉴别。

同肿瘤细胞/白细胞鉴别一起，显微共聚焦光谱可同时提供细胞死/活状态的分析，因此可以直观了解到检测到的肿瘤细胞是否为具有活性的细胞。

本发明的第五方面提供了检测自体血过滤器过滤效果是否达标的方法，其包括以下步骤：

使得经自体血过滤器过滤一次或更多次的自体血通过parylenec滤膜过滤装置；

使用显微共聚焦拉曼光谱仪确定parylenec滤膜过滤装置上肿瘤细胞数目接近零或检测到的肿瘤细胞失去活性。

本发明的第六方面提供了用于检测自体血中的肿瘤细胞的系统，该系统包括：

parylenec滤膜过滤装置；

显微共聚焦光谱仪；

数据分析软件(包含主成分分析，simca，svm和深度学习等方法及组合)；

其中显微共聚焦光谱仪使用的光谱是以下任一：拉曼光谱、红外光谱和近红外光谱，显微共聚焦光谱仪用于采集光谱数据，光谱数据包括全息分子光谱特征，分子光谱特征包括波数或频率、峰高、峰面积、峰宽，或不同特征峰的峰高或面积或峰宽的比值等。

数据分析软件包括预处理步骤，该步骤包括对光谱数据进行分析前对光谱数据进行以下处理：使用微分或标准正态变量变换(snv)消除基线漂移，使用自适应迭代最小二乘方法(air-pls)消除荧光背景，使用平滑或小波消除噪声。

所述数据分析软件包含至少两种选自以下方法组成的模块：主成分分析，偏最小二乘分析(simca)，支持向量机(svm)和深度学习；经过试验数据训练，建立多个数据模型，在使用时针对不同的情况可以调用不同的模块。

可选地，该系统还可以包括现有的白细胞滤器，在样品中肿瘤细胞过多时，使样品先通过白细胞滤器，再通过本发明的parylenec滤膜过滤装置。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1本发明的含有parylenec滤膜的过滤装置使用状态下的一个实例；

图2为通过不同孔径的parylenec滤膜过滤装置选择最适合肾癌细胞系过滤孔径的实验结果；

图3为多种样品通过本发明的含有parylenec滤膜的过滤装置后，在光学显微条件下的观察结果；

图4为显微共聚焦拉曼光谱仪及其所获取的特征性光谱图像示意图；

图5为利用本发明的parylenec滤膜过滤装置过滤得到的肾癌癌栓肿瘤细胞带膜培养的结果；

图6为本发明的检测样本中的肿瘤细胞的系统的结构示意图和使用流程；

图7为本发明实施例中对肾癌癌栓患者循环血中所采集的样本进行研究，采用parylenec滤膜过滤装置对肾癌癌栓患者循环血，将肾癌肿瘤细胞(rcc)与白细胞(wbc)在parylenec滤膜上带膜进行培养鉴别的免疫荧光染色。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

参考图1，示出了本发明的parylenec滤膜过滤装置实际使用时的情况，其含有容纳样品的结构。

实施例1

如何根据细胞大小选择parylenec滤膜过滤装置中的孔径大小。孔径过大，肿瘤细胞容易漏出而不易捕捉；而孔径过小，阻碍血液通过，效率低下且容易堵孔。设置一系列与靶细胞大小相近的孔径，使用样品逐一通过不同孔径滤膜，记录靶细胞回收率和背景细胞拦截率，选择最优化比例的高靶细胞回收率和低背景细胞回收率的适宜孔径大小。例如，在细菌相关的研究中发现，对于直径在1微米左右，长度数十微米的细菌，需要选择孔径为4μm孔径，因为红细胞具有变性能力，可以通过改变自身形状穿过4μm孔径，而细菌则被拦截；对于肾细胞癌而言，参见图2，使用肾癌细胞血液进行试验，根据目标细胞回收率和白细胞通过率，适用于肾癌细胞过滤的最优的parylenec滤膜的孔径为8μm。

实施例2

本发明的parylenec滤膜过滤装置可以仅依靠液体自身重力进行过滤，且过滤通量较高，通过以下实验获取过滤通量。再次参考图1，使用孔隙大小为8μm的parylenec滤膜过滤装置测量过滤通量，对于正常人全血，在充分抗凝状态下，将4.5ml样品通过parylenec滤膜过滤装置，计算得到过滤通量为大约17ml/min；对于肾癌癌栓患者中心静脉血所采集的包含循环血肿瘤细胞的样品，将4.5ml样品通过parylenec滤膜过滤装置，通过时间在2min内(图2)，而该样本经18μm白细胞滤器预处理(过滤后)再使用本发明的parylenec滤膜过滤装置过滤，通过时间则缩短至不超过30s。

实施例3

本实施例研究了本发明的parylenec滤膜过滤装置对肾癌患者自体血的肿瘤细胞过滤效果，将不同采血部位和不同处理的血液样本(分别为中心静脉外周血、下腔静脉癌栓周围血、自体血回输装置处理后血液、自体血回输装置+40μm白细胞滤器处理后自体血，以及自体血回输装置+18μm白细胞滤器处理后自体血)各4.5ml通过含有8μm微孔的parylenec滤膜过滤装置的过滤结构过滤，然后在显微镜下观察拦截获得的细胞，参见图3，a,显微镜下parylenec滤膜结构；b，中心静脉血中parylenec滤膜拦截细胞；c，癌栓周围血中parylenec滤膜拦截细胞；d，经自体血装置清洗后血液中parylenec滤膜过滤装置拦截细胞；e，经自体血装置清洗及40μm滤器过滤后使用parylenec滤膜过滤装置拦截血液中有核细胞；f，经自体血装置清洗及18μm滤器过滤后使用parylenec滤膜过滤装置拦截自体血中的细胞；其中箭头指示癌细胞或癌细胞团块，规则结构为滤孔，a的比例尺和其他图片的比例尺不同。该结果表明仅经自体血处理后的血样中所包含的可拦截细胞数量最多，且形态多样，细胞体积较大，而通过白细胞滤器过滤后所拦截得到的细胞数量明显降低，且细胞直径减小。图e、f反映仅现有白细胞滤器处理不能达到回输患者体内的安全标准，依然有肿瘤细胞残留。

实施例4

实施例3中parylenec滤膜过滤装置拦截得到的细胞成分可以通过显微共聚焦拉曼光谱仪和数据分析软件，通过全息细胞光谱成像的数据分析结果进行细胞的分类鉴别(参照图4)，数据分析软件包括预处理步骤，该步骤包括对光谱数据进行分析前对光谱数据进行以下处理：使用微分或标准正态变量变换(snv)消除基线漂移，使用自适应迭代最小二乘方法(air-pls)消除荧光背景，使用平滑或小波消除噪声。

所述数据分析软件包含至少两种选自以下方法组成的模块：主成分分析，偏最小二乘分析(simca)，支持向量机(svm)和深度学习；该实例中使用主程序分析和深度学习两个分析方法的数据模型，经过对多张包含肾癌肿瘤细胞照片进行数据训练，经训练的数据模型可用于自动且快速的对含有细胞的图像进行分析，确认其中是否包含肾癌肿瘤细胞并对细胞进行计数。

实施例5

含有肾癌癌栓肿瘤细胞的血液通过parylenec滤膜过滤装置进行过滤，连同parylenec滤膜过滤装置一起放入含有胎牛血清的细胞培养液中进行培养，培养9天后仍可以看到存活的癌细胞团(图5)，在parylenec滤膜上培养的肾癌癌栓肿瘤细胞，a,b,c分别为培养3、6、9天；箭头所示为肿瘤细胞簇(cluster)，因而使用parylenec滤膜过滤装置与拉曼光谱仪联合进行细胞的分类鉴别省略了从滤膜分离肿瘤细胞的步骤，不会对细胞造成破坏，大大提高了癌细胞团的存活概率和比例，因而也可以进行后续的相关细胞活性研究。

实施例6

参见图6，示出了检测样本中的肿瘤细胞的系统的结构示意图和使用该系统确认血液是否可以用于回输体内的方法，该系统包括parylenec滤膜过滤装置，显微共聚焦光谱仪，数据分析软件。具体方法如下，根据肿瘤患者的肿瘤类型，选择合适孔径的parylenec滤膜过滤装置，将肾癌患者的4.5ml自体血样品加入parylenec滤膜过滤装置，通过显微共聚焦拉曼光谱仪和数据分析软件，判定自体血中是否含有大量肿瘤细胞，能否直接用于自体回输。如果没有观察到肿瘤细胞，表明可以用于回输。这些步骤可以在10分钟内完成，大大缩短了通常所需的鉴定时间。

带有肿瘤细胞的parylenec滤膜过滤装置可用于一系列的下游鉴定，尤其，由于其所拦截的肿瘤细胞未被破坏，仍有活性，因此可进行分型、药敏等研究。例如，肾细胞癌包括透明细胞型肾癌、颗粒细胞型肾癌、混合细胞型肾癌、未分化细胞型肾癌，根据具体肿瘤分型寻找更敏感的治疗方法。该系统还可以包括用于培养特定肿瘤细胞的培养基，以及与特定肿瘤细胞结合的特异性抗体。培养基可以用于扩增肿瘤细胞，以进行后续实验。特异性抗体可以用于区别肿瘤细胞与白细胞，以及肿瘤细胞的类型或者亚型。

参考图7，本发明实施例中对肾癌癌栓患者循环血中所采集的样本进行研究，采用parylenec滤膜过滤装置对肾癌癌栓患者循环血进行过滤，将肾癌肿瘤细胞(rcc)与白细胞(wbc)在parylenec滤膜上带膜进行培养，然后进行免疫荧光染色用于鉴别细胞的具体种类。

实施例6

继续参见图6，本发明还提供一种本发明的用于评估白细胞滤器安全性的方法，自体血经过白细胞过滤器过滤肿瘤细胞后，无法判定是否达到了自体血的安全标准；需根据癌症细胞种类，选择合适孔径大小的parylenec滤膜过滤装置(根据肿瘤细胞大小，兼顾红细胞通过所要求最小的孔径)，然后将拦截的数量/密度非常低的肿瘤细胞通过显微共聚焦拉曼光谱仪和数据分析软件进行分类鉴别。

通过对某类型的肿瘤自体血样本进行反复多次的大样本研究，并采用含有parylenec滤膜过滤装置的过滤结构和拉曼光谱仪研究滤膜上是否残留肿瘤细胞，并判断其活性，进而判定自体血回输技术与当前临床采用的白细胞滤器是否能完全去除其中的肿瘤细胞或使肿瘤细胞失去活性；进而确定自体血回输的安全性。该方法的敏感性、准确性相对于现有技术具有显著优势。

现有的技术方法，无法对自体血回输仪与白细胞滤器处理后血液中残留的肿瘤细胞数量与活性做出准确测定。将parylenec滤膜过滤装置以及显微共聚焦拉曼光谱仪结构，以及光谱图像的数据处理方法结合其中，含有parylenec滤膜过滤装置的过滤结构可以根据肿瘤细胞类型进行不同孔径大小的订制；显微共聚焦拉曼光谱仪和数据分析系统可对其中的肿瘤细胞进行即时准确判别，从而协助判断自体血与白细胞滤器的过滤安全性。在初次过滤没有达到要求时，可以继续反复处理和检测，直至达到要求为止。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。