一种用于检测STAT3二聚化的质粒

本发明属于分子生物学技术领域。

背景技术：

信号转导和转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，stat3)是具有转录活性的癌基因，其单体首先在胞浆中磷酸化，随后磷酸化的stat3单体二聚化形成二聚体，变成有活性的stat3。活化的stat3二聚体向细胞核移位进而调控肿瘤的增殖、生存、转移、血管生成、免疫应答等过程。

stat3二聚体已经成为抗肿瘤新药筛选的重要靶标之一，研究表明，g-四联体寡核苷酸类(g-quartetoligo-nucleotides)可形成一个复杂的三级结构抑制stat3的二聚化，从而在体外和小鼠模型中抑制鳞癌的生长(刘俊等.stat3信号通路及其肿瘤分子靶向治疗的研究进展.中国神经精神疾病杂志，2011年第37卷第7期)。为了提高这类抑制stat3二聚化的药物的筛选效率，需要建立相关的细胞模型，来反映药物的抑制stat3二聚化的能力。

陈俊生等分别构建pecfp-n1-stat3和peyfp-n1-stat3的荧光报告载体，利用脂质体转染技术将二者共转入hek-293t细胞，利用ecfp(作为供体分子)和eyfp(作为受体分子)两种荧光蛋白之间能量共振转移，检测stat3分子的二聚化水平(陈俊生等.基于荧光共振能量转移技术的stat3二聚化抑制剂筛选模型的建立.中国海洋药物，2018年37卷第3期)。但是，该方法需要构建2种载体，共转入细胞后两种载体的数量很难保持一致，那么二聚体形成可能因为其中一种载体数量不足而受到抑制，导致假阳性。此外，虽然非变性聚丙酰胺凝胶电泳结合免疫印迹可检测蛋白多聚体，但存在检测敏感度低，实验条件不易控制等问题。

技术实现要素：

本发明要解决的问题是：提供一种用于检测stat3二聚化的质粒，以及检测stat3二聚化的方法。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测stat3二聚化的质粒，所述质粒包括如下3种片段：

(1)启动子；

(2)第一个stat3基因，其5’端与标签蛋白a的序列相连；

(3)第二个stat3基因，其3’端与标签蛋白b的序列相连；

其中，(2)和(3)通过2a肽相连；

所述2a肽又叫2a自剪切肽，是一类长18-22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2a肽的重组蛋白自我剪切。这种肽都有一段序列模体，经常会在最后甘氨酸(g)和脯氨酸(p)连接处导致核糖体无法连接，翻译蛋白时提前终止，从而造成“剪切”的效果。

所述标签蛋白a和标签蛋白b序列不同；

质粒中，片段(1)～(3)按照(1)-(2)-(3)或(1)-(3)-(2)的顺序排列。

进一步地，所述标签蛋白a为flag标签，所述标签蛋白b为myc标签；

或，所述标签蛋白a为myc标签，所述标签蛋白b为flag标签。

进一步地，所述质粒是以pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro载体为空载体骨架，于多克隆位点插入片段(1)～(3)得到的质粒。

前述质粒的制备方法，包括如下步骤：

1)使用序列如seqidno.1～2所述引物对stat3的cdna进行pcr扩增，得到flag-stat3片段；

2)将flag-stat3插入空载体骨架，得pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro；

3)使用序列如seqidno.6～7所述的引物对stat3的edna进行pcr扩增，得到myc-stat3-t2a片段；

4)将myc-stat3-t2a片段通过nhei酶切后插入pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro，即得。

进一步地，步骤2)为：flag-stat3片段、空载体骨架通过nhei、noti酶切后，通过t4连接酶连接。

进一步地，步骤4)为：pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro通过nhei酶切后，通过同源重组，将其与myc-stat3-t2a片段连接成环。

一种检测细胞内stat3二聚化水平的方法，包括：

a)将权利要求1～3任一所述质粒转染至细胞；

b)根据标签蛋白a分离蛋白；

c)以分离的蛋白为样品，对标签蛋白b进行检测。

进一步地，步骤b)的分离为使用免疫沉淀方法进行分离。

进一步地，步骤c)的检测为使用westernblot检测。

前述质粒在用于筛选stat3二聚化抑制剂中的用途。

本发明的有益效果：

本发明的质粒在细胞中可1∶1地翻译出带有不同标签的stat3蛋白，若形成stat3二聚体，则二聚体同时带有两种不同的标签(如图1)。通过其中一个标签纯化蛋白后，再针对另一标签进行检测，即可客观反映stat3二聚化水平。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：带有不同标签的stat3二聚体示意图。

图2：pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro载体结构示意图。

图3：pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro质粒示意图。

图4：pcdh-cmv-myc-stat3-t2a-flag-stat3-gfp-puro质粒示意图。

图5：flag-stat3的pcr产物条带。左起第一泳道为dl15000dnamarker(从上到下为15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)，第二泳道为目标条带，第三泳道为spark2000dnamarker(从上到下为2000、1000、750、500、250、100bp)。

图6：flag抗体免疫印迹(ib)检测结果和myc抗体免疫共沉淀(ip)后再进行flag免疫印迹检测的结果。

图7：myc抗体免疫印迹(ib)检测结果和flag抗体免疫共沉淀(ip)后再进行myc免疫印迹检测的结果。

具体实施方式

实施例1本发明质粒的构建

构建过程为：使用pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro为空载体骨架(lifescience-market，香港)(如图2所示)，在其多克隆位点(mcs)，通过双酶切，插入flag-stat3片段，得到pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro(如图3所示)；在pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro的基础上，在flag-stat3片段的上游相邻位置插入myc-stat3-t2a片段，得到本发明的质粒pcdh-cmv-myc-stat3-t2a-flag-stat3-gfp-puro(如图4所示)。

t2a即为2a肽的基因。

详细步骤如下：

一、pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro构建

1.引物设计

根据genbank中nm_139276.2的序列，设计如下pcr引物，其中上游引物带nhei酶切位点，并且加kozak序列(翻译增强序列)，起始密码子，以及flag标签编码序列，以及stat3起始序列；下游引物带noti酶切位点，终止密码子以及stat3末端序列。然后使用从dna文库中stat3的cdna为模板，进行pcr扩增出目的片段。(引物序列如下)

flag-stat3正向引物(seqidn0.1)：

cta(酶切保护碱基)gctagc(nhei序列)acc(kozac序列：翻译增强序列)atg(起始密码子)gactacaaggacgacgatgataag(flag序列)gcccaatggaatcagctacagc(扩增stat3的序列)

flag-stat3反向引物(seqidn0.2)：

aat(酶切保护碱基)gcggccgc(not工序列)tca(终止密码子)catgggggaggtagcgcactc(扩增stat3的序列)

2.pcr反应

反应体系如表1所示。

表1pcr反应体系

注：ddw，双蒸水，下同。

反应条件如下：

反应结束后，用1.0％agarose电泳鉴定并回收目的片段，如图5所示。

3.酶切实验

用nhei、noti将表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro和pcr回收产物进行双酶切，体系如表2、3所示，酶切反应条件：37℃，1h。

表2载体酶切反应体系

表3stat3回收产物酶切反应体系

加入6×loadingbuffer3μl，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并凝胶回收目的条带。

4.连接实验

将酶切回收后的载体片段和stat3片段进行t4dna连接酶连接，体系如表4所示，反应条件：轻轻混匀后，22℃连接1h。

表4连接反应体系

5.转化实验

将连接的混合液直接转入stb13感受态细胞，转化步骤如下：

(1)将连接液20μl全部加入100μl感受态细菌中，置冰上30min；

(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；

(3)全部涂布于含amp抗性的lb平板，37℃倒置培养过夜。

6.阳性克隆鉴定

随机挑取4个单克隆至含amp抗性的400μllb培养液的ep管中，37℃220rpm振摇4h，取1μl菌液做模板，进行pcr鉴定(选择stat3其中一段序列(大小约1kb)设计正反引物，进行pcr，阳性条带为阳性克隆)。

引物序列：

forward：ctagctagcaccatggactacaaggacgacgatgataaggcccaatggaatcagctacagc(seqidno.3)

reverse：atgggcatgcagggctgccg(seqidno.4)

7.dna测序

将经菌落pcr鉴定为阳性克隆测序。

测序结果：

测序结果显示pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro构建成功。

二、pcdh-cmv--myc-stat3-t2a-flag-stat3-gfp-puro构建

1.引物设计

根据nm_139276.2的序列，设计如下pcr引物，其中上下游引物都带nhei酶切位点，以及和pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro经nhei线性化之后的同源臂并且上游加kozak序列，起始密码子，myc标签编码序列，stat3的起始序列，下游加t2a序列，stat3的末端序列。然后使用从dna文库中stat3的cdna为模板，进行pcr扩增出目的片段。(引物序列如下)

myc-stat3正向引物(seqidno.6)：

atagaagattctaga(同源臂)gctagc(nhei序列)gccacc(kozak增强序列)atg(起始密码子)gagcaaaagctcatttctgaagaggacctg(myc序列)gcccaatggaatcagctacagc(stat3)

myc-stat3反向引物(seqidno.7)：

cttgtagtccatggt(同源臂)gctagc(nhei序列)agggccgggattctcctccacgtcaccgcatgttagaagacttcctctgccctc(t2a序列)catgggggaggtagcgcactcc(stat3序列)

2.pcr反应

pcr反应体系和反应时间同第一部分第2节。

3.酶切反应。

用nhei将表达载体pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro进行单酶切，体系参照上文表2(去除表2中的noti)。

4.同源重组反应

将myc-stat3-t2a的片段和线性化的pcdh-cmv-flag-stat3-gfp-puro进行重组反应，反应体系如表5所示，反应条件为：轻轻混匀后，50℃反应30min。

表5同源重组反应体系

5.转化实验

参照上文。

6.阳性克隆鉴定

随机挑取2个单克隆至含amp抗性的400μllb培养液的ep管中，37℃220rpm振摇4h，然后转接到4ml含amp抗性的lb培养液种，37℃220rpm振摇过夜，第二天抽提质粒，然后经nhei单酶切，选取切下来2300bp左右目的条带的克隆送测序。

测序所得序列(seqidno.8)为：

测序结果显示pcdh-cmv-myc-stat3-t2a-flag-stat3-gfp-puro构建成功。

实施例2本发明质粒用于检测stat3二聚化的应用

转染实施例1的pcdh-cmv-myc-stat3-t2a-flag-stat3-gfp-puro质粒至hek293t细胞，48小时后提取细胞总蛋白，对myc或flag进行免疫共沉淀(ip)，总蛋白和ip得到的蛋白均进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，再用免疫印迹(ib)检测flag或myc。

如图6所示，直接用myc抗体做免疫印迹检测，显示有条带(input)，可见myc-stat3表达出了蛋白；由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳会将二聚体变性成单体，所以input泳道是单一条带。对flag进行免疫共沉淀后，用myc抗体做免疫印迹，显示有条带(ip)，如果在细胞内未形成二聚体，则带myc的stat3不能被免疫共沉淀收集到，则不会出现条带；该结果表明，带有myc和flag的stat3蛋白在细胞内被连接到了一起，形成了stat3二聚体。

类似的，如图7所示，直接用flag抗体做免疫印迹检测，显示有条带(input)，可见flag-stat3表达出了蛋白；对myc进行免疫共沉淀后，用flag抗体做免疫印迹，显示有条带(ip)，表明带有myc和flag的stat3蛋白连接到了一起，形成了stat3二聚体。

实施例2的结果表明，本发明构建的pcdh-cmv-myc-stat3-t2a-flag-stat3-gfp-puro质粒在进入目的细胞后，在2a肽的作用下会形成两个stat3单体(分别带有myc和flag标签)，摩尔比为1∶1，对于stat3二聚化水平高的细胞，质粒表达的带myc与flag标签的stat3会形成二聚体，进而容易被免疫共沉淀和免疫印迹方法检测出来。

可将本发明的质粒转入细胞，建立细胞模型，便于对细胞二聚化水平的变化进行监测，能用于stat3二聚化抑制剂的筛选，或者研究某种因子对stat3二聚化的影响。本发明的优势在于仅需要转染一个质粒即可实现stat3二聚化相关研究，可大幅度提高转染效率，同时简化实验流程，方便可行。

sequencelisting

<110>四川大学华西医院

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