基于MEF效应二次放大INS信号的适体传感器及其制备方法和应用

基于mef效应二次放大ins信号的适体传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于传感器领域，涉及胰岛素的检测，特别是指基于mef效应二次放大ins信号的适体传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.胰岛素是胰岛β细胞分泌的一种肽类激素，由两个二硫键接枝的多肽链组成，其中a链由21个氨基酸组成，b链由30个氨基酸组成。胰岛素可以调节碳水化合物、蛋白质和脂质的代谢，维持体内正常血糖水平，并通过促有丝分裂的效应促进细胞分裂和生长。正常空腹时胰岛素的水平应小于30μiu/ml，当机体内的胰岛素利用不充分时，高浓度水平的空腹胰岛素可有效诊断出糖尿病等症状。
3.酶联免疫法(elisa)、放射免疫法(ria)和高效液相色谱法(hplc)是检测胰岛素的常规方法。虽然以上方法可以精确检测胰岛素，但需要繁琐精密的仪器、昂贵的成本和受过专门培训的操作人员，限制了在实时检测中的应用。近年来，基于贵金属、二氧化硅纳米颗粒和碳纳米管等各种先进材料对电极进行修饰，采用电化学方法测定胰岛素，然而这些电极长期稳定性差而且测定时间长。尽管酶和抗体也被用作生物传感器的识别原件，但受温度和ph的影响较大。相比之下，核酸适体是通过体外筛选的方法从大量随机序列中筛选出的人工单链寡核苷酸，核酸适体可以与抗体以相同的方式特异性结合靶目标，但与靶目标的亲和力更高，与抗体相比体积更小。适体与靶目标相互作用时，会表现为g
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四链体或发夹环等构象。
4.本课题组前期在检测胰岛素时设计了一种高通量核酸适体传感器见专利cn201610604853.5，该传感器通过制备纳米偶联体
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核酸适体与血糖仪检测技术相配合，集成一体用于糖尿病的早期诊断与预防；专利cn202010854196.6，公开了一种电沉积金和铂
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氧硫化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，该专利通过将铂纳米粒子修饰的氧硫化铜与胰岛素抗体孵化作为二抗标记物，利用铂纳米粒子的生物相容性和催化性能以及氧硫化铜的大比表面积，实现了对胰岛素的高灵敏度检测；结合发明人对本领域传感器的了解，现有的传感器并没有能实现对胰岛素荧光信号进行二次放大的传感器，而且将实验条件下的胰岛素传感器用于实际复杂生物样品中的胰岛素（ins）检测，常常会带来较大的误差。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提出一种基于mef效应二次放大ins信号的适体传感器及其制备方法和应用。
6.本发明的技术方案是这样实现的：基于mef效应二次放大ins（胰岛素）信号的适体传感器的制备方法，步骤如下：（1）将超纯水加入ins核酸适体激活，配制成一定浓度的ins核酸适体溶液；（2）将步骤（1）的ins核酸适体溶液与aunps混合，加入pbs缓冲液，振荡培养2h，再
加入二水柠檬酸三钠溶液，振荡培养2h，离心去除一半上清液，得溶液ⅰ；（3）向溶液ⅰ中加入cy3
‑
dna溶液，定容后，恒温培养12h，即得适体传感器工作溶液。
7.所述步骤（1）中，ins核酸适体的序列为5
’‑
sh
‑
a
n ggt ggt ggg ggg ggt tgg tag ggt gtc ttc
‑3’
，其中n=12
‑
30，n为自然数。
8.所述步骤（1）中，ins核酸适体的序列为5
’‑
sh
‑
a
21 ggt ggt ggg ggg ggt tgg tag ggt gtc ttc
‑3’
。
9.所述步骤（1）中ins核酸适体溶液的浓度为5 μmol/l。
10.所述步骤（2）中ins核酸适体溶液、aunps、pbs缓冲液和二水柠檬酸三钠溶液的体积比为90:45:45:4，其中aunps的浓度为1 nmol/l，pbs缓冲液的浓度为10 mmol/l，二水柠檬酸三钠溶液的浓度为500 mmol/l。
11.所述步骤（2）中定容采用的pbs缓冲液的浓度为10 mm，定容的最后体积为600 μl。
12.所述步骤（3）中cy3
‑
dna溶液与ins核酸适体溶液的体积比为1:1，cy3
‑
dna的序列为5
’‑ꢀ
gaa gac acc cta cca acc ccc ccc acc acc
‑3’
，cy3
‑
dna溶液的浓度为5 μmol/l。
13.上述方法所制备的适体传感器，所述适体传感器通过双链dna提供的刚性结构实现荧光增强，并利用核酸适体与靶目标的特异性结合，实现了荧光信号的二次放大，并对血清中的ins实现了较低浓度检测。
14.上述方法所制备的适体传感器在高灵敏检测胰岛素中的应用，步骤为：向适体传感器工作溶液中加入待测物溶液，用10 mm pbs缓冲液将溶液的总体积定容至600 μl，利用荧光分光光度计对胰岛素与适体传感器形成的纳米偶连体进行荧光检测，记录520nm波长处的荧光强度，代入线性方程计算待测物溶液中胰岛素的浓度。
15.所述线性方程为：y=5.4x+643.17，相关系数为0.94。
16.本申请传感器的检测原理为：本申请的传感器是基于金属荧光增强(mef)的高灵敏生物传感器，用于检测胰岛素(ins)。首先适体在溶液中被激活后会出现两种状态，分别是不会发生缠绕的状态（图1（a
‑
1））和发生缠绕的状态（图1（a
‑
2））。出现这种现象的原因是由于ins核酸适体四种碱基组成成分中包含了大量的碱基g和碱基t，而碱基t会与前端修饰polyan中的碱基a发生碱基互补配对。所以核酸适体与纳米金颗粒进行结合的时候，也会出现对应的两种状态（图1（b
‑
1）与（b
‑
2））。当加入含有cy3荧光基团的互补链时，部分适体会与互补链结合，形成aunps@ ployan
‑
aptamer@cy3
‑
dna的dna纳米偶连体（图1（b
‑
1）），荧光得到增强。在此基础上加入待测物分子胰岛素，由于核酸适体与靶目标的结合力大于其与互补链的结合力，故部分之前由于相互缠绕而未与互补链结合的适体（图1（b
‑
2））会优先与胰岛素分子结合，释放部分多余的核酸适体。此时溶液中过量的互补链会继续与适体结合，形成更多的aunps@ ployan
‑
aptamer@cy3
‑
dna荧光增强结构（图1（b
‑
1）），导致荧光信号出现二次增强。检测传感器输出信号一次增强与二次增强之间的差值，即可反推加入被测物胰岛素的含量。该方法主要针对液体环境中超低浓度检测时输出信号微弱难以准确测量的问题，有效提高传感器输出信号强度，降低微弱信号检测的难度。
17.本发明具有以下有益效果：1、基于mef效应，构建了用于检测ins 的aunps@ployan
‑
aptamer@cy3
‑
dna荧光增
强型适体传感器。该传感器通过双链dna提供的刚性结构实现荧光增强，并利用核酸适体可与靶目标特异性结合的实现了荧光信号的二次放大，有效提高了传感器的输出信号强度，降低了微弱信号检测的难度，最后对血清中的ins实现了较低浓度检测。
18.2、本申请的传感器可对胰岛素的浓度进行定量检测，在ins 0.2 nm
‑
40 nm范围内，所加待测物的浓度与溶液荧光强度之间具有良好的线性关系，线性方程为y=5.4x+643.17，相关系数为0.94，3、传感器对ins的特异性实验，无论在牛血清白蛋白(bsa)、nacl、尿素(urea)、氨苄西林(amp)和生物素(d
‑
biotin)作为干扰物存在时，还是对真实血清进行检测时，实验中的样品回收率均在98%和101%范围内，rsd在六个浓度水平内均低于4%，表明本发明所构建的荧光适体传感器在检测真实人体血清中的胰岛素方面具有很高的重复性，且具有很高的精密性。证明本发明所构建的适体传感器可用于实际复杂生物样品中的ins检测。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为本申请的荧光增强型传感器检测原理，其中a
‑
1 金纳米颗粒表面没有发生缠绕现象的核酸适体单链；a
‑
2 金纳米颗粒表面两条核酸适体发生缠绕的现象；b
‑
1 金纳米颗粒表面两条核酸适体发生缠绕的现象；b
‑
2 金纳米颗粒表面形成的荧光增强结构。
21.图2为本申请荧光增强型适体传感器的可行性分析。
22.图3为传感器条件优化光谱图，其中(a)(c)(e):ployan长度分别为0nm，7nm和9nm时，适体与纳米金体积之比光谱图；(b)(d)(f): ployan长度分别为0nm，7nm和9nm时，取对应光谱图中565nm波长处的荧光强度作适体与纳米金体积之比点线图。
23.图4为传感器在不同polyan长度时的荧光光谱图，其中(a)为ployan长度分别为0nm、4nm、6nm、7nm、8nm、9nm和10nm时所构成传感器的荧光光谱图；(b)为取(a)图中565nm波长处的荧光强度做峰值图。
24.图5为ins浓度0.2nmol/l
‑
40nmol/l的荧光光谱图(a)和图a中565nm处荧光强度的线性拟合结果图(b)。
25.图6为传感器对相同浓度不同分子敏感特异性的荧光强度值。
26.图7中(a)为血清中重复检测三次平均值的荧光光谱图；(b)为血清中重复检测三次平均值与缓冲液检测数据的线性拟合对比。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例1：传感器的制备
（1）试剂：二水柠檬酸三钠、nacl、尿素(urea)、和氨苄西林(amp)均购买于上海生工生物有限公司(中国)。牛血清白蛋白(bsa)、生物素(d
‑
biotin)和牛胰岛素(insulin)均购买于探索平台。pbs缓冲液，ph=7.4，10mm。
29.核酸适体序列如下表所示：表1用于检测ins的荧光增强型dna序列表（2）工作溶液的制备将ins核酸适体放置在超纯水中激活2 h，浓度稀释为5 μmol/l。取90 μl 5 μmol/l激活好的ins核酸适体与45 μl aunps混合，并加入45 μl 10 mmol/l pbs缓冲液，放置37℃恒温振荡箱中振荡培养2h。加入4 μl 500 mmol/l 二水柠檬酸三钠，37℃恒温振荡箱中振荡培养2h，随后离心20 min(14000rpm)，去除多余的核酸适体，加入pbs缓冲液至184 μl。再加入90 μl cy3
‑
dna，用pbs缓冲液定容至600μl放置于37℃恒温振荡箱中培养12h即可得到aunps@ ploya
n
‑
aptamer@cy3
‑
dna纳米偶连体工作溶液，储存于4℃备用。
30.实施例2：传感器的性能分析1、传感器的检测原理：本申请的传感器是基于金属荧光增强(mef)的高灵敏生物传感器，用于检测胰岛素(ins)。首先适体在溶液中被激活后会出现两种状态，分别是不会发生缠绕的状态（图1（a
‑
1））和发生缠绕的状态（图1（a
‑
2））。出现这种现象的原因是由于ins核酸适体四种碱基组成成分中包含了大量的碱基g和碱基t，而碱基t会与前端修饰polyan中的碱基a发生碱基互补配对。所以核酸适体与纳米金颗粒进行结合的时候，也会出现对应的两种状态（图1（b
‑
1）与（b
‑
2））。当加入含有cy3荧光基团的互补链时，部分适体会与互补链结合，形成aunps@ ployan
‑
aptamer@cy3
‑
dna的dna纳米偶连体（图1（b
‑
1）），荧光得到增强。在此基础上加入待测物分子胰岛素，由于核酸适体与靶目标的结合力大于其与互补链的结合力，故部分之前由于相互缠绕而未与互补链结合的适体（图1（b
‑
2））会优先与胰岛素分子结合，释放部分多余的核酸适体。此时溶液中过量的互补链会继续与适体结合，形成更多的aunps@ ployan
‑
aptamer@cy3
‑
dna荧光增强结构（图1（b
‑
1）），导致荧光信号出现二次增强。检测传感器输出信号一次增强与二次增强之间的差值，即可反推加入被测物胰岛素的含量。该方法主要针对液体环境中超低浓度检测时输出信号微弱难以准确测量的问题，有效提高传感器输出信号强度，降低微弱信号检测的难度。
31.传感器的可行性光谱图如图2所示。当polyan厚度为0nm时，荧光的增强效果最低。
随着polyan厚度增加到7nm（21个a碱基）时，传感器的荧光强度升高，证明在核酸适体前端修饰不同个数的碱基a起到了调控荧光强度的效果。polyan厚度增长到10nm（30个a碱基）时，核酸适体序列过长可能发生弯曲导致传感器增强荧光效果不稳定，荧光强度下降。以上数据分析证明了该溶液中纳米增强结构的有效性。
32.实施例3：传感器的制备工艺优化优化核酸适体与纳米金的体积比不仅有助于传感器的荧光增强能力，也使溶液的整体环境更加稳定。另外polyan的长度决定着荧光增强效应的大小。因此，本实施例接下来针对以上两种参数进行优化。
33.1、d0、d7、d9 适体与金体积优化在制备aunps@ ploya
n
‑
aptamer@cy3
‑
dna纳米结构时，aunps和ploya
n
‑
aptamer之间的浓度比特别重要。如果aunps浓度太大，会导致大部分cy3被多余的aunps所猝灭。如果ploya
n
‑
aptamer的浓度太大，则可能会导致ploya
n
‑
aptamer自身发生杂交，或者aunps表面完全被ploya
n
‑
aptamer单链覆盖，这将不利于aunps@ ploya
n
‑
aptamer@cy3
‑
dna纳米结构的制备。
34.本申请选择ploya
n
长度分别为0nm(polya0‑
aptamer)，7nm(polya
21
‑
aptamer)和9nm(polya
27
‑
aptamer)，固定适体的体积为10 μl 5 μm，改变纳米金的体积，探究纳米金和适体的最优浓度比。如图3(a) (c) (e)为三种不同厚度隔离层所构建传感器的荧光光谱图，观察可得纳米金体积均为5 μl时荧光强度最高。取图3(a) (c) (e)中565nm处的荧光强度作图3(b) (d) (f)，三种不同长度ploya
n
所构建的纳米结构荧光强度均随aunps体积增大然后减少，当aunps体积为5 μl时荧光强度最大。所以核酸适体与纳米金溶液的体积为2：1时，所制备的纳米结构荧光强度最高。
35.2、polyan长度对荧光强度的影响如图4(a)所示，aunps@ ployan
‑
aptamer@cy3
‑
dna纳米结构的荧光强度随ployan长度的变化而变化。取图4(a)中565nm波长处的荧光强度作图4(b)，当ployan的长度从0nm增加到7nm时，呈现出上升的趋势，之后增加到10nm时，纳米材料的荧光强度开始下降，可知在7nm时纳米材料的荧光强度最大。为了获得高灵敏度的传感器，选择ploya
n
长度为7nm最好。
36.通过以上对传感器制备工艺的优化，选择核酸适体与纳米金的体积为2：1以及隔离层polyan长度为7nm时制备传感器工作溶液，此时传感器的发光性能最佳，有利于传感器的检测性能分析。
37.实施效果例1：胰岛素检测取上述工作溶液并分成6份儿，分别加入体积为6 μl，浓度最后分别为0.2 nm、1 nm、2 nm、10 nm、20 nm、40 nm的ins待测物溶液，用10 mm pbs缓冲液将溶液的总体积定容至600 μl，利用荧光分光光度计对含有以上不同ins浓度的aunps@ ploya
n
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aptamer@cy3
‑
dna纳米偶连体进行荧光检测，记录并使用origin软件描绘出曲线，测得不同ins浓度下的荧光光谱图如图5(a)所示，传感器的荧光强度随ins浓度的增加而逐渐升高。取520nm波长处的荧光强度作峰值图如图5(b)所示，观察可得在ins 0.2 nm
‑
40 nm范围内，所加待测物的浓度与溶液荧光强度之间具有良好的线性关系，线性方程为y=5.4x+643.17，相关系数为0.94。
38.实施效果例2：传感器特异性分析特异性是评价传感器检测性能的重要参数，特别是在复杂环境的生物样品中。为了验证该传感器对ins的特异性，本实验选择了牛血清白蛋白(bsa)、nacl、尿素(urea)、氨苄西林(amp)和生物素(d
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biotin)作为干扰物。如图6所示，当加入相同浓度(2nm)的目标物时，牛血清白蛋白(bsa)等干扰物对传感器造成的影响较小，而ins的加入使该传感器反映强烈，表明了该传感器对ins具有良好的特异性。
39.实施效果例2：传感器特异性分析为了评估构建的荧光适体传感器在实际样品中检测ins的可行性，本章在含有10%的缓冲液中进行了加标回收率实验。如图7(b)所示，为真实血清中每个浓度平均值（n=3）的拟合曲线与原始缓冲液拟合曲线之比，可得两条拟合曲线相似度很高。观察表2可知，所有的样品回收率均在98%和101%范围内，rsd在六个浓度水平内均低于4%。以上结果表明本章所构建的荧光适体传感器在检测真实人体血清中的胰岛素具有很高的重复性，且具有很高的精密性。证明本章所构建的适体传感器可用于实际复杂生物样品中的ins检测。
40.相对标准偏差(relative standard deviation，rsd)的大小可以体现出该传感器在不同环境中检测结果的精密度。因此，本实验以缓冲液中ins的测量浓度作为对比，计算ins在血清中的rsd，计算公式为：其中为血清中测量三次ins浓度的平均值，sd为标准偏差。
41.表2 真实人体血清中对ins的检测n=3以上检测结果得出荧光增强型适体传感器对ins的线性检测范围为0.2nm
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40nm，线性拟合公式为y=5.4x+643.17，线性相关系数为0.94。另外在牛血清白蛋白(bsa)等干扰检测中，该传感器对atp的特异性良好。另外，该传感器在真实人体血清中的回收率误差在2%上下浮动，且rsd在六个浓度水平内均低于4%，证明了该传感器可用实际生物样品中ins的检测。
42.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精
神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。