一种醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法与流程

1.本发明属于药物成分分析检测技术领域，涉及一种醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法，具体涉及一种采用高效液相色谱法分析测定醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的方法。


背景技术：

2.过敏性皮炎是生活中常见的一种皮肤病，由人体接触到特定过敏源而引起皮肤发痒、红肿、脱皮、风团等病症，它是由ige介导的i型变态反应。
3.糖皮质激素类药物可被使用于治疗过敏性皮炎，常见的糖皮质激素类药物种类繁多，有甲泼尼松、丙酸倍氯米松、倍他米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松、曲安奈德、醋酸曲安奈德等。它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，是机体应激反应最重要的调节激素，也是临床上使用最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂。具有抗炎、抗过敏、抗休克、抗毒、非特异性抑制免疫等多种作用，可以防止和阻止免疫性炎症反应和病理性免疫反应的发生，对任何类型的变态反应性疾病几乎都有效。
4.自1952年由sulzbergle首次使用人工合成糖皮质激素—氢化可的松软膏治疗过敏性皮肤病取得显著疗效以来，糖皮质激素在过敏性皮肤病中的应用已经有许多的进展。逐渐局部外用糖皮质激素制剂成为异位性皮炎、湿疹、药疹和接触性皮炎的主要治疗药物。
5.在曲安奈德的结构上进行修饰得到的醋酸曲安奈德，是目前补充糖皮质激素常见的药物之一，其作用效果与氢化可的松相似，但抗炎效果却为氢化可的松的5～20倍，该物质的常见剂型有注射剂、乳膏等，是临床上不可缺少的药物。
6.由于糖皮质激素活性较高，故治疗过敏性皮炎的外用糖皮质激素的制剂含量都非常低，且制剂基质复杂，存在杂质检测易受基质干扰，质量较难控制等问题，目前尚未有醋酸曲安奈德乳膏的有关物质检测方法。


技术实现要素：

7.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法，采用优化条件的前处理和hplc检测方法，能够使目标组分和干扰物有效分离，准确地测定醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德含量，实现了对醋酸曲安奈德乳膏产品中干扰物的控制，保证了醋酸曲安奈德乳膏的质量。
8.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法，包括以下步骤：
9.1)供试品溶液的制备：称取醋酸曲安奈德乳膏样品，加入稀释剂萃取、冷却、定容，再摇匀、冷冻离心、过滤，取续滤液作为供试品溶液；
10.2)对照溶液的制备：移取供试品溶液，加入稀释剂稀释定容、摇匀作为对照溶液；
11.3)系统适用性溶液的制备：取醋酸曲安奈德对照品、曲安奈德对照品，加入稀释剂溶解并定容，摇匀，得到系统适用性溶液；
12.4)辅料干扰物溶液：取辅料干扰物的对照品，加入稀释剂并定容摇匀，得到辅料干扰物溶液，其中，所述辅料干扰物为玫瑰香精；
13.5)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液、对照溶液、系统适用性溶液、辅料干扰物溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照溶液、系统适用性溶液、辅料干扰物溶液的液相色谱图进行比较，确定供试品溶液中醋酸曲安奈德、曲安奈德、辅料干扰物成分，再根据相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中醋酸曲安奈德、曲安奈德成分的含量。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
15.本发明提供的一种醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法，为醋酸曲安奈德乳膏中有关物质控制提供了可靠的检测方法，采用优化反应条件的高效液相方法，进行醋酸曲安奈德、曲安奈德及其干扰物的检测，实现一次样品分析，同时完成定性和醋酸曲安奈德、曲安奈德的定量分析。
16.本发明提供的方法筛选出了有关物质的萃取剂，基本可以将所有杂质及其有效成分萃取而出。
17.本发明提供的方法简化了流动相组成，配制简便，改变梯度，优化了梯度洗脱条件，使干扰物和目标组分保持较好的分离度和峰型，检测方法简捷，分析灵敏度高，结果准确。经过方法耐用性及验证方法合理可靠。
附图说明
18.图1为实施例1检测的hplc色谱图。
19.图2为实施例2检测的hplc色谱图。
20.图3为对比例5检测的hplc色谱图。
21.图4为对比例6检测的hplc色谱图。
22.图5为对比例7检测的hplc色谱图。
23.图6为对比例8检测的hplc色谱图。
24.图7为对比例9检测的hplc色谱图。
25.图8为对比例10检测的hplc色谱图。
26.图9为对比例11检测的hplc色谱图。
27.图10为干扰物在主峰前后分离的检测的hplc色谱图(玫瑰香精定位图)。
具体实施方式
28.本发明的发明人经过大量实验发现，通过寻找合适的醋酸曲安奈德乳膏有关物质萃取剂，将醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德与其他杂质萃取分离，并研究了醋酸曲安奈德乳膏各条件下的稳定性，并制定杂质限度。
29.本发明提供一种醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法，包括以下步骤：
30.1)供试品溶液的制备：称取醋酸曲安奈德乳膏样品，加入稀释剂萃取、冷却、定容，
再摇匀、冷冻离心、过滤，取续滤液作为供试品溶液；
31.2)对照溶液的制备：移取供试品溶液，加入稀释剂稀释定容、摇匀作为对照溶液；
32.3)系统适用性溶液的制备：取醋酸曲安奈德对照品、曲安奈德对照品，加入稀释剂溶解并定容，摇匀，得到系统适用性溶液；
33.4)辅料干扰物溶液：取辅料干扰物的对照品，加入稀释剂并定容摇匀，得到辅料干扰物溶液，其中，所述辅料干扰物为玫瑰香精；
34.5)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液、对照溶液、系统适用性溶液、辅料干扰物溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照溶液、系统适用性溶液、辅料干扰物溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中醋酸曲安奈德、曲安奈德成分的含量。
35.本发明所提供的醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法中，步骤1)中是关于供试品溶液的制备：称取醋酸曲安奈德乳膏样品，加入稀释剂萃取、冷却、定容，再摇匀、冷冻离心、过滤，取续滤液作为供试品溶液。
36.进一步的，步骤1)中，所述醋酸曲安奈德乳膏样品加入的质量g，与稀释剂加入的体积ml之比可以为2.5:14～2.5:16、2.5:14～2.5:15、或2.5:15～2.5:16等。优选地，所述醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德乳膏样品加入的质量(g)，与甲醇溶液加入的体积(ml)之比为2.5:15。
37.进一步的，步骤1)中，所述稀释剂选自甲醇。此处甲醇是作为萃取剂。
38.进一步的，步骤1)中，醋酸曲安奈德乳膏样品和稀释剂混合的方式可以是本领域技术人员公知的，例如可以是振荡，更例如可以是手动振荡或者通过仪器振荡摇晃等，振荡的时间没有具体限定。
39.进一步的，步骤1)中，所述萃取的条件为：萃取的温度为60～80℃，时间为2～5min。在一些实施方式中，所述萃取的温度还可以为60～70℃，或70～80℃等。萃取时间还可以为2～3min、3～5min等。优选的，所述超声提取的条件为：萃取温度为80℃，萃取时间为2min。通常情况下，如果温度在60℃溶解时间需要相应长些，萃取时间为5min，80℃下萃取溶解时间较短。而超过90℃时，虽然可以快速溶解，但是高温会使得曲安奈德含量增加，影响检测结果。
40.进一步的，步骤1)中，所述冷却至室温。所述室温为20～25℃。
41.进一步的，步骤1)中，所述定容为用甲醇稀释定容。
42.进一步的，步骤1)中，所述冷冻离心的条件为：离心温度可以为(-5)～0℃、(-5)～(-3)℃、或(-3)～0℃等。离心时间可以为10min～30min、10min～20min、20min～30min、10min～15min、15min～20min、20min～25min、或25min～30min等。离心转速可以为8000rpm～10000rpm、8000rpm～9000rpm、或9000rpm～10000rpm等。
43.进一步的，步骤1)中，所述过滤为滤膜过滤(例如可以是尼龙)。所述滤膜过滤采用的滤膜可以为0.22μm～0.45μm的滤膜，所述滤膜的孔径也可以为0.22μm～0.30μm、0.30μm～0.40μm、或0.40μm～0.45μm等。优选地，步骤1)中，所述续滤液是指：过滤膜时，初滤液后的溶液即为续滤液。
44.进一步的，步骤1)中，所述供试品溶液中醋酸曲安奈德的浓度可以为0.05mg/ml～0.2mg/ml、0.05mg/ml～0.1mg/ml、0.1mg/ml～0.15mg/ml、或0.15mg/ml～0.2mg/ml等。
45.本发明所提供的醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法中，步骤2)是对照溶液的制备：移取供试品溶液，加入稀释剂溶解并定容、摇匀作为对照溶液。
46.进一步的，步骤2)中，移取1ml供试品溶液，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。优选的，精密移取供试溶液1ml置于100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
47.进一步的，步骤2)中，稀释剂选自甲醇。
48.本发明所提供的醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法中，步骤3)中，系统适用性溶液的制备：取醋酸曲安奈德对照品、曲安奈德对照品，加入稀释剂溶解并定容，摇匀，得到系统适用性溶液。
49.进一步的，步骤3)中，进一步地，曲安奈德对照品和醋酸曲安奈德对照品质量比为1：(0.75～1)。优选为1：1。曲安奈德对照品的质量可以为4～8mg，4～6mg，或6～8mg等，优选为5mg。醋酸曲安奈德对照品的质量可以为3～8mg，3～5mg，或5～8mg等，优选为5mg。将前述质量范围内的曲安奈德对照品、醋酸曲安奈德对照品溶于10ml的容量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得系统适用性溶液。其中，曲安奈德对照品的浓度为0.4～0.8mg/ml、0.4～0.6mg/ml、或0.6～0.8mg/ml等；优选为0.5mg/ml；醋酸曲安奈德对照品的浓度为0.3～0.6mg/ml、0.3～0.4mg/ml、0.4～0.5mg/ml、或0.5～0.6mg/ml等。
50.进一步的，步骤3)中，稀释剂选自甲醇。
51.进一步的，步骤3)中，所述醋酸曲安奈德的cas号为3870-07-3。所述醋酸曲安奈德为triamcinolone acetonide 21-acetate。所述醋酸曲安奈德的分子式为c
26h33
fo7。
52.进一步的，步骤3)中，所述曲安奈德的cas号为76-25-5。所述曲安奈德为triamcinolone acetonide。所述曲安奈德的分子式为c
24h31
fo6。
53.进一步地，步骤3)中，所述系统适用性溶液选自单一浓度的曲安奈德、醋酸曲安奈德的混合溶液或一系列不同浓度的曲安奈德、醋酸曲安奈德的混合溶液中的一种。进一步优选地，所述系统适用性溶液为单一浓度的曲安奈德、醋酸曲安奈德的混合溶液。
54.本发明所提供的醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法中，步骤4)中，辅料干扰物溶液：取辅料干扰物的对照品，加入稀释剂并定容摇匀，得到辅料干扰物溶液。辅料干扰物溶液可以对曲安奈德主峰前后的干扰峰进行定性。
55.进一步的，步骤4)中，所述辅料干扰物的通用名称为玫瑰香精，所述辅料干扰物的中文名称为玫瑰香精。进一步的，步骤3)中，所述辅料干扰物玫瑰香精(在主峰前后的双峰详见图10)。
56.进一步的，步骤4)中，玫瑰香精的质量可以为15～25mg、15～20mg、20～25mg等。优选的，玫瑰香精的质量为20mg。玫瑰香精的浓度为0.6～1.0mg/ml，优选的，玫瑰香精的浓度为0.8mg/ml。
57.进一步的，步骤4)中，稀释剂选自甲醇。
58.本发明所提供的醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法中，步骤5)是检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照溶液、系统适用性溶液的液相色谱图进行比较，确定供试品溶液中醋酸曲安奈德、曲安奈德、辅料干扰物成分，再根据相对保留时
间和色谱峰面积，确定供试品溶液中醋酸曲安奈德、曲安奈德成分的含量。
59.进一步的，步骤5)中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：waters c18xterrams色谱柱，250mm
×
4.6mm，5μm；检测波长可以为238nm～242nm、238nm～240nm、或240nm～242nm等。流速可以为0.9～1.1ml/min、0.9～1.0ml/min、或1.0～1.1ml/min等。流动相：水-乙腈，其中，a相为水与乙腈的体积比可以为63～65：35～37、63～64：35～37、64～65：或35～37等。b相为水-乙腈，其中，b相为水与乙腈的体积比为35～37：63～65、35～36：64～65、或36～37：63～64等。分析时间：55min；梯度洗脱。进一步的，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，250mm
×
4.6mm，5μm；检测波长：240nm；流速：1.0ml/min；流动相：水-乙腈，其中，a相为水-乙腈，水与乙腈的体积比为35:65，b相为水-乙腈；分析时间：55min；梯度洗脱。
60.更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为(见表1)：
61.0-10min，a相：b相体积比为100：0～100：0；
62.10-45min，a相：b相体积比为100：0～0：100；
63.45-50min，a相：b相体积比为0：100～0：100；
64.50-55min，a相：b相体积比为0：100～100：0。
65.表1.高效液相梯度表
66.时间(min)a(％)b(％)01000101000450100500100551000
67.进一步的，步骤5)中，所述高效液相色谱法还包括有以下色谱条件：柱温可以为39～41℃、39～40℃、或40～41℃等。柱温优选为40℃；进样量可以为10～30μl、10～20μl、或20～30μl等。进样量优选为20μl。
68.进一步的，步骤5)中，所述确定供试品溶液中曲安奈德、醋酸曲安奈德的成分含量的方法为自身对照法。制备试验溶液：精密量取供试品溶液、对照溶液、系统适用性溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按自身对照法计算供试品溶液中待测物质的含量，所述自身对照法是指：按各品种项下的规定，精密称取供试品，配制成供试品溶液，稀释后得到对照溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积。
69.以自身对照法计算：
[0070][0071]
其中：
[0072]a样
—供试品溶液中杂质峰面积；
[0073]a对
—对照溶液中主峰面积；可得到相应曲安奈德、醋酸曲安奈德乳膏及其他杂质的含量。
[0074]
杂质限度：供试品溶液色谱图中如有与系统适用性溶液中曲安奈德峰保留时间一致的杂质峰，按自身对照法以峰面积计算，不得过5.0％，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积1.0％，其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2.5％，供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积的0.05倍(0.05％)的色谱峰忽略不计，并扣除与空白基质溶液中保留时间一致的杂质峰。
[0075]
如上所述，本发明提供的一种醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物的测定方法，为醋酸曲安奈德乳膏中有关物质控制提供了可靠的检测方法，采用优化反应条件的高效液相方法，进行醋酸曲安奈德、曲安奈德及其干扰物的检测，实现一次样品分析，同时完成定性和醋酸曲安奈德、曲安奈德的定量分析。包括如下有益效果：
[0076]
本发明提供的方法筛选出了有关物质的萃取剂，基本可以将所有杂质及其有效成分萃取而出。
[0077]
本发明提供的方法简化了流动相组成，配制简便，改变梯度，优化了梯度洗脱条件，使干扰物和目标组分保持较好的分离度和峰型，检测方法简捷，分析灵敏度高，结果准确。经过方法耐用性及验证方法合理可靠。
[0078]
本发明提供的方法，1)专属性方面，空白溶液对供试品溶液色谱图中主峰无干扰，供试品溶液中，主峰与相邻峰之间最小分离度为1.7(≥1.5)；主峰与曲安奈德峰分离度大于10；主峰理论塔板数7838(≥5000)。
[0079]
2)检测限与定量限，检测限信噪比(s/n)约为3，定量限信噪比(s/n)约为10，曲安奈德面积rsd≤10％(n＝6)。
[0080]
3)线性关系及校正因子计算，曲安奈德线性方程为：y＝40625x+0.018，曲安奈德在0.010113μg/ml-2.0226μg/ml的范围内，线性相关系数0.9999(r≥0.995)；醋酸曲安奈德线性方程为：y＝37826x-0.2424；在0.009972μg/ml-1.9944μg/ml的范围内，线性相关系数0.9998(r≥0.995)。
[0081]
4)重复性，供试品溶液中曲安奈德含量rsd≤8％；其余杂质和的含量rsd≤8％(n＝6)。
[0082]
5)准确度(回收率)，曲安奈德的回收率在80％～115％，rsd≤10％；(n＝9)。
[0083]
6)溶液稳定性：对照溶液：在室温下4.5h内稳定，在(5℃)下61.5h内稳定。对照溶液的rsd≤2％。供试品溶液：除曲安奈德外其他杂质基本稳定，其余杂质和峰面积rsd≤8％。溶液中曲安奈德含量随时间而增大，室温下2h内稳定，rsd≤8％。
[0084]
7)耐用性：测定条件参数的微小变动对测定结果易产生显著影响。
[0085]
本发明提供的方法，使干扰物和目标组分分离，有效地对醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德及辅料干扰物进行测定，实现了对醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德乳膏产品中含量和有关物质的控制，保证了醋酸曲安奈德乳膏的质量，并有利于产品质量监控，而且减少了传统流动相配制的复杂组分和配制工艺，降低成本，提高效率。
[0086]
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0087]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离
本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0088]
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
[0089]
1、试剂
[0090]
醋酸曲安奈德乳膏(上海正大通用药业股份有限公司)；甲醇(色谱级，默克公司)；醋酸曲安奈德对照品(纯度99.1％，中检所)、曲安奈德对照品(纯度98.8％，中检所)；玫瑰香精(上海思源香精香料有限公司)；乙腈(色谱纯，默克)；纯水(纯水机自制)
[0091]
2、仪器
[0092]
高效液相色谱仪(安捷伦公司，型号hplc-1220)；色谱柱(waters公司)
[0093]
实施例1
[0094]
1、实验部分
[0095]
1.1样品前处理
[0096]
供试品溶液的制备：称取醋酸曲安奈德乳膏样品2.5g，精密称定，置25ml量瓶，加甲醇15ml，80℃升温振荡溶解2min，冷却至室温后，稀释至刻度，摇匀，冰浴2h，0℃冷冻离心10min，过滤，取续滤液作为供试品溶液(醋酸曲安奈德：0.1mg/ml)。
[0097]
对照溶液的制备：精密移取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
[0098]
系统适用性溶液：称量约5mg曲安奈德与5mg醋酸曲安奈德于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；(曲安奈德：0.5mg/ml；醋酸曲安奈德：0.5mg/ml)。
[0099]
干扰物定位溶液:称量约20mg辅料玫瑰香精于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(玫瑰香精：0.8mg/ml)
[0100]
1.2色谱条件
[0101]
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：waters c18 xterra ms(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱；检测波长：240nm；流速：1.0ml/min；流动相：水-乙腈，其中，a相为水-乙腈(水与乙腈的体积比为35:65)，b相为水-乙腈(水与乙腈的体积比为65:35)；分析时间：55min；梯度洗脱。
[0102]
梯度洗脱的具体程序为(见表1)：
[0103]
0-10min，a相：b相体积比为100：0～100：0；
[0104]
10-45min，a相：b相体积比为100：0～0：100；
[0105]
45-50min，a相：b相体积比为0：100～0：100；
[0106]
50-55min，a相：b相体积比为0：100～100：0。
[0107]
高效液相色谱法还包括有以下色谱条件：柱温：40℃；进样量：20μl。高效液相色谱法分析结果见图1。醋酸曲安奈德出峰时间为25.498；曲安奈德出峰时间为10.114；玫瑰香精出峰时间为峰1为24.753，峰2为26.322。此梯度下，醋酸曲安奈德与干扰物玫瑰香精分离很好。
[0108]
1.3测定
[0109]
采用自身对照法：先配制一定浓度的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，再将由供试品溶液稀释获得的对照溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，即得供试品溶液中醋酸曲安奈德、曲安奈德及其他杂质含量。
[0110]
2、结果与讨论
[0111]
2.1醋酸曲安奈德乳膏有关物质测定方法的线性关系
[0112]
曲安奈德线性贮备液(200％)：分别取曲安奈德对照品约2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，移取1ml至100ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀作为杂质线性贮备液；(曲安奈德：0.002mg/ml)
[0113]
精密量取曲安奈德线性贮备液适量定量稀释制成对应杂质限度浓度水平的loq、50％、80％、100％、150％、200％的6份线性溶液，每个浓度配制一份。
[0114]
曲安奈德线性溶液：配制过程如表2，均用稀释剂稀释至指定刻度。
[0115]
表2 曲安奈德线性溶液配置
[0116]
水平贮备液体积(ml)量瓶(ml)目标浓度(μg/ml)l1(loq)12000.01l2(50％)2.5100.5l3(80％)10250.8l4(100％)5101l5(150％)15201.5l6(200％)nana2
[0117]
醋酸曲安奈德线性贮备液(200％)：分别取醋酸曲安奈德对照品约2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，移取1ml至100ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀作为杂质线性贮备液；(醋酸曲安奈德：0.002mg/ml)
[0118]
醋酸曲安奈德溶液：精密量取醋酸曲安奈德线性贮备液适量定量稀释制成供试品浓度水平的loq、50％、80％、100％、150％、200％的6份线性溶液，每个浓度配制一份。
[0119]
醋酸曲安奈德线性溶液：配制过程如表3，均用稀释剂稀释至指定刻度。
[0120]
表3 醋酸曲安奈德溶液配置
[0121]
水平贮备液体积(ml)量瓶(ml)目标浓度(μg/ml)loq12000.01l2(50％)2.5100.5l3(80％)10250.8l4(100％)5101l5(150％)15201.5l6(200％)nana2
[0122]
采用1.2的hplc检测条件，进行高效液相色谱仪分析，测定并计算醋酸曲安奈德、曲安奈德相关系数和线性范围。具体结果见表4。
[0123]
表4 线性方程
[0124][0125]
注：y为峰面积，x为浓度
[0126]
根据表4可知，标准回归方程以色谱峰面积为纵坐标(y)，成分浓度为横坐标(x)，同时，线性溶液中醋酸曲安奈德、曲安奈德在一定浓度的线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的r2均大于0.9990。
[0127]
2.2回收率
[0128]
曲安奈德储备液：称量2mg曲安奈德对照品于200ml容量瓶中，甲醇溶解，稀释定容摇匀，备用。
[0129]
醋酸曲安奈德储备液：称量25mg醋酸曲安奈德对照品于25ml容量瓶中，甲醇溶解，稀释定容摇匀，备用。
[0130]
准确度溶液配制：准备9份2g空白辅料于9个20ml容量瓶中，12ml甲醇，80℃水浴2min溶解，冷却至室温定容，冷冻离心后，过滤转移至20ml容量瓶中。
[0131]
表5 准确度溶液配制
[0132][0133]
表6 加样回收率结果
[0134][0135][0136]
由表6可知，高、中、低三个浓度，曲安奈德加样平均回收率在80％～115％，rsd≤10％；(n＝9)。符合要求，其测定结果的回收率良好。
[0137]
2.3重复性
[0138]
取同一批醋酸曲安奈德乳膏样品6份，按上述1.1进行供试品溶液前处理并进样测
试，测定并计算醋酸曲安奈德乳膏中醋酸曲安奈德、曲安奈德、峰面积及含量，重复性具体结果见表7。
[0139]
表7 重复性考察结果
[0140][0141]
结果表明，醋酸曲安奈德、曲安奈德、的相对峰面积rsd小于等于8％，说明该方法的重复性良好。
[0142]
2.4稳定性
[0143]
醋酸曲安奈德乳膏稳定性研究(光照、酸碱、氧化、高温)-对原料及乳膏样品进行强降解试验，使用对照、空白进行杂质定位，根据稳定性试验确定杂质限度及存放环境条件。
[0144]
2.4.1破坏条件如表8
[0145]
表8
[0146][0147][0148]
经综合评价，选择按下列破坏条件进行强制降解试验。
[0149]
未破坏样品溶液：取乳膏约2.5g置于25ml容量瓶，15ml甲醇，80℃振荡溶解2分钟，冷却后定容摇匀，冰浴2h后，取续滤液进样。
[0150]
酸破坏样品溶液：取乳膏约2.5g置于25ml容量瓶，15ml甲醇，80℃振荡溶解2分钟，加入0.01mol/l盐酸2ml，2h后加入0.01mol/l氢氧化钠2ml后定容摇匀，冰浴2h后，取续滤液
进样。
[0151]
碱破坏样品溶液：取乳膏约2.5g置于25ml容量瓶，15ml甲醇，80℃振荡溶解2分钟，加入0.01mol/l氢氧化钠2ml，30min后加入0.01mol/l盐酸2ml后定容摇匀，冰浴2h后，取续滤液进样。
[0152]
氧化破坏样品溶液：取乳膏约2.5g置于25ml容量瓶，15ml甲醇，80℃振荡溶解2分钟，加入30％h2o22ml，2h后定容摇匀，冰浴2h后，取续滤液进样。
[0153]
高温破坏样品溶液：取乳膏约2.5g置于25ml容量瓶，15ml甲醇，80℃振荡溶解2分钟，置95℃水浴加热1h，冰浴2h后，取续滤液进样。结果如表9。
[0154][0155][0156]
如表9所示：结果表明醋酸曲安奈德原料及乳膏在酸碱性及高温、光照条件下较不稳定，在高湿条件下较稳定。高温、酸碱条件利于酯基的断裂，促进水解得到曲安奈德，同时也可从以上数据得出，醋酸曲安奈德对光敏感，在处理样品时或存放时，应避光保存。
[0157]
2.4.2溶液稳定性
[0158]
表10 供试品溶液室温下稳定性测试结果
[0159][0160]
从表10数据可知，在测试过程中发现，活性物质曲安奈德在测试过程中，含量不增加，可能由于在过程中由醋酸曲安奈德不断水解得到。
[0161]
表11 供试品溶液(5℃)稳定性测试结果
[0162][0163][0164]
从表11数据可知，低温条件有利于制剂稳定。
[0165]
2.5耐用性
[0166]
较小范围的调整色谱条件(柱温变化5℃、流速变化20％等)，进行耐用性试验。
[0167]
对比例1
[0168]
具体步骤参照实施例1，不同之处：柱温为35℃。
[0169]
对比例2
[0170]
具体步骤参照实施例1，不同之处：柱温为45℃。
[0171]
对比例3
[0172]
具体步骤参照实施例1，不同之处：流速为0.8ml/min。
[0173]
对比例4
[0174]
具体步骤参照实施例1，不同之处：流速为1.2ml/min。
[0175]
实施例1、对比例1、对比例2不同柱温有关物质的测试，结果见下表12。
[0176]
表12 不同柱温有关物质测试结果
[0177][0178]
从表12可知：柱温小范围的变化对杂质的分离度有影响，色谱图中各杂质峰的保留时间的略有差别，峰面积稍有变化；说明在不同柱温同样会造成辅料干扰。
[0179]
实施例1、对比例3和对比例4不同柱温测定有关物质，结果见表13。
[0180]
表13 不同柱温有关物质测定结果
[0181][0182][0183]
从表13可以看出：流动相流速小范围的变化，会引起色谱图中各杂质峰保留时间的变化及杂质检出，除曲安奈德外其他杂质含量变化较少，由于辅料在主峰前后都有较大出峰，流速改变都造成辅料对主峰的干扰。
[0184]
2.6方法运用-生产批检样
[0185]
表14
[0186]
平行实验曲安奈德rrt0.92rrt1.14rrt1.39总杂实施例10.830.200.06/0.26平行实验11.350.210.060.070.28平行实验21.100.210.07/0.27
[0187]
曲安奈德的相对保留时间为0.4，小于0.05％主峰面积忽略不计，活性物质曲安奈德成分不得过5％，其他单个杂质计算不得过1％，各杂质之和不大于2.5％。
[0188]
对比例5
[0189]
与实施例1基本相同，区别在于，梯度洗脱的具体程序为如表15。
[0190]
表15
[0191]
时间(min)流动相a流动相b01000151000450100500100551000
[0192]
从图2可知，醋酸曲安奈德出峰时间为27.978；曲安奈德出峰时间为9.862；干扰物玫瑰香精峰1为26.703，峰2为28.453。此梯度下，醋酸曲安奈德受玫瑰香精干扰。
[0193]
对比例6
[0194]
与实施例1基本相同，区别在于，梯度洗脱的具体程序为如表16。
[0195]
表16
[0196]
时间(min)流动相a流动相b01000171000400100500100551000
[0197]
从图3可知，醋酸曲安奈德出峰时间为28.396；曲安奈德出峰时间为9.841；玫瑰香精出峰时间峰1为27.125，峰2为28.800。此梯度下，醋酸曲安奈德受玫瑰香精干扰。
[0198]
对比例7
[0199]
与实施例1基本相同，区别在于，梯度洗脱的具体程序为如表17。
[0200]
表17
[0201]
时间(min)流动相a流动相b01000161000450100500100551000
[0202]
从图4可知，醋酸曲安奈德出峰时间为28.502；曲安奈德出峰时间为9.860；玫瑰香精出峰时间峰1为27.098，峰2为28.959此梯度下，醋酸曲安奈德受玫瑰香精干扰。
[0203]
对比例8
[0204]
与实施例1基本相同，区别在于，梯度洗脱的具体程序为如表18。
[0205]
表18
[0206]
时间(min)流动相a流动相b01000141000450100
500100551000
[0207]
从图5可知，醋酸曲安奈德出峰时间27.401；曲安奈德出峰时间为9.867；玫瑰香精出峰时间峰1为26.238，峰2为27.947。此梯度下，醋酸曲安奈德受玫瑰香精干扰。
[0208]
对比例9
[0209]
与实施例1基本相同，区别在于，梯度洗脱的具体程序为如表19。
[0210]
表19
[0211]
时间(min)流动相a流动相b01000131000450100500100551000
[0212]
从图6可知，醋酸曲安奈德出峰时间26.849；曲安奈德出峰时间为9.874；玫瑰香精出峰时间峰1为25.799，峰2为27.471。此梯度下，醋酸曲安奈德受玫瑰香精干扰。
[0213]
对比例10
[0214]
与实施例1基本相同，区别在于，梯度洗脱的具体程序为如表20。
[0215]
表20
[0216]
时间(min)流动相a流动相b01000151000430100500100551000
[0217]
从图7可知，醋酸曲安奈德出峰时间27.731；曲安奈德出峰时间为9.886；玫瑰香精出峰时间峰1为26.525，峰2为28.220此梯度下，醋酸曲安奈德受玫瑰香精干扰。
[0218]
对比例11
[0219]
与实施例1基本相同，区别在于，梯度洗脱的具体程序为如表21。
[0220]
表21
[0221][0222][0223]
从图8可知，醋酸曲安奈德出峰时间26.541；曲安奈德出峰时间为10.066；玫瑰香精出峰时间峰1为25.584，峰2为27.211。此梯度下，醋酸曲安奈德受玫瑰香精干扰。
[0224]
对比例12
[0225]
与实施例1基本相同，区别在于，梯度洗脱的具体程序为如表22。
[0226]
表22
[0227]
时间(min)流动相a流动相b0100071000450100500100551000
[0228]
从图9可知，醋酸曲安奈德出峰时间22.63；曲安奈德出峰时间为10.014；玫瑰香精出峰时间峰1为22.327，峰2为23.813。此梯度下，醋酸曲安奈德受玫瑰香精干扰。
[0229]
对比例13
[0230]
与实施例1基本相同，区别在于，萃取剂为乙腈。
[0231]
对比例14
[0232]
与实施例1基本相同，区别在于，萃取剂为60％甲醇。
[0233]
对比例15
[0234]
与实施例1基本相同，区别在于，萃取剂为80％甲醇。
[0235]
萃取剂的选择对基质分离的影响结果如表23。
[0236]
表23
[0237]
名称实验结果实施例1实验结果较好对比例13乳膏溶解性较好，基质不易析出，基线易出现异常鼓包。对比例14基质析出较多，针式滤膜无法过滤，无法检测。对比例15基质易于析出，但无法过滤。
[0238]
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0239]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。