一种基于高分子钝化自聚型薄膜涂层改性的检测基底及配套检测方法和设备

1.本发明属于生物传感领域，涉一种基于高分子钝化型自聚型薄膜涂层改性和纳米微球信号放大的免疫传感方法及配套装置，尤其是一种基于高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底及配套检测设备和方法，此外，根据不同的检测对象对方法灵敏度的不同要求，本发明还涉及一种自聚合型纳米微球作为载体的信号放大策略。整个检测过程中，只需准备好相应试剂耗材放入自动送料盘位置，即可通过程序控制对不同检测对象的自动化检测。


背景技术：

2.对于致病菌、真菌毒素、抗生素、生物标志物、重金属等危害因子进行有效的高灵敏检测在食品安全、疾病诊断、环境监测等方面具有重要意义。尽管基于光学、电化学、磁性等信号读出方式的生物传感器被开发且应用于检测领域，但是酶联免疫吸附测定法(elisa)由于其稳定性好、重现性强依旧是各种靶标检测最广泛使用的免疫分析方法，更是被视为标准方法。尽管如此，elisa在检测过程中仍有一定的不足：(1)在洗涤步骤中需要洗板操作，如果人工操作的话，就可能会导致因不同实验员的实验经验不同而对结果产生误差，如果是自动化操作则装置价格贵，限制其现场、快速检测的应用；(2)由于每步反应所需试剂不同，需要频繁地更换移液器枪头，增加了成本，同时也容易造成环境污染；(3)蛋白质与酶标板是通过蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的物理吸附结合的，这种物理吸附受分子量、等电点﹑浓度等影响，并且需要较高的包被浓度才能达到预期的实验结果，而生物识别分子价格昂贵，导致成本偏高；(4)elisa的灵敏度在应对日益提高的检测要求以及复杂基质的干扰时存在巨大的挑战。
3.若能将免疫反应载体直接置于自动化移液器表面，例如移液器枪头内部，因此重要的是如何有效的在移液器枪头内部高效简便的修饰抗体，分子自聚型薄膜涂层修饰枪头可通过化学共价键结合蛋白质，可以提高偶联效率，可大大降低包被蛋白浓度、节约枪头从而降低成本，但分子自聚型薄膜涂层活性太强易导致实际检测过程的高背景信号，因此我们在自聚型分子中加入一定钝化剂可有效地调节其活性从而降低实际检测的非特异性吸附及背景信号；利用移液器(枪头)的高精度配以自动化装置可实现自动化检测、避免实验差异性及更适用于现场检测；基于温和水热法合成的自聚合型纳米微球实现信号放大策略，根据需求获得不同灵敏度。经检索，目前尚未发现基于钝化型自聚型薄膜涂层实现高效的抗体包被、自聚合型纳米微球实现多种信号放大策略及适用于现场快速检测的自动化便携式检测设备的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为解决elisa在现场快速检测中洗涤操作复杂、成本高、灵敏度有限等问题，提供一种成本低、稳定性好、灵敏度和自动化程度高的钝化型自聚型薄膜涂层枪头为载体的分析模式，并以自聚合型纳米微球实现信号放大策略的移动自动化检测方法及
便携式检测设备。
5.本发明所提供的方法和装置，其工作原理如下：
6.多巴胺(da)是一种具有邻苯二酚和氨基的生物分子，可以在碱性条件下自聚合形成聚多巴胺(pda)，pda具有良好的稳定性和生物相容性，并易于作为表面改性剂附着在有机和无机材料的表面。同时，pda具有的广泛粘附性和二次反应性可以再次修饰生物分子从而固定生物识别分子，对抗体等蛋白质分子具有很好的粘附作用，其原因是pda表面具有很多基团，通过邻苯二酚基团实现高效化学偶联，避免了传统的酶标板表面和抗体的物理吸附作用，也避免了传统的化学偶联方法需要化学试剂，多步操作等缺点，聚多巴胺和抗体偶联只需要在常温下混匀，进而最大限度保障了抗体的活性。聚多巴胺纳米球(pda ns)可由氨水、乙醇及去离子水混合溶液在温和条件下低成本合成，具有出色的生物相容性和吸附性能。pdans可以富集hrp酶标抗体实现第一重信号放大，生物素-酪胺在辣根过氧化物酶(hrp)催化下被过氧化氢氧化产物迅速共价结合在固定相蛋白质上，可以结合大量链霉亲和素-hrp酶实现第二重信号放大。双重富集hrp酶催化tmb显色底物产生的不同颜色信号强度与靶标浓度相关，完成对靶标的定量分析。样品中含量高的待测物，则只需要聚多巴胺纳米球的信号放大或者单独的hrp-检测抗体就可以满足需要。因此通过本专利，可以根据不同待测物的要求实现精准检测。
7.一种基于高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底，所述检测基底为：在基底上修饰一层自聚型高分子薄膜涂层，该涂层将生物识别分子固定在基底上，制备得到修饰有特定抗原/抗体的检测基底。
8.优选地，所述自聚型高分子薄膜涂层的原料为多巴胺。
9.优选地，所述自聚型高分子薄膜涂层的原料还可以是壳聚糖。
10.优选地，所述基底上修饰一层自聚型高分子薄膜涂层的过程中，还加入了钝化剂，钝化剂为氨基化聚乙二醇或聚丙烯酰胺或聚乙烯胺。
11.优选地，所述基底为玻璃或纤维或石英或塑料。
12.进一步优选地，所述塑料的形状为枪头模型。
13.优选地，所述生物识别分子为能够与待测目标物发生竞争免疫反应的抗体及其抗原；或所述生物识别分子为能够与待测目标物发生双抗夹心免疫反应的包被抗体及其标记抗体。
14.所述基于高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底的制备方法，包括以下步骤：
15.1)基底进行置于多巴胺和氨基化聚乙二醇(peg-nh2)混合溶液并保持3小时、去离子水洗涤；
16.2)经过步骤1)处理的基底置于生物识别分子中37℃下温育2小时、pbst溶液洗涤；
17.3)经过步骤1)处理的基底置于牛血清蛋白中封闭操作，得到高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底。
18.优选地，所述步骤1)中，多巴胺和氨基化聚乙二醇(peg-nh2)混合溶液中，多巴胺浓度为5μg/ml，peg-nh2浓度为100μg/ml，h2o2浓度为0.2mol/l。
19.优选地，所述步骤2)中，pbst溶液中，pbs摩尔浓度为0.01m，吐温质量分数为0.05％；所述步骤3)中，所述牛血清蛋白的质量分数为8％。
20.一种基于高分子钝化型自聚型薄膜涂层改性的检测基底的检测设备，
21.该设备由箱体、反应液承载平台、移液器移动平台、控制系统、检测系统五部分组成；
22.箱体为具有保温材质的恒温保温箱；保温箱内侧壁有温控装置，可对整个反应过程提供所需恒温。
23.反应液承载平台上有由高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底和检测基底盒、检测系统和自动送料平台；
24.移液器移动平台上装有移液器，该移液器上装有由高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底；
25.控制系统由控制旋钮、触控屏两部分组成。
26.优选地，箱体为具有保温材质的恒温保温箱；保温箱内侧壁有温控装置，可对整个反应过程提供所需恒温；
27.检测基底盛放在检测基底盒上；检测系统为可对最终反应产物进行显色检测的光学相机；自动送料平台包括可最多进行若干次连续送料的旋转平台，旋转平台上有若干个盛放反应液的酶标板，旋转平台顺时针转动，从而实现反应液的自动进样；旋转平台后方设有废液池；反应液承载平台上下部有调平旋钮，可对反应液承载平台上进行手动调平；反应液承载平台上底部装有第一步进电机，第一步进电机通过带传动驱动承载平台实现y轴的前后移动。
28.优选地，该移液器移动平台两侧和移液器侧方分别设有第二步进电机、第三步进电机，移液器侧方的第二步进电机通过传送带传动实现移液器在x轴的左右移动，移液器移动平台两侧的第三步进电机通过蜗轮蜗杆传动实现移液器在z轴的上下移动。
29.优选地，控制系统通过触控屏接收操作人员发出的控制指令，控制相应继电器的触点关断和闭合，从而控制第一步进电机、第二步进电机、第三步进电机正反转，实现反应液承载平台上在y轴的移动、移液器在x轴和z轴的移动，控制系统可通过箱体上的温控装置实时调节反应温度，实现整个反应过程的温度控制，控制系统中的计时器可控制线性马达每次转动的时间间隔和旋转角度，实现反应液的自动进样，控制旋钮通过旋转和按压可实现对控制系统的手动选择和控制。
30.所述基于高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底或制备方法制备的基于高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底或检测设备用于目标物的检测方法，检测过程中，可采用hrp酶标抗体或者自聚合型纳米微球富集的hrp酶标抗体或者自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗探针结合酪胺放大系统。
31.优选地，自聚合型纳米微球材质为自聚合型纳米微球盐酸多巴胺微球或聚苯乙烯微球或磁性纳米四氧化三铁微球。
32.优选地，所述检测方法包括以下步骤：
33.s1：高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底吸入待测目标物进行生物反应，反应后排出溶液并洗涤检测基底；
34.s2：根据不同的检测对象对灵敏度的不同要求，采用不同的信号放大探针a、b、c进行反应，其中a为加入hrp酶标抗体，b为自聚合型纳米微球富集的hrp酶标抗体，c为自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗探针结合酪胺放大系统；生物反应后，洗涤去除非特异性吸附的信号放大探针，然后吸入信号产生底物(tmb显色底物)进行颜色变化后予以硫酸终止
反应，对最终颜色进行自动拍照并以颜色分析颜色强度，黄色强度与待测目标物浓度相关，完成目标物的检测。
35.优选地，所述步骤s1所述待测目标物的生物反应时间为30min。
36.优选地，所述步骤s2hrp酶标抗体或者自聚合型纳米微球富集的hrp酶标抗体时，反应时间为30min。
37.优选地，所述步骤s2为自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗探针结合酪胺放大系统时：在加入自聚合型纳米微球富集的hrp酶标抗体洗涤后，加入生物素酪胺稀释液反应，洗涤后加入链霉亲和素标记的hrp酶一起温育后并洗涤以实现双重富集hrp酶；然后吸入信号产生底物(tmb显色底物)进行颜色变化后予以硫酸终止反应，对最终颜色进行自动拍照并以颜色分析颜色强度，黄色强度与待测目标物浓度相关。
38.更进一步优选地，所述生物素酪胺稀释液反应时间为15min；链霉亲和素标记的hrp酶温育时间为30min；tmb显色液显色时间为10min。
39.更进一步优选地，所述生物素酪胺用量为20μg/ml，100μl。
40.为了实现自动化检测的目的，本发明提供一种基于钝化型分子自聚型薄膜涂层改性一次性移液枪枪头以及自聚合型纳米微球作为信号放大载体的信号放大策略，此外还根据基于钝化型分子自聚型薄膜涂层改性一次性移液枪枪头配套设计了移动自动化便携式检测设备，在整个检测过程中，只需准备好相关对应试剂耗材实现预封装，并且放入对应检测设备承载平台上，通过设定好对应程序即可满足不同对象的自动化检测。
41.本发明较于传统elisa检测方法，钝化型分子自聚型薄膜涂层可降低抗体包被浓度以及减少洗涤过程中的枪头使用量，实现超低成本检测；其次，枪头作为反应载体可避免洗涤过程中的拍板步骤，使得操作简单，自动化程度高；最后，自聚合型纳米微球可实现双重信号放大效果、大大提高灵敏度来应对不同检测对象的高灵敏度要求的挑战，该方法分析性能良好，在体外诊断、食品安全、环境监测等领域具有很好的应用前景。本发明有益效果如下：
42.1)设备便携、成本低：在枪头上进行实验，操作简便，以自聚型薄膜涂层修饰枪头，通过化学共价键结合蛋白质，可大大降低包被蛋白浓度，节约抗体用量及枪头，成本较低；
43.2)操作简便、准确性好：本发明在传统的金标准elisa基础进行改进，因而依旧保留elisa的固有结果准确、稳定优势，同时避免了洗板等复杂的操作；
44.3)检测灵敏度高：聚多巴胺修饰的载体比表面积大，结合抗体的能力强，因此整个方法的灵敏度比传统的elisa方法提高了1个数量级；同时，温和水热法合成的自聚合型纳米微球实现双重信号放大，大大提高灵敏度，针对不同的检测对象，我们可以采用不同的信号放大系统，进而实现了精准检测；
45.4)高通量检测：检测设备每次可最多可进行96通道的高通量检测，配合96孔板可实现大批量样本的快速以及现场分析，检测效率极高；
46.5)检测设备自动化程度高：温度控制、进样、反应时间、洗涤、颜色信号分析及结果读出等过程均可通过预先设定好的程序控制，实现无人操作。不需要额外的洗板技术。
附图说明
47.图1：空白枪头(a)与自聚型薄膜涂层改性的枪头(b)。
48.图2：自聚合型纳米微球(pdans)及其富集的hrp酶标抗体探针表征图(a和b为pda ns的sem图；c为多巴胺与pda ns紫外吸收对比图；d为pda ns偶联hrp酶抗体(pda ns-hrp-ab2)元素分析图；e为pdans-hrp-ab2前后的zeta电位分析图；f为pda ns-hrp-ab2与pdans偶联hrp酶抗体-生物素酪胺放大系统(pda ns-hrp-ab
2-tsa)的催化效果对比图)。
49.图3：基于自写颜色分析程序对于不同富集载体富集hrp-ab2影响(a：pda ns为多巴胺自聚合型纳米微球；b：fe3o4为纳米颗粒；c：ps ms为聚苯乙烯微球)。
50.图4：表面移动自动化便携式检测设备的详细示意图。
51.图5：移动自动化便携式检测设备的整体示意图。
52.图6：移动自动化便携式检测设备的控制原图示意图。
53.图7：不同浓度包被don抗原在枪头elisa与传统elisa的检测对比(pelisa为特定枪头下的don-elisa，celisa为传统酶标孔包被下的don-elisa)。
54.图8：一次性特定枪头实验结果图。
55.图9：基于自写颜色分析程序对于不同信号放大系统don检测标准曲线对比(a：pda ns偶联hrp酶抗体-生物素酪胺放大系统(pda ns-hrp-ab
2-tsa)；b：pda ns偶联hrp酶抗体(pda ns-hrp-ab2)；c：hrp-ab2)
56.图10：基于自写颜色分析程序对于pct检测标准曲线。
57.图11：基于自写颜色分析程序对于il6检测标准曲线。
58.说明：箱体1、反应液承载平台2、移液器移动平台3、控制系统4、检测系统5，温控装置101；高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底201，检测基底盒202，检测系统203，自动送料平台204，旋转平台205，酶标板206，废液池207，调平旋钮208，第一步进电机209，移液器移动平台3，移液器301，第二步进电机302，第三步进电机303，传送带304，蜗轮蜗杆305，控制系统4，控制旋钮401，触控屏402。
具体实施方式
59.下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
60.试验材料及相关术语说明
61.呕吐毒素(don)抗体(3.5mg/ml)、don-bsa偶联物(5.7mg/ml)：购自山东蓝都生物科技有限公司。
62.don标准品：购自百灵威科技公司。
63.白介素6(il6)、白介素6捕获抗体(il6-ab1)、白介素6酶标抗体、pct、pct捕获抗体(pct-ab1)、pct酶标抗体：购自abcam公司。
64.初始一次性枪头于axygen公司购置。
65.自动化检测设备有我们自己设计搭建。
66.实施例1自聚合型纳米微球构建
67.将氨水溶液(3ml，nh4oh，28-30％)、乙醇(40ml)和去离子水(90ml)在30℃温和条件下搅拌下30min。然后将盐酸多巴胺(0.5g)溶于去离子水(10ml)中并注入上述混合物溶液中，反应24小时。离心得到自聚合型纳米微球并用去离子水洗涤3次，制备的自聚合型纳米微球平均直径为280nm。
68.实施例2特异性检测改性枪头及hrp酶标二抗与自聚合型纳米微球构建
69.以呕吐毒素抗体为例，对枪头改性以构建特异性检测呕吐毒素枪头进行说明，其余白介素6检测枪头与降钙素原(pct)检测枪头也能采用类似的方法。
70.1)枪头后吸入120μl多巴胺(5mg/ml)、peg-nh2(100μg/ml)和h2o2(0.2m)混合溶液，在室温保持3h后用去离子水洗涤；
71.2)上述枪头吸入100μl牛血清白蛋白偶联呕吐毒素don-bsa(500ng/ml)并在37℃下温育2小时后用pbst洗涤；
72.3)上述枪头吸入200μl bsa溶液(8％，w/v)在37℃下封闭非特异性位点1小时，然后pbst洗涤后于4℃环境下避光保存。
73.我们对自聚型薄膜涂层改性的枪头形貌进行了透射表征并将其与空白枪头进行对比。结果表明自聚型薄膜涂层改性的枪头(图1b)比空白枪头粗糙(图1a)，能够看到一层由均匀、致密的纳米颗粒形成的薄膜。
74.同时，我们对自聚合型纳米微球以及自聚合型纳米微球富集的hrp酶标抗体也进行了一系列表征(图2)，证明了自聚合型纳米微球及其富集的hrp酶标抗体的成功合成。
75.以呕吐毒素抗体为例，对偶联过程进行说明，其余生物识别分子的hrp酶标二抗包括白介素6-hrp酶标抗体、pct-hrp酶标抗体等也能采用类似的方法。
76.1)质量比1:20的hrp酶标二抗与自聚合型纳米微球在旋转混匀仪上37℃反应3h；
77.2)100μlbsa(8％)加入上述混合物中并在37℃封闭1h；
78.3)离心洗涤分离，除去上层清液，用1mlpbst(ph 7.4，0.5％bsa)重新悬浮，置于4℃保存。
79.我们选择了一个已报道的聚苯乙烯微球和四氧化三铁纳米颗粒作为富集载体的hrp酶标抗体偶联过程作为对比:
80.取5mg颗粒直径为1000nm羧基的聚苯乙烯微球于1.5ml离心管中，加入150μl上述磷酸盐-氢氧化钠缓冲溶液复溶，加入10μl质量浓度为50mg/ml的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(n-hydroxysulfosuccinimidesodium salt，nhs)和10μl质量浓度为50mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，edc]，摇振20min；以5000rpm离心力离心10min后倒掉废液，每次用200μl摩尔浓度为0.01m、ph＝7.4的pbs洗涤，洗涤2-3次，再溶于200μl上述磷酸盐缓冲溶液，得到活化的聚苯乙烯微球悬浮液。取100μl上述活化微球悬浮液于离心管中，加入0.3mg酶标抗体(蛋白含量：10mg/ml)，摇振1小时，以8000rpm离心力离心6min后倒掉废液，再溶于600μl上述封闭液，得到固定有抗体的微球即复合富集试剂，保存于4℃冰箱中。
[0081]
150nm的羧基化四氧化三铁纳米颗粒富集载体与hrp酶标抗体偶联过程与上述偶联过程类似。其中，洗涤过程在磁分离架进行磁分离操作完成。
[0082]
结果表明：本发明的富集偶联过程中不需要额外的活化试剂，偶联效率高，且简化实验步骤，降低成本。
[0083]
表1不同富集介质富集酶标抗体性能对比
[0084][0085]
同时，我们以呕吐毒素为分析模型，将上述三种载体富集hrp-ab2用于富集效果对比。如图3结果表明，多巴胺自聚合型纳米微球具有更好的线性定量范围以及检测灵敏度。
[0086]
实施例3便携式自动化检测设备搭建
[0087]
参考图4-6，该设备由箱体1、反应液承载平台2、移液器移动平台3、控制系统4、检测系统203五部分组成；
[0088]
箱体1为具有保温材质的恒温保温箱；保温箱内侧壁有温控装置101，可对整个反应过程提供所需恒温。
[0089]
反应液承载平台上2有由高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底201和检测基底盒202、检测系统203和自动送料平台204；
[0090]
移液器移动平台3上装有移液器301，为量程可调的96通道移液器，该移液器上301装有由高分子自聚型薄膜涂层改性的检测基底201；
[0091]
控制系统4由控制旋钮401、触控屏402两部分组成。
[0092]
优选地，箱体1为具有保温材质的恒温保温箱；保温箱内侧壁有温控装置101，可对整个反应过程提供所需恒温；
[0093]
检测基底201盛放在检测基底盒202上；检测系统203为可对最终反应产物进行显色检测的光学相机；自动送料平台204包括可最多进行若干次连续送料的旋转平台205，旋转平台205上有若干个盛放反应液的酶标板206，旋转平台205顺时针转动，从而实现反应液的自动进样；旋转平台205后方设有废液池207；反应液承载平台上2下部有调平旋钮208，可对反应液承载平台上2进行手动调平；反应液承载平台上2底部装有第一步进电机209，第一步进电机209通过带传动驱动承载平台实现y轴的前后移动。
[0094]
优选地，该移液器移动平台3两侧和移液器301侧方分别设有第二步进电机302、第三步进电机303，移液器301侧方的第二步进电机302通过传送带304传动实现移液器301在x轴的左右移动，移液器移动平台3两侧的第三步进电机303通过蜗轮蜗杆305传动实现移液器在z轴的上下移动。
[0095]
优选地，控制系统通过触控屏402接收操作人员发出的控制指令，控制相应继电器的触点关断和闭合，从而控制第一步进电机209、第二步进电机302、第三步进电机303正反转，实现反应液承载平台上2在y轴的移动、移液器301在x轴和z轴的移动，控制系统4可通过
箱体1上的温控装置101实时调节反应温度，实现整个反应过程的温度控制，控制系统4中的计时器可控制线性马达每次转动的时间间隔和旋转角度，实现反应液的自动进样，控制旋钮通过旋转和按压可实现对控制系统的手动选择和控制。
[0096]
此外，该检测平台还有电源、开关、导向滑杆、支撑架等部分。电源输入参数：100-240vac，1.2amax，50-60hz；开关控制整个检测平台的电源通断；导向滑杆为反应液承载平台和移液器提供移动轨道；支撑架对整个检测平台起到固定作用。
[0097]
实施例4peg-nh2的浓度优化
[0098]
为了实现低背景、高效率偶联抗体目的，最优的peg-nh2浓度具有十分重要的意义，具体过程如下：
[0099]
我们以pct为分析对象，分别以da与peg-nh2浓度比为500：1,100:1,50:1，10：1来进行优化实验，其中信号标签为酶标抗体，pct浓度为1μg/ml。
[0100]
表2不同da与peg-nh2浓度比的信噪比对比
[0101]
c da
:c peg-nh2信噪比(s/n)500：12.4100:14.350:18.110：14.7
[0102]
因此，我们选择da与peg-nh2浓度比为50：1被选为整个实验条件。
[0103]
同时，我们以呕吐毒素为分析对象，进行不同don抗原包被浓度在枪头elisa(pelisa)与传统elisa(celisa)的检测效果对比，其中信号标签为酶标抗体。结果表明(图7)，我们pelisa在包被抗原与竞争检测抗体均在500ng/ml可达到celisa在包被抗原与竞争检测抗体为1000ng/ml的相当结果，验证了pelisa能够在具有相当检测结果的同时降低一半抗原抗体的用量。
[0104]
其中，图8为以pelisa策略完成呕吐毒素竞争实验的其中一次预实验，表明我们的策略确实可行。
[0105]
实施例5呕吐毒素(don)的比色法检测
[0106]
为了验证该方法能适用于不同对象的检测灵敏度要求，以对粮食中的don为例，采用不同的信号放大系统来检测，具体过程如下：
[0107]
1)自动化检测设备通过系统控制抓获特异性检测呕吐毒素枪头后，吸入50μl don-ab和50μl不同浓度的don，并在37℃下孵育30分钟，然后pbst洗涤；
[0108]
2)向反应装置中引入100μlhrp酶标二抗并在37℃下孵育30分钟，然后pbst洗涤；后吸入100μltmb商用显色液在室温下避光反应10min，然后注入含有50μl的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的b值从而定量分析靶标含量；
[0109]
以don浓度的对数值为横坐标，颜色b值变化值的绝对值
△
ib为纵坐标，作标准曲线，如图9c所示；
[0110]
该don检测方法的原理如下：反应装置内，修饰在枪头上的don完全抗原、don一抗及样品中的don三者发生免疫竞争反应，当样品don越多时，don一抗与don完全抗原结合越少，与don一抗结合hrp酶标二抗越少。因此，样品中的don浓度与显色底物的颜色b值变化值的绝对值
△
ib呈正相关从而测定样品中don。
[0111]
或者：
[0112]
1)自动化检测设备通过系统控制抓获特异性检测呕吐毒素枪头后，吸入50μl don-ab和50μl不同浓度的don，并在37℃下孵育30分钟，然后pbst洗涤；
[0113]
2)向反应装置中引入100μl自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗并在37℃下孵育40分钟，然后pbst洗涤；后吸入100μltmb商用显色液在室温下避光反应10min，然后注入含有50μl的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的b值从而定量分析靶标含量；
[0114]
以don浓度的对数值为横坐标，颜色b值变化值的绝对值
△
ib为纵坐标，作标准曲线，如图9b所示；
[0115]
该don检测方法的原理如下：反应装置内，修饰在枪头上的don完全抗原、don一抗及样品中的don三者发生免疫竞争反应，当样品don越多时，don一抗与don完全抗原结合越少，与don一抗结合的自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗越少。因此，样品中的don浓度与显色底物的颜色b值变化值的绝对值
△
ib呈正相关从而测定样品中don。
[0116]
或者：
[0117]
1)自动化检测设备通过系统控制抓获特异性检测呕吐毒素枪头后，吸入50μl don-ab和50μl不同浓度的don，并在37℃下孵育30分钟，然后pbst洗涤；
[0118]
2)向反应装置中引入100μl自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗并在37℃下孵育40分钟，然后pbst洗涤；
[0119]
3)在反应装置中引入100μl酪胺和h2o2混合溶液与hrp酶标二抗与自聚合型纳米微球在37℃下温育20分钟，然后pbst洗涤；
[0120]
4)在反应装置中加入sa-hrp溶液在37℃下温育30分钟，然后pbst洗涤，吸入100μltmb商用显色液在室温下避光反应10min，然后注入含有50μl的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的b值从而定量分析靶标含量；
[0121]
以don浓度的对数值为横坐标，颜色b值变化值的绝对值
△
ib为纵坐标，作标准曲线，如图9a所示；
[0122]
该don检测方法的原理如下：反应装置内，修饰在枪头上的don完全抗原、don一抗及样品中的don三者发生免疫竞争反应，当样品don越多时，don一抗与don完全抗原结合越少，与don一抗结合的自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗越少。结合到上述hrp酶标二抗标记的自聚合型纳米微球的酪胺就越少，然后结合的sa-hrp酶也就越少。因此，样品中的don浓度与显色底物的颜色b值变化值的绝对值
△
ib呈正相关从而测定样品中don。
[0123]
从图9中可知，在相同的条件下，采用不同的信号放大系统可得到不同检测线性范围以及检测灵敏度，满足不同检测要求需要，因此说明本专利可以根据不同待测物选择不同的信号放大系统进而实现精准检测
[0124]
表3elisa与自动化枪头pelisa性能对比
[0125][0126]
实施例6pct的检测
[0127]
为了验证该方法能适用于不同对象的检测灵敏度要求，对人血清中的炎症标志物降钙素原(pct)以自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗探针初步信号放大进行较高灵敏度检测，具体如下：
[0128]
1)自动化检测设备通过系统控制抓获特异性检测pct枪头后，吸入100μl不同浓度的pct，并在37℃下孵育30分钟，然后pbst洗涤；
[0129]
2)向反应装置中引入100μl自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗并在37℃下孵育30分钟，然后pbst洗涤；后吸入100μltmb商用显色液在室温下避光反应10min，然后注入含有50μl的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的b值从而定量分析靶标含量；
[0130]
以pct浓度的对数值为横坐标，颜色b值变化值的绝对值
△
ib为纵坐标，作标准曲线，如图10所示；
[0131]
采用标准加入法对血清样品中的pct残留进行检测，过程同上，结果如表4所示。
[0132]
该pct检测方法的原理如下：反应装置内，修饰在枪头上的pct-ab1与样品中的pct发生免疫结合反应，当样品pct越多时，pct-ab1与pct结合就越多，与pct-pct-ab1复合物结合的自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗就越多，提高的灵敏度来源于自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗。因此，样品中的pct浓度与显色底物的颜色b值变化值的绝对值
△
ib呈正相关从而测定样品中pct。
[0133]
表4.采用标准加入法对人血清中的pct进行检测的结果
[0134][0135]
实施例7白介素6(il6)的检测
[0136]
为了验证该方法能适用于不同对象的检测灵敏度要求，对人血清中的炎症标志物炎症标志物白介素6(il6)以自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗探针结合酪胺放大系统进行高灵敏度检测，具体如下：
[0137]
1)自动化检测设备通过系统控制抓获特异性检测il6枪头后，吸入100μl不同浓度的il6，并在37℃下孵育30分钟，然后pbst洗涤；
[0138]
2)向反应装置中引入100μl自聚合型纳米微球富集的hrp酶标二抗并在37℃下孵育40分钟，然后pbst洗涤；
[0139]
3)在反应装置中引入100μl酪胺和h2o2混合溶液与hrp酶标二抗与自聚合型纳米微球在37℃下温育20分钟，然后pbst洗涤；
[0140]
4)在反应装置中加入sa-hrp溶液在37℃下温育30分钟，然后pbst洗涤，吸入100μltmb商用显色液在室温下避光反应10min，然后注入含有50μl的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的b值从而定量分析靶标含量；
[0141]
5)以il6浓度的对数值为横坐标，颜色b值变化值的绝对值
△
ib为纵坐标，作标准曲线，如图11所示；
[0142]
6)采用标准加入法对血清样品中的il6残留进行检测，过程同上，结果如表5所示。
[0143]
该il6检测方法的原理如下：反应装置内，修饰在枪头上的il6-ab1与样品中的il6发生免疫结合反应，当样品il6越多时，il6-ab1与il6结合就越多，与il6-il6-ab1复合物结合的hrp酶标二抗标记的自聚合型纳米微球越多，结合到上述hrp酶标二抗标记的自聚合型纳米微球的酪胺就越多，然后结合的sa-hrp酶也就越多。因此，样品中的il6浓度与显色底物的颜色b值变化值的绝对值
△
ib呈正相关从而测定样品中il6。
[0144]
表5.采用标准加入法对人血清中的il6进行检测的结果
[0145][0146]
申请人声明，通过上述实施例来解释本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述具体实施例才能实施。所属领域的技术人员在本发明基础上进行的任何改进，或者对本发明所选用的材料的等效替换等，均落在专利的保护范围之内。