一种动物体液中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的检测方法与流程

1.本发明涉及兴奋剂检测技术领域，具体为一种动物体液中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的检测方法。


背景技术：

2.动物在食用含兴奋剂的饲料后，会造成肌肉及组织中不同程度的残留，继而通过生物链在人体内残留，将导致食用者出现不同程度的中毒现象，而运动员也属于其中的食用者。为维护竞技体育的公平和纯洁，保证运动员的身体健康，兴奋剂检测已成为所有体育比赛中不可或缺的重要环节。
3.动物体液中常见的7种蛋白同化制剂类兴奋剂，即去氢表雄酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮，需要对它们进行检测。
4.为检测上述兴奋剂，技术人员先后尝试过高效液相色谱法(hplc)、气相色谱法(gc)、气相色谱-质谱联用(gc/msd)等方法，但检测过程中需要对这些兴奋剂进行衍生化，同时也会产生操作复杂、检测周期长、灵敏度较差等问题，导致目前不能对动物体液中的7种蛋白同化制剂类兴奋剂进行同时检测。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种动物体液中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的检测方法，可同时检测出动物体液中是否含有7种蛋白同化制剂类兴奋剂。
6.本发明是通过以下技术方案来实现：
7.一种动物体液中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的检测方法，所述的兴奋剂为去氢表雄酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮，包括如下步骤：
8.步骤1，在待测体液中加入去氢表雄酮-d5同位素内标中间液，之后用二氯甲烷提取，从得到的提取液中分离出二氯甲烷层，将提取液的剩余部分用相同的方式进行提取，并与二氯甲烷层合并得到上清液，然后将移取的上清液吹近干，用乙腈的水溶液溶解，最后涡旋振荡、超声过滤，得到待测液；
9.步骤2，将待测液用高效液相色谱串联含有电喷雾离子源的质谱仪进行测定，得到相应的谱图信息；
10.由所述的7种蛋白同化制剂类兴奋剂标准物质中间液用空白基质溶液配制的混合标准工作液，用与待测液相同的条件进行测定，得到相应的谱图信息；
11.步骤3，将步骤2形成的两组谱图信息进行比对，待测液中兴奋剂的保留时间与混合标准工作液中对应兴奋剂的保留时间偏差在
±
5％以内，且不超过0.5min，待测液中兴奋剂的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液中对应兴奋剂的相对离子丰度一致，且每个离子的信噪比≥3，得到所述待测液和混合标准工作液中所有兴奋剂的色谱峰峰面积，
以及混合标准工作液和所述待测液中对应的内标物的峰面积；
12.步骤4，结合混合标准工作液中待测组分的含量与峰面积、内标物的峰面积与浓度，以及待测液中内标物的浓度与峰面积、待测液中待测组分的峰面积、待测体液体积、二氯甲烷的总体积、移取的上清液体积、乙腈的水溶液体积、稀释倍数，采用内标法，求出去氢表雄酮的含量；
13.结合混合标准工作液中待测组分的含量和峰面积、待测液中待测组分的峰面积、待测体液体积、二氯甲烷的总体积、移取的上清液体积、乙腈的水溶液体积、稀释倍数，采用基质外标法，求出除去氢表雄酮以外所有兴奋剂的含量。
14.优选的，步骤1在分离二氯甲烷层时，待测体液、所述的同位素内标中间液和二氯甲烷的体积比为(4.8～5.2)：0.1：20。
15.优选的，步骤1在待测体液中加入所述的同位素内标中间液涡旋混匀后，再加入二氯甲烷涡旋振荡，最后将所得的混合体系依次超声、离心，得到二氯甲烷层。
16.进一步，所述的混合体系先超声8～15min，再7000～9000r/min离心4～8min，得到二氯甲烷层。
17.优选的，步骤2中的高效液相色谱采用c18色谱柱，流动相a为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相b为乙腈，梯度洗脱程序如下：
18.0～2min内，流动相a的体积比例保持75％；2～5min内，流动相a的体积比例由75％线性减小至30％；5～7min内，流动相a的体积比例保持30％；7～7.1min内，流动相a的体积比例由30％线性减小至10％；7.1～9min内，流动相a的比例保持10％，9～9.1min内，流动相a的比例由10％线性增加至75％，9.1～13min内，流动相a的比例保持75％。
19.优选的，步骤2所述的质谱仪采用如下参数进行工作：
20.扫描方式为多反应监测，毛细管电压为3.5kv，鞘气温度为400℃，干燥器温度为300℃，鞘气流量为11l/min，干燥器流量为7l/min。
21.优选的，步骤1将移取的上清液在35～50℃下用氮气吹近干。
22.优选的，步骤2和步骤3中所述的谱图信息为色谱峰、定性离子对和每个离子的信噪比。
23.优选的，步骤4采用如下公式求出去氢表雄酮的含量：
[0024][0025]
式中：
[0026]
x为待测液中各待测物的含量，单位为微克每升；
[0027]
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升；
[0028]ci
为待测液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升；
[0029]
a为待测液中待测组分的峰面积；
[0030]asi
为混合标准工作液中内标物的峰面积；
[0031]v1
为待测体液的体积，单位为毫升；
[0032]v2
为二氯甲烷的总体积，单位为毫升；
[0033]v3
为移取的上清液体积，单位为毫升；
[0034]v4
为乙腈的水溶液体积，单位为毫升；
[0035]csi
为混合标准工作液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升；
[0036]ai
为待测液中内标物的峰面积；
[0037]as
为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
[0038]
f为稀释倍数。
[0039]
优选的，步骤4采用如下公式求出除去氢表雄酮以外所有兴奋剂的含量：
[0040][0041]
x为待测液中各待测物的含量，单位为微克每升；
[0042]
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升；
[0043]
a为待测液中待测组分的峰面积；
[0044]as
为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
[0045]v1
为待测体液的体积，毫升；
[0046]v2
为二氯甲烷的总体积，单位为毫升；
[0047]v3
为移取的上清液体积，单位为毫升；
[0048]v4
为乙腈的水溶液体积，单位为毫升；
[0049]
f为稀释倍数。
[0050]
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0051]
本发明提供一种动物体液中7种蛋白同化制剂类兴奋剂的检测方法，在体液前处理前加入去氢表雄酮-d5的内标中间液，之后用二氯甲烷提取，分离出二氯甲烷层，提取液的剩余部分用相同的方式进行提取，合并后得到上清液，其中含有待检测的7种蛋白同化制剂类兴奋剂，然后将移取的上清液吹干，得到含有这些蛋白同化制剂类兴奋剂的残渣，用乙腈的水溶液溶解，采用涡旋振荡的方式使残渣充分溶解，最后超声过滤得到待测液，再利用液相色谱串联含有电喷雾离子源的质谱仪测定待测液和混合标准工作液中的兴奋剂，通过得到的谱图信息进行比对，可判断试样中存在相应的目标物，进而得到待测兴奋剂和对应内标物的峰面积，采用内标法，结合混合标准工作液中待测组分的含量与峰面积、内标物的峰面积与浓度，以及待测液中内标物的浓度与峰面积、待测液中待测组分的峰面积、待测体液体积、二氯甲烷的总体积、上清液的体积、乙腈的水溶液体积、稀释倍数求出去氢表雄酮的含量，利用基质外标法，结合混合标准工作液中待测组分的含量和峰面积、待测液中待测组分的峰面积、待测体液体积、二氯甲烷的总体积、移取的上清液体积、乙腈的水溶液体积、稀释倍数求出除去氢表雄酮以外所有兴奋剂的含量。本发明前处理简单，分析时间短，灵敏度高，检测种类全面，能够保障体育赛事对兴奋剂检测的需要。
附图说明
[0052]
图1为本发明所述的去氢表雄酮标准溶液的总离子流图(1.5ng/ml)。
[0053]
图2为本发明所述的α-玉米赤霉醇等其余6种兴奋剂标准溶液总离子流图(1.5ng/ml)。
具体实施方式
[0054]
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0055]
本发明一种对动物体液中7种蛋白同化制剂类兴奋剂进行检测的方法，包括以下步骤：
[0056]
所述7种兴奋剂为去氢表雄酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮。
[0057]
步骤1)混合标准使用液的制备
[0058]
标准储备液：
[0059]
分别准确称取适量7种兴奋剂标准物质(精确至0.01mg)，分别加入甲醇溶解，配制成浓度为1mg/ml的标准储备液，置于-18℃以下避光冷冻保存。
[0060]
混合标准中间液：
[0061]
分别移取7种兴奋剂标准储备液适量于10ml容量瓶中，用甲醇分别稀释至刻度，配成浓度均为10μg/ml的混合标准中间液。
[0062]
混合标准使用液：
[0063]
准确吸取混合标准中间液适量，用甲醇稀释至适宜浓度，作为混合标准使用液。现配现用。
[0064]
同位素内标标准储备液：
[0065]
准确称取适量标准物质去氢表雄酮-d5(精确至0.01mg)，用甲醇溶解，配制成100μg/ml的标准储备液。
[0066]
同位素内标中间液：
[0067]
分别精确吸取同位素内标标准储备液适量，用甲醇稀释，配制成浓度为1μg/ml的同位素内标中间液。现配现用。
[0068]
混合标准工作液：
[0069]
选取不含待测物的样品，按照步骤3的操作，得到空白基质溶液。
[0070]
准确吸取混合标准使用液适量，用空白基质溶液稀释至适宜浓度，作为混合标准工作溶液。
[0071]
步骤2，试样保存；
[0072]
供试样品置于-18℃以下保存，使用前放至室温，如有混浊，离心后取上清液备用。
[0073]
步骤3，
[0074]
精密量取试样5.0ml于50ml具塞离心管中，加入100μl同位素内标中间液，涡旋混匀，加入10ml二氯甲烷，涡旋振荡8～15min，超声提取8～15min，之后7000～9000r/min离心4～8min，取下层溶液。重复提取一次，合并两次提取的下层溶液，混匀，取2ml于35～50℃下氮吹近干，准确加入1.00ml定容液(水与乙腈以70:30的体积比混合后得到的溶液)溶解残渣，涡旋振荡1～4min，超声1～4min，过0.22μm尼龙滤膜，得到待测液供液相色谱-串联质谱仪测定。
[0075]
步骤4，液相色谱-串联质谱仪测定
[0076]
1，色谱条件
[0077]
a)色谱柱：c18(粒径：5μm，规格为2.0mm
×
150mm)；
[0078]
b)柱温：35℃；
[0079]
c)进样量：10μl；
[0080]
d)流速：0.2ml/min；
[0081]
e)色谱柱流动相：a相：甲酸体积浓度为0.1％的水溶液，b相：乙腈，梯度洗脱程序见表1。
[0082]
表1色谱柱梯度洗脱程序
[0083]
时间(min)a(％)b(％)0.075252.075255.030707.030707.110909.010909.1752513.07525
[0084]
2，质谱参考条件
[0085]
a)离子源：电喷雾离子源(esi
+
)；
[0086]
b)扫描方式：多反应监测(简写为mrm)；
[0087]
c)喷雾电压：3.5kv(esi
+
)；
[0088]
d)：鞘气温度：400℃；
[0089]
e)干燥器温度：300℃；
[0090]
f)鞘气流量：11l/min；
[0091]
g)干燥器流量：7l/min。
[0092]
通过以上方法得到表2和表3的兴奋剂相关参数。
[0093]
表2 7种蛋白同化制剂类兴奋剂的一部分相关参数
[0094][0095]
表3 7种蛋白同化制剂类兴奋剂的另一部分相关参数
[0096][0097]
步骤5，含量测定
[0098]
a，定性测定
[0099]
根据试样中目标物的含量情况，选择浓度一致的混合标准工作液按照上述条件用色谱柱及其相应的梯度洗脱程序进行液相色谱-串联质谱仪分析。若检测的色谱峰对应的保留时间与混合标准工作液的保留时间偏差在
±
5％以内，且不超过
±
0.5min；质谱得到的定性离子对的相对离子丰度与相应浓度的混合标准工作液的相对离子丰度一致，相对离子丰度的偏差不超过表4的数据，且每个离子的信噪比≥3，则可知样品中存在本发明所述的7种兴奋剂相应的目标物。
[0100]
表4定性测定时相对离子丰度的允许偏差
[0101]
相对离子丰度，％允许偏差，％＞50
±
2020～50
±
2510～20
±
30≤10
±
50
[0102]
从图1和图2可以看到本发明所述的去氢表雄酮和α-玉米赤霉醇等其余6种兴奋剂的峰型很好，说明可以将它们进行分离。
[0103]
b，定量测定
[0104]
根据试样中目标物的含量情况，选取浓度相近的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱仪分析。混合标准工作液和待测液中目标物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如表3所示。以峰面积之比做单点校正定量。
[0105]
c，空白试验，具体地进行空白试验时，除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
[0106]
d，结果计算和表述
[0107]
除去氢表雄酮以外的其它6种兴奋剂的含量，采用基质外标法定量，按照(1)式计算，计算结果需扣除空白值。
[0108][0109]
x—试样中各待测物的含量，单位为微克每升(μg/l)；
[0110]
c—混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0111]
a—待测液中待测组分的峰面积；
[0112]as
—混合标准工作液中待测组分的峰面积；
[0113]v1
—样液体积，此处为5，单位为毫升(ml)；
[0114]v2
—样液的提取体积，此处为20，单位为毫升(ml)；
[0115]v3
—样液的移取体积，此处为2，单位为毫升(ml)；
[0116]v4
—样液的定容体积，此处为1，单位为毫升(ml)；
[0117]
f—稀释倍数。
[0118]
用重复条件下获得两次独立测定结果的算数平均值表示，计算结果保留三位有效数字。
[0119]
去氢表雄酮采用内标法定量，按照(2)式计算，计算结果需扣除空白值。
[0120][0121]
式中：
[0122]
x—试样中各待测物的含量，单位为微克每升(μg/l)；
[0123]
c—混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0124]ci
—待测液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0125]
a—待测液中待测组分的峰面积；
[0126]asi
—混合标准工作液中内标物的峰面积；
[0127]v1
—样液的体积，此处为5，单位为毫升(ml)
[0128]v2
—样液的提取体积，此处为20，单位为毫升(ml)；
[0129]v3
—样液的移取体积，此处为2，单位为毫升(ml)；
[0130]v4
—样液的定容体积，此处为1，单位为毫升(ml)；
[0131]csi
—混合标准工作液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0132]ai
—待测液中内标物的峰面积；
[0133]as
—混合标准工作液中待测组分的峰面积；
[0134]
f—稀释倍数。
[0135]
用重复条件下获得两次独立测定结果的算数平均值表示，计算结果保留三位有效数字。
[0136]
本发明在实际应用中，提取试样时，按以下步骤：
[0137]
精密量取试样5.0ml于50ml具塞离心管中，加入100μl同位素内标中间液，涡旋混匀，加入10ml二氯甲烷，涡旋振荡10min，超声提取10min，之后8000r/min离心5min，取下层溶液。重复提取一次，合并两次提取的下层溶液，混匀，取2ml于40℃下氮吹近干，准确加入上述步骤3所提及的1.00ml定容液溶解残渣，涡旋振荡1min，超声1min，过0.22μm尼龙滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
[0138]
方法实际应用结果
[0139]
使用本发明建立的方法对从陕西省各地抽取的10份动物体液进行测定分析，均未检出。
[0140]
在空白猪尿等样品中分别添加100μl混合标准使用液和100μl同位素内标中间液，使样品中化合物浓度分别为定量限，进行回收率测定，平行做3次，按照上述试样提取方法分类进行处理并上机测定，得到本方法的回收率及精密度。
[0141]
结果表明猪尿中7种蛋白同化制剂类相关参数的回收率范围为75.0％～97.7％，rsd为0.3％～2.7％，其中猪尿中7种蛋白同化制剂类相关参数回收率及精密度的详细结果如表4所示。
[0142]
表4猪尿中的脱氢表雄酮回收率及精密度
[0143][0144]
实验结果表明，该方法回收率均能够在国家现行有效标准gb/t 27404－2008中规定的60％～120％内，精密度均在30％以内，表明该方法具有良好的准确度和精密度。该方法在实际应用中，检测效果良好，可用于猪尿等动物源体液中去氢表雄酮等兴奋剂的快速检测。
[0145][0146]