一种检测氨基酸及其衍生物的方法

本发明属于分析化学领域。具体地，本发明涉及一种检测氨基酸及其衍生物的方法。

背景技术：

1、氨基酸是参与人类生命活动的一类重要小分子。不同的氨基酸按照一定的序列以肽键的形式连接形成蛋白质分子，发挥生物功能。蛋白质是生物体内的重要组成部分，是生命活动的物质基础。氨基酸是蛋白质分子的结构组成单元，在这些构成蛋白的氨基酸中，有20种氨基酸人体不能合成，必须从食物中获取，称为必需氨基酸。当这些必需氨基酸中的一种或几种在体内的含量发生变化，浓度出现异常时，有可能影响蛋白质的合成，这些蛋白质在体内的正常生理功能会受到影响，正常的生命活动无法顺利运行，身体处于疾病状态，情绪也会受到影响。

2、对血液中的氨基酸浓度进行监测，可以判断氨基酸水平是否能够满足机体生长发育以及维持生命活动的需要，还能评估不同的氨基酸的浓度是否平衡，这对于一些慢性疾病的预防以及与蛋白功能异常疾病的治疗都具有十分重要的意义。另外，在食品领域或动植物组织中，也存在着许多对于氨基酸类物质检测的需求，例如检测功能饮料中氨基酸类物质的含量和种类，但食品或动植物组织中存在大量的其他干扰物质，对氨基酸类物质的准确检测造成困难。

3、氨基酸的结构中一般都含有一个氨基和一个羧基，具有良好的水溶性。早期对氨基酸的测定通常使用高效液相色谱技术，除了含有芳香基团的氨基酸分子具有紫外吸收的性质之外，其他的氨基酸都没有光谱学的特征，无法使用光学检测器对氨基酸进行直接测定。因此，对氨基酸进行定量测定时通常需要使用衍生化技术，将具有光学特征的芳香基团与氨基酸的氨基通过化学反应连接在一起，赋予氨基酸分子光谱性质，便于检测，同时衍生化之后的分子极性变小，增加了色谱分离的便利性。邻苯二甲醛、丹磺酰氯、异硫氰酸苯酯、2,4-二硝基氟苯和6-氨基喹啉基-n-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯都是已经报道过的衍生化试剂，这些试剂的衍生化效率略有差异，测定血液、动植物组织或食品中的氨基酸时易受到其中所包含的大量其他物质的干扰，专属性不足。

4、uplc-ms/ms技术在定量测定领域发展迅速，利用此技术对氨基酸进行测定通常是将样品简单处理之后直接上机分析，易受基质效应的影响。对一些含量较低的氨基酸，检测的回收率及定量的准确度也有待提高。

5、鉴于此，有必要开发一种衍生化专属性强、灵敏度高、简便高效、重复性好并且可以快速准确地测定血液、动植物组织或食品中氨基酸及其衍生物含量的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测氨基酸及其衍生物的方法，该方法采用超高效液相色谱-质谱联用技术，灵敏度高、特异性强、简便、高效、重复性好，并且可以快速准确地测定血液、动植物组织或食品中氨基酸及其衍生物的含量，检测回收率高，可操作性强，有利于推广。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种检测氨基酸及其衍生物的方法，其包括以下步骤：

4、在碱性条件下采用衍生化试剂处理供试品和标准品，然后采用超高效液相色谱-质谱联用技术检测所述供试品和标准品；

5、其中，所述超高效液相色谱以甲酸水溶液为流动相a，以甲酸的乙腈溶液为流动相b，采用梯度洗脱的方式洗脱；

6、所述质谱采用电喷雾离子源，负离子模式；

7、所述衍生化试剂为苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺。

8、作为一种优选的实施方式，超高效液相色谱-质谱联用(uplc-ms/ms) 技术所采用的仪器型号为：agilent 1290infinity ii型超高效液相色谱仪 (uplc)；ab sciex 6500+triple quard，离子源：电喷雾离子源；离子化电压：-4500v；气帘气压力：35psi；喷雾气压力：55psi；加热气温度 550℃；辅助加热气压力：55psi；质谱采集模式：多反应监测模式(mrm) 或保留时间锁定的多反应监测模式(schedule mrm模式)。

9、优选地，所述标准品为包含浓度为25ng/ml～5μg/ml的氨基酸和/或其衍生物的多种溶液。例如，所述标准品可以为包含浓度选自25ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、5μg/ml的氨基酸和/或其衍生物的多种溶液。

10、作为一种优选的实施方式，所述标准溶液可以如下配制：

11、配制浓度为1mg/ml的20种游离氨基酸单品标准溶液，每种单品标准溶液各取100μl混合均匀，制备成浓度为50μg/ml的混合标准储备溶液，稀释之后制备成浓度为5μg/ml、1μg/ml、500ng/ml、250ng/ml、 50ng/ml、25ng/ml的标准曲线工作溶液。

12、优选地，所述供试品选自血液和/或血浆、动植物组织或食品。

13、作为一种优选的实施方式，当所述供试品选自血液时，将所述血液分离以获得血浆。

14、作为一种优选的实施方式，由血液获得血浆的过程如下：由抗凝采血管采集血液，离心，取上清液，获取血浆，备用。

15、作为一种优选的实施方式，当所述供试品选自动植物组织时，可以对组织样本进行匀浆，之后用水提取样本中的游离氨基酸进行测定。

16、作为一种优选的实施方式，当所述供试品选自食品时，可以根据食品的状态选择合适的处理方法，液体食品可直接用水稀释后进行测定，固体食品需研磨成粉，加水提取其中的游离氨基酸进行测定。

17、优选地，将所述供试品和所述标准品的溶液分别与碱性试剂混合，然后与衍生化试剂溶液混合，分离并取用上清液；

18、优选地，所述混合为以选自涡旋震荡、超声处理的均质化方法均质化 10秒～1分钟。例如，所述混合可以采用涡旋震荡在3000～5000r/min的转速下涡旋10秒～1分钟。

19、优选地，所述分离为在10000g的离心力下离心5分钟。

20、优选地，所述碱性试剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的至少一种。

21、优选地，所述碱性试剂的浓度为5mm～15mm，例如，可以选择5mm、 6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、 15mm、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。

22、更优选地，所述碱性试剂的浓度为10mm。

23、优选地，所述供试品或所述标准品的溶液与所述碱性试剂的体积比为0.8:1～1:1.2，例如，可以选择0.8:1、0.9:1、1:1、1:1.1、1:1.2、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。

24、更优选地，所述供试品或所述标准品的溶液与所述碱性试剂的体积比为1:1。

25、优选地，所述衍生化试剂为苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺在乙腈中的溶液。

26、优选地，所述衍生化试剂在乙腈中的溶液的浓度为5mm～15mm，例如，可以选择5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12 mm、13mm、14mm、15mm、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。

27、更优选地，所述衍生化试剂在乙腈中的溶液的浓度为10mm。

28、优选地，所述供试品或所述标准品的溶液与所述衍生化试剂的溶液的体积比为1:3～6，例如，可以选择1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。

29、更优选地，所述供试品或所述标准品的溶液与所述衍生化试剂的溶液的体积比为1:4。

30、作为一种优选的实施方式，以牛磺酸和赖氨酸为例说明衍生化反应。在牛磺酸和赖氨酸的氨基上连接苯甲氧羰基的基团，以降低牛磺酸和赖氨酸的极性，使其可以用反相色谱进行分离测试。如以下化学式中所示出的，衍生化之后，在赖氨酸的主链和侧链的氨基上共连接上了2个苯甲氧羰基，在牛磺酸的主链氨基上连接上一个苯甲氧羰基：

31、

32、作为一种优选的实施方式，在碱性条件下采用衍生试剂溶液处理供试品和标准溶液包括：

33、向100μl的血浆或标准溶液中添加100μl的10mm氢氧化钠溶液，混合均匀，然后添加400μl的10mm衍生化试剂的乙腈溶液，涡旋震荡 30秒进行衍生化反应。由于在血浆中加入了乙腈，血浆中的蛋白将发生沉淀。

34、优选地，所述流动相a甲酸水溶液的浓度为0.01wt.％～0.1wt.％，例如，可以选择0.01wt.％、0.02wt.％、0.03wt.％、0.04wt.％、0.05wt.％、0.06wt.％、0.07wt.％、0.08wt.％、0.09wt.％、0.1wt.％、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。

35、更优选地，所述流动相a甲酸水溶液的浓度为0.05wt.％。

36、优选地，所述流动相b中甲酸在乙腈中的浓度为0.01wt.％～0.1wt.％，例如，可以选择0.01wt.％、0.02wt.％、0.03wt.％、0.04wt.％、0.05wt.％、 0.06wt.％、0.07wt.％、0.08wt.％、0.09wt.％、0.1wt.％、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。

37、更优选地，所述流动相b中甲酸在乙腈中的浓度为0.05wt.％。

38、优选地，以流动相a和流动相b的体积比计，所述梯度洗脱的程序包括：

39、在0min时，以70％流动相a-30％流动相b洗脱，保持1min；

40、1min～10min，以30％流动相b-85％流动相b梯度洗脱；

41、在10.1min时，以100％流动相b洗脱，保持2min；

42、在12.1min时，以70％流动相a-30％流动相b洗脱，保持3min。

43、优选地，所述超高效液相色谱的色谱柱为waters acquity beh c8，规格为100mm×2.1mm，粒径为1.7μm。

44、优选地，所述质谱采用电喷雾离子源，负离子模式；离子化电压：-4500 v；气帘气压力：35psi；喷雾气压力：55psi；加热气温度550℃；辅助加热气压力：55psi；质谱采集模式：多反应监测模式(mrm)或保留时间锁定的多反应监测模式(smrm)。

45、优选地，所述质谱在所述氨基酸及其衍生物的保留时间±1min的范围内以50ms～300ms的驻留时间采集信号。

46、本发明提供的方法可以实现20种必需氨基酸的同时检测，还可以用于检测20种必需氨基酸之外的其他氨基酸，例如牛磺酸。

47、本发明至少具有如下有益效果：

48、(1)本发明所提供的检测氨基酸及其衍生物的方法，其衍生化速度快、所需样本量少、操作简单。

49、(2)本发明所提供的检测氨基酸及其衍生物的方法，其特异性强、灵敏度高、稳定性好，可以同时检测多种游离氨基酸及其衍生物，效率高。

50、(3)本发明所提供的检测氨基酸及其衍生物的方法，其还可以用于检测血液、动植物组织、食品等样品中氨基酸的检测，适用范围广。