新冠中和抗体检测试纸条、检测卡和检测试剂盒的制作方法

1.本实用新型涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新冠中和抗体检测试纸条、检测卡和检测试剂盒。


背景技术：

2.sars-cov-2属于β属的新型冠状病毒，其可在人类中传染引起新型冠状病毒肺炎。sars-cov-2有几种结构蛋白，包括刺突糖蛋白(s)，包膜蛋白(e)，膜蛋白(m)和核衣壳(n)。其中刺突糖蛋白(s)含有一个受体结合域 (rbd)，它通过识别细胞表面的血管紧张素转换酶-2(ace2)受体进入细胞。
3.随着各国对sars-cov-2的深入研究，2020年7月，全球已有大约250 种候选新冠病毒疫苗在研发中，其中至少有17种疫苗正处于临床试验阶段。截至2021年2月，中国已经附条件上市的新冠疫苗达4个，其中三个灭活疫苗，一个腺病毒载体疫苗。但疫苗诱导产生的抗体是随机的，只有能够阻止病毒侵入细胞的抗体才有抗病毒作用，即中和抗体。所以人们迫切需要一款能够快速评估接种疫苗后中和抗体产生情况的检测试剂。
4.目前的实验室检查中和抗体方法主要有：病毒中和试验、竞争法。其中病毒中和试验指在体外，将标准、定量的病毒株和待检测抗体进行混合孵育，然后将二者的混合物接种到支持病毒复制的细胞培养液中进行培养，一定时间后观察细胞病变情况。该方法又叫做中和性抗体滴度检测试验，是中和抗体检测的金标准。竞争法是利用样本中中和抗体和病毒识别位点竞争与标记的新冠抗原结合，通过检测标记物来反应中和抗体的滴度。目前实验室主要有化学发光、elisa、免疫层析等技术平台。
5.然而，病毒中和试验对试验环境及操作人员技术水平有很高要求，且试验过程中使用到病毒或假病毒对环境及相关人员安全性有较大威胁，不适宜推广。化学发光、elisa等平台则需要特殊设备判读，且检测时间较长。免疫层析平台能够快速得到结果，但在灵敏度和准确性方面较以上平台稍有逊色。
6.现有的基于新型冠状病毒rbd蛋白抗原与ace2受体竞争法层析检测中和抗体中，因样本是人体血液，血液中含有的ace2受体会与新型冠状病毒rbd蛋白抗原结合，会导致测得的sars-cov-2中和性抗体量升高，甚至出现假阳性。
7.有鉴于此，特提出本实用新型。


技术实现要素：

8.本实用新型的第一目的在于提供一种新冠中和抗体检测试纸条
9.本实用新型的第二目的在于提供一种新冠中和抗体检测卡。
10.本实用新型的第三目的在于提供一种新冠中和抗体检测试剂盒。
11.为了实现本实用新型的上述目的，特采用以下技术方案：
12.一种新冠中和抗体检测试纸条，沿待测样本流动方向，包括依次设置于底板上的样本垫、标记垫、检测垫和吸水纸，所述检测垫上间隔设有检测区和质控区；
13.所述样本垫包被有ace2抗体；
14.所述标记垫包被有标记sars-cov-2抗原和第一标记物质，其中所述 sars-cov-2抗原为新型冠状病毒s蛋白的rbd抗原；
15.所述检测区包被有ace2；
16.所述质控区包被有可被所述第一标记物质识别的第二物质。
17.进一步地，所述第一标记物质为质控抗体，所述第二物质为质控抗原。
18.进一步地，标记rbd抗原和标记质控抗体的标记物包括荧光微球、胶体金或乳胶。
19.进一步地，质控抗原为dnp抗原，质控抗体为抗dnp抗体。
20.进一步地，标记垫包括玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、无纺布或硝酸纤维素膜。
21.进一步地，样本垫包括玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、无纺布或硝酸纤维素膜。
22.进一步地，检测垫为nc膜。
23.进一步地，底板为pvc板。
24.一种新冠中和抗体检测卡，包括卡壳和上述试纸条。
25.一种新冠中和抗体检测试剂盒，包括上述试纸条或上述检测卡。
26.与现有技术相比，本实用新型的有益效果为：
27.本实用新型提供的新冠中和抗体检测试纸条，沿待测样本流动方向，包括依次设置于底板上的样本垫、标记垫、检测垫和吸水纸，之中，检测垫上间隔设有检测区和质控区，样本垫包被有ace2抗体，标记垫包被有标记sars-cov-2抗原和第一标记物质，其中sars-cov-2抗原为新型冠状病毒s蛋白的rbd抗原，检测区包被有ace2，质控区包被有可被第一标记物质识别的第二物质。该检测试纸条由于样本垫上包被有ace2抗体，可以有效封闭待测样本中的ace2，避免待测样本中的ace2与 sars-cov-2中和抗体竞争性结合标记垫上的标记rbd抗原，减少检测过程中的个体差异，提高检测的灵敏度，并且保证检测结果的准确性，防止假阳性的产生。
附图说明
28.为了更清楚地说明本实用新型具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本实用新型的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为本实用新型新冠中和抗体检测试纸条的示意图；
30.图2为本实用新型实施方式6中试剂卡1的样本检测结果；
31.图3为本实用新型实施方式6中试剂卡2的样本检测结果。
32.图标：1-底板；2-样本垫；3-标记垫；4-检测垫；41-检测区；42-质控区；5-吸水纸。
具体实施方式
33.下面将结合实施例对本实用新型的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本实用新型，而不应视为限制本实用新型的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
34.除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相
同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本实用新型中。
35.如图1所示，一种新冠中和抗体检测试纸条，沿待测样本流动方向，包括依次设置于底板上的样本垫、标记垫、检测垫和吸水纸，检测垫上间隔设有检测区和质控区。
36.该检测试纸条的主要原理为：样本垫包被有ace2抗体，标记垫包被有标记sars-cov-2抗原和第一标记物质，检测垫的检测区包被有ace2，检测垫的质控区包被有可被第一标记物质识别的第二物质。标记 sars-cov-2抗原为标记新型冠状病毒s蛋白的rbd抗原。检测时，将待测样本加样到样本垫，样本垫上包被的ace2抗体与待测样本中的ace2 结合。检测区信号与待测样本中新型冠状病毒中和抗体的浓度负相关。
37.如待测样本中无新型冠状病毒中和抗体，则标记垫上的标记rbd抗原与检测区包被的ace2发生特异性结合，可在检测区检测到信号。
38.如待测样本中有新型冠状病毒中和抗体，则其会与标记垫上的标记 rbd抗原结合，形成免疫复合物，并阻断或减弱了标记垫上的标记rbd抗原与检测区包被的ace2发生特异性结合，检测区的检测信号会减弱或消失。
39.第一标记物质与质控区包被的第二物质发生特异性结合，可在质控区检测到信号用于评价试纸条有效性。
40.上述检测过程，标记垫和检测垫上的反应不存在待测样本的ace2干扰。
41.第一标记物质和第二物质优选为质控抗体和质控抗原，质控抗体和质控抗原用于对检测试纸条的有效性进行评价，可以为本领域常规使用材料，优选为dnp抗原和抗dnp抗体。
42.需要说明的是，该检测试剂条的检测方法优选为上述竞争法检测，底板、样本垫、标记垫、检测垫和吸水纸可以为本领域常规使用材料，检测平台也可以为本领域常规使用平台，在此不作具体限定。
43.在优选的实施方式中，标记rbd抗原和标记质控抗体的标记物包括荧光微球、胶体金或乳胶。根据标记物的不同，检测试纸条的检测平台也相应改变，在样本垫上包被ace2抗体均可以在原有检测平台的基础上提高检测准确性。
44.在优选的实施方式中，标记垫可以为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、无纺布或纤维素膜；样本垫可以为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、无纺布或纤维素膜；检测垫可以为nc膜；底板可以为pvc板。
45.具体的，以荧光微球作为标记物，检测试纸条相关结构的制备如下：
46.a)荧光微球标记物制备：通过化学交联手段将荧光微球分别与新型冠状病毒rbd抗原、抗dnp抗体结合。
47.b)将ace2抗体包被在样本垫上：通过物理吸附或者化学交联手段将 ace2抗体包被在具有一定孔径的玻璃纤维垫上。其中所采用的物理或者化学包被方法对抗体的生物活性影响不大，同时添加有抗体蛋白保护剂(保护剂可选自牛血清白蛋白、小牛血清、蛋白胨、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮及其组合物)以缓冲液稀释到适当的比例。喷涂于样本垫上，干燥后密封保存。
48.c)将荧光微球标记物和抗dnp抗体包被在结合垫上：通过物理吸附或者化学交联手段将荧光微球标记物和抗dnp抗体包被在具有一定孔径的玻璃纤维垫上。其中所采用的物理或者化学包被方法对标记物和抗体的生物活性影响不大，同时添加有抗体蛋白保护剂
(保护剂可选自牛血清白蛋白、小牛血清、蛋白胨、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮及其组合物)以缓冲液稀释到适当的比例。喷涂于结合垫上，干燥后密封保存。
49.d)在硝酸纤维素膜上包被ace2和dnp抗原：通过物理吸附或者化学交联手段将ace2和dnp抗原分别固定在具有一定孔径的硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置上。其中所采用的物理或者化学固定方法对ace2 和dnp抗原的生物活性影响不大，以缓冲液稀释到适当的效价后，喷涂于硝酸纤维素膜上，干燥后密封保存。
50.本实用新型提供的检测试纸条可以制备成检测卡或检测试剂盒等形式的产品。
51.下面通过具体的实施例进一步说明本实用新型，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本实用新型。
52.实施方式1荧光微球标记
53.荧光微球采购于merck公司，新型冠状病毒rbd重组抗原与抗dnp 抗体均采购于珠海丽禾医疗诊断产品有限公司。将edc和nhs按10mg/ml 加入到荧光微球中，室温混匀孵育30分钟，微球上的羧基充分活化后加入新型冠状病毒rbd重组抗原或抗dnp抗体室温混匀反应2小时，加入 1％bsa和0.2％tween 20封闭多余的活化的羧基，室温反应1小时保证充分的封闭，加入5％蔗糖，保证标记物保存的稳定性。制备好的标记物放置于2-8℃保存。
54.实施方式2标记垫的制备
55.将标记好的新型冠状病毒rbd抗原荧光标记物和抗dnp抗体荧光标记物分别以10％和1％的比例配制，同时加入1％牛血清白蛋白、0.5％小牛血清、5％蔗糖、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％抗rbc抗体到缓冲溶液中制备成标记垫包被液，使用上海捷宁公司的喷金划膜仪喷涂于玻璃纤维上。干燥过夜。
56.实施方式3样本垫的制备
57.抗血管紧张素转换酶-2中和抗体为北京义翘神州科技股份有限公司提供，按0.02mg/ml配制，同时加入0.2％牛血清白蛋白、0.1％小牛血清、1％蔗糖、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.05％抗rbc抗体到缓冲溶液中制备成样本垫包被液，使用上海捷宁公司的喷金划膜仪喷涂于玻璃纤维上。干燥过夜。
58.实施方式4检测垫的制备
59.硝酸纤维素膜采购于merck公司，血管紧张素转换酶-2(ace2)和dnp 抗原均采购于珠海丽禾医疗诊断产品有限公司，配制0.01m pbs和5％蔗糖作为包被基础液，把血管紧张素转换酶-2(ace2)和dnp抗原分别按 1.0mg/ml的浓度配制成检测线包被液和质控线包被液，使用上海捷宁公司的喷金划膜仪划膜，干燥过夜制备成包被膜。
60.实施方式5检测卡的制备
61.将制备好的标记垫、样本垫、检测垫和吸水纸分别按规定的顺序贴在 pvc板上，其中吸水纸在上，搭检测垫上端(靠近质控区)约1-4mm，标记垫在上，搭检测垫下端(靠近检测区)约1-4mm，样本垫在上，搭标记垫下端约1-4mm，组装成检测板，使用上海金标生物科技有限公司把检测板均匀切成4mm的试纸条，试纸条组装到试剂卡卡壳中，制备成检测试剂卡1。
62.实施方式6
63.参考实施方式3的方法，制备不含抗血管紧张素转换酶-2中和抗体的样本垫作为对照，制备检测试剂卡2，两种试剂卡同时测试阴性血清样本 20例、临床确诊2019-ncov病人的血清样本3例，接种新冠疫苗1-2个月的血清样本3例。分别于试剂卡加样孔出滴加100μ
l血清样本，室温反应 15分钟后使用公司自研的荧光分析仪进行检测，检测结果如下：
64.[0065][0066]
上述表格结果利用柱状图分析如图2-3所示，其中，图2为试剂卡1 的检测结果，阴性和确诊病人样本、疫苗后样本信号值形成明显差异，阴阳区分明显。图3为试剂卡2的检测结果，阴性和确诊病人样本、疫苗后样本信号值差异不明显，部分阴性样本出现假阳情况，分析为样本中的 ace2和标记垫的新型冠状病毒rbd抗原标记物反应，导致假阳结果出现。
[0067]
综合试剂卡1和试剂卡2的试验结果，抗血管紧张素转换酶-2中和抗体可优先阻断样本中ace2和结合垫的新型冠状病毒rbd抗原标记物反应，消除不同个人体内不同ace2含量引起的测试结果不一致情况，确保测试结果的准确性。
[0068]
尽管已用具体实施例来说明和描述了本实用新型，然而应意识到，在不背离本实用新型的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本实用新型范围内的所有这些变化和修改。