一种人体脱落细胞免疫荧光染色试剂盒及方法与流程

1.本发明涉及的是医学检验和恶性细胞分析领域，具体涉及人体脱落细胞包括实体瘤细胞脱落进入血液循环的循环肿瘤细胞(ctc)、胸腹腔积液脱落细胞、脑脊液脱落细胞、阴道宫颈脱落细胞、尿道脱落细胞、胃肠道脱落细胞及血液病细胞的荧光染色试剂和染色方法。


背景技术：

2.人体细胞分为细胞膜、细胞浆(细胞质)、细胞核和核仁四部分，细胞核仁是细胞生长发育和分化增殖的关键，恶性肿瘤病变恰恰是细胞分化和发育问题，在恶性肿瘤的发病和疾病进展过程中最先发生病理改变的是细胞核仁，所以在恶性肿瘤细胞病理学检验时应该注重细胞核和核仁病理形态学变化，细胞核尤其是核仁的变化是鉴定恶性肿瘤细胞的病理形态学基础。
3.在电子显微镜下，细胞核中的核仁的结构分为：(1)纤维中心：纤维中心是核仁的最内层结构，占核仁总体积的5％。是核仁标志物的核仁纤维蛋白、核仁蛋白、核仁磷酸蛋白、rna聚合酶i等的分布区域和所在地。纤维中心的数量、面积大小、形态等与细胞代谢活动、生长速度等密切相关，纤维中心实际上等同于细胞核的核仁中心，因而其数量、面积大小、形态及分布与细胞的恶性病理变化密切相关。(2)纤维组份:由4-10nm的纤维细丝构成，大约占核仁总体积的15％。它在核仁发生时首先形成与纤维中心紧密相连并环绕纤维中心。(3)颗粒组份：围绕着纤维组份，在致密型核仁中占75％左右。
4.传统的组织病理学检查、脱落细胞学检查和血液细胞检查主要是沿用多年的化学染色，可以看到恶性肿瘤细胞的基本结构如细胞膜、细胞桨和细胞核的形态学结构，显现恶性细胞的核大、核畸形和核浆比失调的部分细胞病理学特征；传统病理组织染色方法的主要技术缺点是不能清晰的显现核仁的形态结构与数量，不能分辨核仁与核浆，对恶性肿瘤细胞的形态学检验与分析带来较大的困扰。
5.目前，ctc细胞学检测基本分为化学染色和免疫荧光染色两种，化学染色和血液细胞检测相同，重复性差，灵敏度较低，基本不能清晰的显现核仁的形态结构；目前的免疫荧光染色法重点在于显示细胞表面抗原，通过dapi衬染显示细胞的基本形态来判断是否为ctc细胞，特别是不能显示ctc细胞核仁的形态结构与数量。例如美国fda批准的cell search ctc检测方法(国内外具代表性的染色检验方法，目前虽然有所改进但还是不能比较全面的真实反应ctc的真实性问题)，对ctc判断标准就是：细胞呈圆或椭圆形，epcam、ck、波形蛋白染色阳性，dapi可见细胞核形态、cd45染色阴性即为ctc。由于细胞表面抗原可能随着细胞经历脱落、转移和突变过程而改变，如emt或met转化过程中，细胞的某些抗原的表达就发生了变化，此外某些血液固有细胞表现抗原非法编辑，显示某些抗原染色阳性反应。所以，按目前国内外通用的免疫荧光染色法检测ctc，对ctc的判断是比较困难的，容易可出现假阳性或假阴性。本发明染色方法弥补上述染色方法的缺陷，除了显示恶性细胞整体形态(恶性细胞的核大、核畸形和核浆比失调的部分细胞病理学特征)外，重点在于可以清晰
的显示恶性细胞的核仁形态结构，数量与分布，细胞核畸形等恶性细胞病理形态学改变的关键环节和病变基础。为检测人员在辨别恶性细胞时增加了可靠的分析鉴定依据。本试剂和染色方法亦适用于其他体腔脱落细胞及血液病细胞的检验分析与识别，其基本原理是一样的。
6.外周血循环肿瘤细胞(ctc)检测是方兴未艾的癌症早期发现和诊断的可靠方法，提高检测的灵敏性和特异性是该方法普及使用的基础。传统的组织病理学检查、脱落细胞学检查和血液细胞检查主要是沿用多年的化学染色，可以看到恶性肿瘤细胞的基本结构如细胞膜、细胞桨和细胞核的形态学结构，显现恶性细胞的核大、核畸形和核浆比失调的部分细胞病理学特征，其主要技术缺点是不能清晰的显现核仁的形态与结构，不能明确标定核仁、不能分辨核仁与核浆，对恶性肿瘤细胞的形态学检测带来一定困扰。细胞核仁是细胞生长发育和分化增殖的关键，恶性肿瘤病变恰恰是细胞分化和发育问题，在恶性肿瘤的发病和疾病进展过程中最先发生病理改变的是细胞核仁，所以在恶性肿瘤细胞病理学检验时应该注重细胞核和核仁病理形态学变化，细胞核的变化尤其是核仁的变化是鉴定恶性肿瘤细胞的病理形态学基础。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种人体脱落细胞荧光染色方法及试剂盒。通过本染色方法与染色试剂盒能清晰完整的显示细胞核尤其是能标定细胞核的核仁，清晰可见核仁的数量、形态、体积大小和分布。这是分析人体细胞病理学的关键特征，再加上免疫荧光染色法特征性显示细胞浆和细胞膜的抗原，从而可以对人体脱落细胞进行全形态观察和分析。
8.本发明的基本原理为：
9.用本试剂盒和染色方法检测恶性的脱落细胞，syto rna select绿色荧光染料，将脱落细胞的细胞核仁与细胞核染成绿色，在荧光显微镜下细胞的核仁绿色特别集中，核仁形态与核仁数量清晰可见；其中细胞核为浅淡的绿色(比细胞核仁的绿色浅)。利用波形蛋白(vimentin)、上皮细胞黏附分子(epcam)、细胞角蛋白(ck)等的特异单克隆抗体标记红色荧光染料，对脱落细胞的细胞浆和细胞表面进行荧光染色，在荧光显微镜下呈现红色荧光。
10.本发明所采用的技术方案为：
11.根据本发明的第一方面，提供一种人体脱落细胞免疫荧光染色试剂盒，包括与细胞核仁rna有特殊亲和力的syto rna select绿色荧光染料、细胞膜和细胞浆抗原标志物特异单克隆抗体标记红色荧光染料、细胞固定液、细胞封闭液、漂洗液、稀释液、细胞膜与细胞核膜通透液。
12.具体情况下，所述特异单克隆抗体标记红色荧光染料为选自利用波形蛋白(vimentin)、上皮细胞黏附分子(epcam)、细胞角蛋白(ck)的单克隆抗体标记红色荧光染料中的一种或多种组合。所述波形蛋白(vimentin)也包括emt或met转化。所述ck(cytokeratin)具体包括ck8、ck18、ck19等。
13.具体情况下，所述特异单克隆抗体标记红色荧光染料为红色荧光染料标记的cd45单克隆抗体。
14.根据本发明的第二方面，提供一种人体脱落细胞荧光染色方法，包括以下步骤：
15.(1)提供和/或制备根据本发明第一方面所述的人体脱落细胞荧光染色试剂盒；
16.(2)配置抗体结合反应液：用稀释液分别稀释syto rna select绿色荧光染料、细胞膜和细胞浆抗原标志物特异单克隆抗体标记红色荧光染料，制成各抗体结合反应液；
17.(3)制备脱落细胞标本检测片；
18.(4)用细胞固定液固定细胞，10-20分钟；用漂洗液清洗1-3次；
19.(5)用细胞膜与细胞核膜通透液与细胞标本检测片37℃温育10-20分钟，弃净液体；
20.(6)用细胞封闭液封闭10-20分钟，弃净液体；
21.(7)加入步骤(2)中各抗体结合反应液，37℃染色30-60分钟、弃净液体，用漂洗液清洗1-3次；
22.(8)晾干待检。
23.具体情况下，脱落细胞包括实体瘤进入血液的循环肿瘤细胞、胸腹腔积液脱落细胞、脑脊液细胞、阴道宫颈脱落细胞、尿道脱落细胞、胃肠道脱落细胞及血液病细胞。
24.本发明主要是用对细胞核特别是细胞核仁rna由特殊亲和力的荧光染料syto rna select将细胞核仁和细胞核染成绿色，组合上皮细胞抗原等(epcam、ck、波形蛋白等)的单克隆抗体标记红色的荧光染料，将细胞浆和细胞表面染成红色。这样在荧光显微镜下就能完整的显示恶性细胞的形态结构，细胞核仁和细胞核显示绿色，细胞浆和细胞表面显示红色。组合dapi染色则细胞核可显示蓝色。恶性细胞在本染色显示其细胞核仁≧3个，且形态各异、大小不一，这是本发明的核心与关键部分。非恶性细胞一般为一个(正常血液细胞没有核仁)，不超过2个，且形态比较规则、大小基本一致。
25.本染色方法与染色试剂能清晰完整的显示细胞形态，尤其是能显示细胞核的核仁，清晰可见核仁的数量、形态、体积大小和分布；显示细胞核的形态；显示细胞浆和细胞表面的形态。
26.本发明的关键点和技术核心在于能清晰完整的显示细胞核尤其是能标定细胞核的核仁，清晰可见核仁的数量、形态、体积大小和分布。这是分析人体细胞病理学的关键特征，再加上免疫荧光染色法特征性显示细胞浆和细胞膜的抗原，从而可以对人体脱落细胞进行全形态观察和分析。
附图说明
27.图1为实施例1中ctc细胞荧光染色结果照片。
28.图2为实施例2中胸腹水脱落细胞荧光染色结果照片。
29.图3为实施例3中血液病细胞荧光染色结果照片。
具体实施方式
30.本发明提供四种组合试剂及操作方法：
31.一、第一组试剂组合及实施方式
32.提供第一种脱落细胞荧光染色试剂组合，操作方法包括以下步骤：
33.(1)提供和/或制备脱落细胞特征性荧光检测试剂，包括细胞固定液、细胞封闭液、漂洗液、稀释液、细胞膜与细胞核膜通透液、细胞核仁标志物的荧光染料syto rna select green、细胞膜和细胞浆抗原标志物为波形蛋白(vimentin)单克隆抗体荧光标记物。
34.(2)配置细胞荧光染色液：用稀释液分别稀释syto rna select green荧光染料、波形蛋白(vimentin)单克隆抗体荧光标记物，制成细胞荧光染色液；
35.(3)制备外周血细胞标本检测片；
36.(4)用细胞固定液固定细胞，10-20分钟；用漂洗液清洗1-3次；
37.(5)用细胞膜与细胞核膜通透液与细胞标本检测片37℃温育10-20分钟，弃净液体；
38.(6)用细胞封闭液封闭10-20分钟，弃净液体；
39.(7)加入步骤(2)中细胞荧光染色液，37℃染色30-60分钟、弃净液体，用漂洗液清洗1-3次；
40.(8)晾干待检。
41.二、第二组试剂组合及实施方式
42.提供第二种脱落细胞荧光染色试剂组合，操作方法包括以下步骤：
43.(1)提供和/或制备免疫荧光细胞学检测试剂，包括细胞固定液、细胞封闭液、漂洗液、稀释液、细胞膜与细胞核膜通透液、syto rna select green荧光染色液、细胞浆和细胞膜标志物上皮细胞粘附分子epcam、ck单克隆抗体红色荧光标记物。
44.(2)配制细胞荧光染色液：用稀释液分别稀释syto rna select green、红色荧光标记的epcam、ck单克隆抗体，形成细胞荧光染色液；
45.(3)制备外周血脱落细胞标本检测片；
46.(4)用细胞固定液固定细胞，10-20分钟；用漂洗液清洗1-3次；
47.(5)用细胞膜与细胞核膜通透液与细胞标本检测片37℃温育10-20分钟，弃净液体；
48.(6)用细胞封闭液37℃封闭10-20分钟，弃净液体；
49.(7)加入步骤(2)中细胞荧光染色液，37℃染色30-60分钟、弃净液体，用漂洗液清洗1-3次；
50.(8)晾干待检。
51.三、第三组试剂组合及实施方式
52.提供第三种脱落细胞荧光染色试剂组合，操作方法包括以下步骤：
53.(1)提供和/或制备外周血细胞荧光检测试剂，包括细胞固定液、细胞封闭液、漂洗液、稀释液、细胞膜与细胞核膜通透液、细胞核仁标志物荧光染料syto rna select green、细胞膜和细胞浆标志物ck8、ck18、ck19、epcam、波形蛋白单克隆抗体红色荧光标记物；
54.(2)配制细胞荧光染色液：用稀释液分别稀释syto rna select green、红色荧光标记的ck(ck8、ck18和ck19)、epcam、波形蛋白的单克隆抗体，形成细胞荧光染色液；
55.(3)制备脱落细胞标本检测片；
56.(4)用细胞固定液固定细胞，10-20分钟，用漂洗液清洗1-3次；
57.(5)用细胞膜与细胞核膜通透液与细胞标本检测片37℃温育10-20分钟，弃净液体；
58.(6)用细胞封闭液封闭10-20分钟，弃净液体；
59.(7)加入步骤(2)中的细胞荧光染色液，37℃染色30-60分钟、弃净液体，用漂洗液清洗1-3次；
60.(8)晾干待检。
61.四、第四组试剂组合及实施方式
62.提供第四种血液病细胞(如白血病细胞)荧光染色方法与试剂组合，操作方法包括以下步骤：
63.(1)提供和/或制备脱落细胞荧光检测试剂，包括细胞固定液、细胞封闭液、漂洗液、稀释液、细胞膜与细胞核膜通透液、细胞核仁标志物荧光染料syto rna select green、细胞膜和细胞浆标志物cd45单克隆抗体红色荧光标记物；
64.(2)配制荧光染色反应液：用稀释液稀释syto rna select green、红色荧光标记的cd45单克隆抗体，形成荧光染色反应液；
65.(3)血液病细胞标本检测片；
66.(4)用细胞固定液固定细胞，10-20分钟，用漂洗液清洗1-3次；
67.(5)用细胞膜与细胞核膜通透液与细胞标本检测片37℃温育10-20分钟，弃净液体；
68.(6)用细胞封闭液封闭10-20分钟，弃净液体；
69.(7)加入步骤(2)中的荧光染色反应液，37℃染色30-60分钟、弃净液体，用漂洗液漂洗1-3次；
70.(8)晾干待检。
71.下面通过具体实施例详细描述本发明的具体细节。
72.实施例1 ctc细胞荧光染色
73.(1)试剂盒的试剂包括:
74.细胞固定液：甲醇、丙酮、多聚甲醛。
75.细胞封闭液包括：ph7.2-7.4pbs(含1％bsa或小牛血清)。
76.漂洗液包括：ph7.2-7.4pbs(含吐温-20)。
77.稀释液包括：ph7.2-7.4pbs(含1％bsa或小牛血清)。
78.细胞膜与细胞核膜通透液包括：0.2-0.5％曲拉通x-100。
79.细胞核仁标志物荧光染料syto rna select green。
80.ck、epcam、波形蛋白的单克隆抗体红色荧光标记物。
81.其它试剂：磷酸缓冲液(pbs)、小牛血清白蛋白(bsa)、驴血浆(清)、吐温-20、tris-hcl等。
82.(2)荧光染色方法：
83.①
制备ctc细胞检测片。
84.②
用甲醇或4％多聚甲醛固定细胞，10-20分钟。
85.③
用漂洗液(ph7.2-7.4pbs(含吐温-20))清洗1-3次。
86.④
用0.5％曲拉通与细胞制片片温育(37℃)10-20分钟，弃净液体。
87.⑤
用含1％bsa封闭10-20分钟(37℃)，弃净液体。
88.⑥
加syto rna select green和红色荧光标记ck、epcam、波形蛋白的单克隆抗体染色试剂，37℃染色30-60分钟。弃净液体，用漂洗液(ph7.2-7.4pb(含吐温-20)清洗1-3次。
89.⑦
待干，封片、镜检(荧光共聚焦显微镜或荧光显微镜)。
90.参见图1，荧光显微镜下，ctc细胞核仁显深绿色集中核仁，细胞核浆显浅绿色，细
胞浆和细胞表面显红色。
91.实施例2胸腹水脱落细胞荧光染色
92.(1)试剂盒试剂：
93.细胞固定液：甲醇、丙酮、多聚甲醛。
94.细胞封闭液包括：ph7.2-7.4pbs(含1％bsa或小牛血清)。
95.漂洗液包括：ph7.2-7.4pbs(含吐温-20)。
96.稀释液包括：ph7.2-7.4pbs(含1％bsa或小牛血清)。
97.细胞膜与细胞核膜通透液包括：0.2-0.5％曲拉通x-100。
98.细胞核仁标志物荧光染料syto rna select green。
99.epcam、ck单克隆抗体红色荧光标记物。
100.其它试剂：磷酸缓冲液(pbs)、小牛血清白蛋白(bsa)、驴血浆(清)、吐温-20、tris-hcl等。
101.(2)荧光染色方法：
102.①
制备胸腹水脱落细胞检测片。
103.②
用甲醇或4％多聚甲醛固定细胞，10-20分钟。
104.③
用漂洗液(ph7.2-7.4pbs(含吐温-20))清洗1-3次。
105.④
用0.5％曲拉通与细胞制片片温育(37℃)10-20分钟，弃净液体。
106.⑤
用含1％bsa封闭10-20分钟(37℃)，弃净液体。
107.⑥
加syto rna select green和红色荧光标记epcam、ck单克隆抗体染色试剂，37℃染色30-60分钟。弃净液体，用漂洗液(ph7.2-7.4pbs(含吐温-20))清洗1-3次。
108.⑦
待干，封片、镜检(荧光共聚焦显微镜或荧光显微镜)。
109.参见图2，荧光显微镜下，脱落的恶性细胞的细胞核仁显深绿色集中核仁，细胞核浆显浅绿色，细胞浆和细胞表面显红色。
110.实施例3血液病细胞荧光染色
111.(1)试剂盒试剂
112.细胞固定液：甲醇、丙酮、多聚甲醛。
113.细胞封闭液包括：ph7.2-7.4pbs(含1％bsa或小牛血清)。
114.漂洗液包括：ph7.2-7.4pbs(含吐温-20)。
115.稀释液包括：ph7.2-7.4pbs(含1％bsa或小牛血清)。
116.细胞膜与细胞核膜通透液包括：0.2-0.5％曲拉通x-100。
117.细胞核仁标志物荧光染料syto rna select green。
118.cd45单克隆抗体红色荧光标记物。
119.其它试剂：磷酸缓冲液(pbs)、小牛血清白蛋白(bsa)、驴血浆(清)、吐温-20、tris-hcl等。
120.(2)荧光染色方法
121.①
制备血液病细胞检测片。
122.②
用甲醇或4％多聚甲醛固定细胞，10-20分钟。
123.③
用漂洗液(ph7.2-7.4pbs(含吐温-20))清洗1-3次。
124.④
用0.5％曲拉通与细胞制片温育(37℃)10-20分钟，弃净液体。
125.⑤
用含1％bsa封闭10-20分钟(37℃)，弃净液体。
126.⑥
加syto rna select green和红色荧光标记cd45单克隆抗体染色剂，37℃染色30-60分钟。弃净液体，用漂洗液(ph7.2-7.4pbs(含吐温-20))清洗1-3次。
127.⑦
待干，封片、镜检(荧光共聚焦显微镜或荧光显微镜)。
128.参见图3，荧光显微镜下，血液病细胞的细胞核仁显深绿色集中核仁，细胞核浆显浅绿色，细胞浆和细胞表面显红色。