基于微流体聚集的鱼肉鲜度检测纸基芯片的制作及应用

1.本发明涉及纸基检测技术领域，具体而言，特别涉及一种基于微流体聚集的鱼肉鲜度检测纸基芯片的制作及应用。


背景技术：

2.鱼肉是所有肉类中最容易消化的，消化继而被人体吸收的转化率能够达到90％。鱼肉中蛋白质的含量较高，且容易被人体所消化吸收。鱼肉还含有人体所需的不同种类氨基酸，其中亮氨酸和赖氨酸是人体需求最多鱼中含有量也丰富的两大氨基酸。鱼肉中的脂肪含量相对较低，含量只在1％-10％，大大低于牲畜肉。鱼肉中的脂肪也是很容易被人们消化吸收的，它呈中性，人们的消化率接近百分之百。鱼肉中的无机盐含量和种类均比较丰富，含量比畜肉多十到五十倍之间，种类也高达十种以上。此外鱼肉中还含有大量的人体必不可少的微量元素。因此，鱼肉的营养价值非常高。
3.鱼类新鲜度的检测关系到鱼制品的安全卫生和营养程度等各个方面，在鱼制品的加工生产流通消费过程中均非常重要。合适的标志物选择对水产品质量评价具有重要的意义。次黄嘌呤作为一种重要的生物碱，是三磷酸腺苷（atp）的主要分解代谢产物。水产品死亡后，体内的 atp 在酶的作用下发生一系列降解反应，产生次黄嘌呤。相比水产品鲜度的其他特征标志物，雌黄嘌呤在水产品变质的早期即产生。因此，对次黄嘌呤含量的准确、快速测定有助于评估水产品的早期新鲜度，对于更好的评估水产品运输过程的品质以及进一步对运输环境等做出调整具有重要意义。
4.目前，水产品新鲜程度评价的方式主要包括传统感官评价方法和仪器检测方法。感官评价主观性较强，且仅能判断发生腐败的水产品。仪器检测法主要包括高效液相色谱法,毛细管柱气相色谱法,毛细管电泳法,荧光质谱法以及电化学等方法。这些方法也有很多局限性，如操作较复杂，检测所需时间较长，需要昂贵的仪器和专业人员操作等。此外，鱼肉中复杂的基质组成使得新鲜度的检测往往需要较为复杂的前处理过程。样品的前处理，包括组织捣碎、高速离心、反复的提取净化，不仅需要较为完备的实验设备，而且耗时一般在2-3小时以上甚至更长。因此，过去人们用于检测鱼类新鲜度的一些方法的实验仪器设备昂贵，操作方法需要专业人员进行专业作业，时间及人员的付出上不可估量，推行的难度较大。为了弥补现有技术的不足，一方面需要开发简单的检测方法，方便携带和应用；另一方面该方法可以克服复杂的基质干扰，去除大分子物质的干扰；再次，需要建立非主观的结果判别方法，如基于智能手机的判别方法。


技术实现要素：

5.为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种基于微流体聚集的鱼肉鲜度检测纸基芯片的制作及应用。
6.本发明是通过如下技术方案实现的：一种基于微流体聚集鱼肉鲜度检测纸基芯片的制作方法，具体包括以下步骤：
s1、配制纸基芯片的所需要的修饰液m：s11、显色液配制：称取0.096 g 3,3’,5,5
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四甲基联苯胺（tmb）粉末，溶于1 ml的dmso溶解，配制成浓度为400 mm的tmb母液，稀释为60-100 mm备用；s12、辣根过氧化物酶（hrp）母液配制：将hrp溶于磷酸盐缓冲液（pbs，20 mm，ph=7.4），配制5000 u/ml的母液。继续稀释为20-100 u/ml备用；s13、修饰液m配制：将壳聚糖寡糖乳酸（col）溶液、显色液和25 u/ml hrp溶液按照n：1：1（体积比，n=3-8）的比例混合均匀；s2、配制纸基芯片的所需要的修饰液n：s21、黄嘌呤氧化酶（xod）溶液配制：将xod溶于磷酸盐缓冲液（pbs，20 mm，ph=7.4），配制100-500 u/ml的酶液；s22、修饰液n配制：将300 u/ml的xod溶液与1wt%壳聚糖溶液按照等体积比例混合均匀；s3、纸基裁剪：将纸基材料裁剪成1.5 cm * 1.5 cm的正方形作为芯片的纸基；s4、第一步修饰：吸取0.7 μl修饰液m滴加于nc膜上，室温下干燥2 min；s5、第二步修饰：干燥后再取1 μl修饰液n滴加于刚刚修饰的位点上，室温下干燥1.5 min，即可完成修饰；s6、按照同样s3-s4的方法，单个纸基上至多可以修饰4个检测位点；s7、纸基芯片的预包装：将制作完成的纸基芯片5个一组装进6 cm*10 cm的铝箔真空包装袋中，用抽真空机进行抽真空处理和热塑封；s8、储存：将包装好的纸基芯片放置于4 ℃的冰箱中储存备用。
7.作为优选方案，步骤s13中的壳聚糖寡糖乳酸（col）溶液的配制为称取0.2-0.3 g 的col粉末（5-10 kda），加入9.8 ml水和0.2 ml 乙酸，50 ℃下搅拌加热10 min，至壳聚糖寡糖乳酸溶解。
8.作为优选方案，步骤s22中的1wt%壳聚糖溶液的配制为称取0.05-0.1 g壳聚糖溶液粉末（100-300 kda），加入9.8 ml水和0.2 ml乙酸，50 ℃下搅拌加热10 min至壳聚糖溶解。
9.作为优选方案，步骤s3中的纸基材料包括硝酸纤维素膜、whatman 1号色谱纸、国产宝威德滤纸和染色纸中的一种。
10.进一步地，纸基材料为硝酸纤维素膜（nc膜）。
11.一种基于微流体聚集鱼肉鲜度检测纸基芯片的检测方法，具体包括以下步骤：t1、次黄嘌呤标准曲线绘制：t11、次黄嘌呤的浓度梯度设置为0.01-5.2 mm；t12、对结果进行拍摄，拍摄规范：将手机拍照模式选择为专业模式；光源选择为手机内置led光源；感光度iso选择为50；测光模式选择为点测光模式；快门速度s设置为1/36；曝光补偿ev设置为0；对焦模式af选择为单次自动对焦；白平衡模式wb设置为自动白平衡awb；手机拍照时距离目标25 cm，且无外置光源；颜色强度模型化处理：首先将手机拍摄的照片传输到电脑上，利用 image j软件打开。在图片中颜色改变的部分用选择功能，框选出30 * 30个像素单位，并用软件的直方图功能analyze-histogram，得到所选区域的平均r, g, b值。对于得到的rgb值，进行欧几里得距离化模型d处理，公式（1）所示；没有特殊说明的
情况下，后续实验中对于颜色强度的结果均按照此方法进行处理。
12.式中：r0,g0,b0分别是空白组检测区域的平均rgb值；ri,gi,bi分别代表第i组实验显色区域的平均rgb值；将结果绘制成标准曲线，并计算出检出限和线性范围；t2、鱼肉样品的贴体检测实验：将放置于4 ℃下6、5、4、3、2、1天的海鲈鱼鱼块取出，放置室温10min后，将纸基芯片贴合在鱼肉表面等待3 min，图像采集和数据处理方法为t12的方法；t3、移动端新鲜度检测小程序的制作：通过开发小程序功能，实现对目标颜色的采集，把颜色信号转化为平均rgb值，经过公式（1）对数值进行转化并与标准曲线相对应，通过得到的次黄嘌呤浓度判断样品的新鲜程度，最终给出是否可食用建议。
13.作为优选方案，步骤t12中对于靶标次黄嘌呤检测的线性范围为0.01 mm ~ 0.16 mm，线性回归方程为y=492.722x + 32.798，式中y为颜色强度，x为次黄嘌呤的浓度，相关系数r2为0.9903，检测限lod为8.22 μm。
14.本发明由于采用了以上技术方案，与现有技术相比使其具有以下有益效果：，该方法利用不同分子量的多糖逐层修饰于硝酸纤维素膜，修饰后的硝酸纤维素膜具备膜多孔结构-大分子量孔隙-小分子量孔隙结构进而形成微流体聚集效应。通过将黄嘌呤氧化酶（xod）和辣根过氧化物酶（hrp）固定在硝酸纤维素膜上，并联用3,3’,5,5
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四甲基联苯胺（tmb）作为显色剂，制备成纸基芯片，实现对鱼肉中次黄嘌呤的检测。将纸基芯片直接贴于水产品表面，鱼肉表面的基液会通过不同孔径形成微流体并聚集到固定化酶位置，从而实现次黄嘌呤的直接检测，而由于不同分子量多糖修饰层孔径的不同，蛋白质等干扰基质组分会被截留，减少基质的干扰，从而实现对水产品新鲜度的肉眼直接检测。
15.本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
16.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1为纸基芯片制作过程示意图；图2为制备出的纸基芯片表现出的微流体聚集效应，图中 a为本文修饰方法；b为whatman 1号色谱纸；c为国产宝威德滤纸；d为染色纸；图3为纸基生物传感器检测次黄嘌呤的标准曲线（左）和检测的线性范围（右）；图4为纸基芯片贴体检测鱼肉新鲜度颜色信号；图5为移动端新鲜度快速检测小程序。
具体实施方式
17.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施
例及实施例中的特征可以相互组合。
18.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
19.下面结合图1至图5对本发明的实施例的基于微流体聚集的鱼肉鲜度检测纸基芯片的制作及应用进行具体说明。
20.实施例1如图1所示，一种基于微流体聚集鱼肉鲜度检测纸基芯片的制作方法，具体包括以下步骤：s1、配制纸基芯片的所需要的修饰液m：s11、显色液配制：称取0.096 g 3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺（tmb）粉末，溶于1 ml的dmso溶解，配制成浓度为400 mm的tmb母液，稀释为60-100 mm备用；s12、辣根过氧化物酶（hrp）母液配制：将hrp溶于磷酸盐缓冲液（pbs，20 mm，ph=7.4），配制5000 u/ml的母液。继续稀释为20-100 u/ml备用；s13、修饰液m配制：将壳聚糖寡糖乳酸（col）溶液、显色液和25 u/ml hrp溶液按照n：1：1（体积比，n=3-8）的比例混合均匀；壳聚糖寡糖乳酸（col）溶液的配制为称取0.2-0.3 g 的col粉末（5-10 kda），加入9.8 ml水和0.2 ml 乙酸，50 ℃下搅拌加热10 min，至壳聚糖寡糖乳酸溶解。
21.s2、配制纸基芯片的所需要的修饰液n：s21、黄嘌呤氧化酶（xod）溶液配制：将xod溶于磷酸盐缓冲液（pbs，20 mm，ph=7.4），配制100-500 u/ml的酶液；s22、修饰液n配制：将300 u/ml的xod溶液与1wt%壳聚糖溶液按照等体积比例混合均匀；1wt%壳聚糖溶液的配制为称取0.05-0.1 g壳聚糖溶液粉末（100-300 kda），加入9.8 ml水和0.2 ml乙酸，50 ℃下搅拌加热10 min至壳聚糖溶解。
22.s3、纸基裁剪：将硝酸纤维nc膜裁剪成1.5 cm * 1.5 cm的正方形作为芯片的纸基；s4、第一步修饰：吸取0.7 μl修饰液m滴加于nc膜上，室温下干燥2 min；s5、第二步修饰：干燥后再取1 μl修饰液n滴加于刚刚修饰的位点上，室温下干燥1.5 min，即可完成修饰；s6、按照同样s3-s4的方法，单个纸基上至多可以修饰4个检测位点；没有特殊说明的情况下，后续实验的纸基修饰方法均按照此步骤实施。
23.s7、纸基芯片的预包装：将制作完成的纸基芯片5个一组装进6 cm*10 cm的铝箔真空包装袋中，用抽真空机进行抽真空处理和热塑封；s8、储存：将包装好的纸基芯片放置于4 ℃的冰箱中储存备用。
24.一种基于微流体聚集鱼肉鲜度检测纸基芯片的检测方法，具体包括以下步骤：t1、次黄嘌呤标准曲线绘制：t11、按照优化好的条件，我们将此方法应用于次黄嘌呤的检测。次黄嘌呤的浓度梯度设置为0.01-5.2 mm；t12、对结果进行拍摄，拍摄规范：将手机拍照模式选择为专业模式；光源选择为手
机内置led光源；感光度iso选择为50；测光模式选择为点测光模式；快门速度s设置为1/36；曝光补偿ev设置为0；对焦模式af选择为单次自动对焦；白平衡模式wb设置为自动白平衡awb；手机拍照时距离目标25 cm，且无外置光源；颜色强度模型化处理：首先将手机拍摄的照片传输到电脑上，利用 image j软件打开。在图片中颜色改变的部分用选择功能，框选出30 * 30个像素单位，并用软件的直方图功能analyze-histogram，得到所选区域的平均r, g, b值。对于得到的rgb值，进行欧几里得距离化模型d处理，公式（1）所示；没有特殊说明的情况下，后续实验中对于颜色强度的结果均按照此方法进行处理。
25.式中：r0,g0,b0分别是空白组检测区域的平均rgb值；ri,gi,bi分别代表第i组实验显色区域的平均rgb值；将结果绘制成标准曲线，并计算出检出限和线性范围；t2、鱼肉样品的贴体检测实验：将放置于4 ℃下6、5、4、3、2、1天的海鲈鱼鱼块取出，放置室温10min后，将纸基芯片贴合在鱼肉表面等待3 min，图像采集和数据处理方法为t12的方法；t3、移动端新鲜度检测小程序的制作：为了使本新鲜度检测纸基芯片进行比色判断时结果更加准确和方便，我们尝试开发了移动端新鲜度检测小程序。手机作为人们日常生活中不可缺少的工具，为现场检测提供了有力的支持，其中微信中的小程序功能方便快捷，经常在日常生活中被人们所使用。通过开发小程序功能，实现对目标颜色的采集，把颜色信号转化为平均rgb值，经过公式（1）对数值进行转化并与标准曲线相对应，通过得到的次黄嘌呤浓度判断样品的新鲜程度，最终给出是否可食用建议。
26.实施例2步骤s3中的纸基材料选用whatman 1号色谱纸，其余步骤与实施例1相同。
27.实施例3步骤s3中的纸基材料选用国产宝威德滤纸，其余步骤与实施例1相同。
28.实施例4步骤s3中的纸基材料选用染色纸，其余步骤与实施例1相同。
29.作为优选方案，步骤t12中对于靶标次黄嘌呤检测的线性范围为0.01 mm ~ 0.16 mm，线性回归方程为y=492.722x + 32.798，式中y为颜色强度，x为次黄嘌呤的浓度，相关系数r2为0.9903，检测限lod为8.22 μm。因此本纸基生物传感器可以用来检测靶标次黄嘌呤，从而实现对样品新鲜度的判断。
30.纸基芯片的颜色聚集效果研究了修饰方法的颜色聚焦效果，包括实施例1-4的硝酸纤维膜、whatman 1号色谱纸，染色纸、宝威德国产滤纸，按照同样的方法进行纸基的修饰，结果如图2所示，只有硝酸纤维素膜展现了较好的颜色聚焦性能，而其他纸基材料则存在显色不明显，颜色分散等问题。这是由于nc膜的孔径大小为0.22 μm，远远小于另外三种材料的孔径，因此可以更好进行修饰，最终呈现出较好的颜色聚集性。
31.标准曲线利用制备的硝酸纤维nc膜纸基芯片检测浓度范围为0.01 mm ~ 5.2 mm的靶标次
黄嘌呤，并用水作为空白对照。实验结果如图3所示，硝酸纤维膜纸基芯片的颜色在3分钟内逐渐加深并且达到最大，可以轻易通过肉眼进行初步的信号判读。用华为mate 20手机对颜色信号进行获取并用image j软件读取拍照部分显色区域的平均rgb值，可以看到，随着次黄嘌呤浓度的增加，颜色强度也随之增加；当次黄嘌呤浓度达到1.3 mm后，颜色强度增长逐渐平缓。其中，在次黄嘌呤浓度为0.01-0.16 mm时，标准曲线具有较好的线性，r2为0.9903，同时计算检出限为8.22 μm，具有较低的检出限。
32.本方法对于靶标次黄嘌呤检测的线性范围为0.01 mm ~ 0.16 mm，线性回归方程为y=492.722x + 32.798（y为颜色强度，x为次黄嘌呤的浓度），相关系数（r2）为0.9903，检测限（lod）为8.22 μm，因此本纸基生物传感器可以用来检测靶标次黄嘌呤，从而实现对样品新鲜度的判断。
33.鱼肉样品的贴体检测本方法研制的纸基生物传感器具有的一大优势，是可以直接将此纸基生物传感器贴附于鱼肉的表面进行新鲜度的测试，而不用对鱼肉样品进行预处理过程。因此，大大提高了检测的速度，使新鲜度检测更加方便，为水产品新鲜度现场检测提供了支持。由于鱼肉在逐渐腐坏过程中产生次黄嘌呤，因此随着时间的推延，鱼肉的表面的次黄嘌呤也会逐渐积累。并且鱼肉表面是较为湿润的环境，为纸基芯片能够直接贴在鱼肉表面进行检测提供了必要条件。
34.将此纸基生物传感器分别贴附于放置了不同时间的海鲈鱼肉表面，观察纸基芯片的是否产生颜色信号，产生的颜色信号用华为mate 20手机进行图像获取。结果如图4所示，纸基芯片在海鲈鱼保存第一天显示的颜色较浅，说明此时次黄嘌呤积累量较少，鱼肉新鲜程度较高；纸基芯片在海鲈鱼保存的第二天和第三天颜色开始加深，说明从第二天开始，次黄嘌呤的积累量逐渐增加，鱼肉的新鲜程度逐渐降低；第四天第五天和第六天，纸基芯片显示的颜色变得很深，说明次黄嘌呤积累量很大，鱼肉已经开始腐坏。
35.移动端新鲜度快速检测小程序的研制开发了移动端的微信小程序，实现了对水产品在线新鲜度的评估，并且给出相应的食用建议。
36.本微信小程序主要的功能区域分为三块，如图5所示，第一块区域为颜色图像的采集区域，通过智能手机的拍照功能，对本纸基生物传感器的颜色结果进行信息的上传；第二块区域为目标颜色区域的选择模块，此模块可以选择上传的图像中颜色显示部分，经过程序读取此区域内的平均rgb值；第三块区域为空白对照选择区，可以对纸基芯片中空白试验的区域图像进行上传并读取平均rgb值。最终经过后台程序进行数据的处理和转化，对目标区域颜色的结果进行输出，同时给出食用建议。
37.在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
38.以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、
等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。