一种依折麦布中基因毒性杂质的检测方法与流程

1.本发明涉及一种依折麦布中基因毒性杂质的检测方法，属于分析检测技术领域。


背景技术：

2.依折麦布(ezetimibe)，化学名称为1-(4-氟苯基)-3(r)-[3-(4-氟苯基)-3(s)-羟丙基]-4(s)-(4-羟苯基)-2-吖丁啶(氮杂环丁烷)酮，其化学结构式如下：
[0003][0004]
分子式：c
24h21
f2no3[0005]
分子量：409.43
[0006]
依折麦布是首个获得fda批准胆固醇吸收选择性抑制剂药物，适用原发性高胆固醇血症治疗、纯合子家族性高胆固醇血症(hofh)、纯合子谷甾醇血症(或植物甾醇血症)的治疗。
[0007]
根据依折麦布原料的合成工艺路线，本品合成中存在引入基因毒性杂质对氯苯胺、对氟苯胺、对羟基苯甲醛和对氟硝基苯的风险，具体结构式如下：
[0008]
[0009][0010]
根据依折麦布片说明书中的临床用法用量，本品最大日口服剂量为10mg，因此按照ichm7评估和控制药物中dna反应的(诱变的)杂质以限制潜在的致癌风险中关于基因毒性杂质限度的计算方法，依折麦布原料中基因毒性杂质的限度为0.015％。
[0011]
到目前为止，未见有依折麦布基因毒性杂质的检测方法的报道，因此急需要开发一种快速、有效检测基因毒性杂质的分析方法，以控制依折麦布原料及制剂的质量。


技术实现要素：

[0012]
本发明的目的是针对现有的技术缺陷，提供一种依折麦布中基因毒性杂质的检测方法，以快速、有效地检测依折麦布原料药及制剂中潜在的基因毒性杂质，以控制依折麦布原料及制剂质量，具有较大的应用价值和经济价值。
[0013]
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0014]
一种含依折麦布原料药物的基因毒性杂质的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：
[0015]
(1)分别配制药物供试品溶液和基因毒性杂质对照品溶液；
[0016]
(2)将步骤(1)所得的药物供试品溶液和基因毒性杂质对照品溶液分布注入液相色谱仪，完成基因毒性杂质的测定；采用外标法计算药物中基因毒性杂质的含量；
[0017]
所述的基因毒性杂质为对氟硝基苯、对氟苯胺、对氯苯胺、对羟基苯甲醛中的一种或多种。
[0018]
所述步骤(2)液相色谱条件为：
[0019]
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0020]
流动相采用梯度洗脱方法，流动相a为乙腈或甲醇，流动相b为磷酸盐缓冲液，流动相a的体积百分比与流动相b的体积百分比的和始终保持为100％；
[0021]
梯度洗脱程序为：0
→
35min，90％流动相b；35
→
40min，90％
→
20％流动相b；40
ꢀ→
50min，20％流动相b，所述百分比均为体积百分比。
[0022]
作为一个优选技术方案，磷酸盐缓冲液所用磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、磷酸氢二胺、磷酸二氢铵中的一种或几种；磷酸盐缓冲液浓度为0.01～0.1mol/l；
[0023]
磷酸盐缓冲液ph值为5.0～8.0；
[0024]
作为一个优选技术方案，上述梯度洗脱方法中流动相为乙腈和磷酸盐缓冲液，即流动相a为乙腈，流动相b为磷酸盐缓冲液。
[0025]
进一步优选，磷酸盐缓冲液为0.025mol/l；
[0026]
进一步优选，磷酸盐缓冲液ph值为5.8-6.2，最优选ph值为6.0；可用磷酸或氢氧化钠溶液或氨水调节至所需ph值。
[0027]
进一步优选，上述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾溶液。
[0028]
作为优选技术方案，上述步骤(1)包括如下操作：取供试品含依折麦布的药物(原料药或制剂)、基因毒性杂质对照品对氯苯胺、对氟苯胺、对羟基苯甲醛、对氟硝基苯，分别置于容量瓶中，用溶剂溶解，分别配制供试品溶液和对照品溶液，所述供试品溶液按依折麦布计算浓度为5～10mg/ml，优选10mg/ml；所述基因毒性杂质对照品溶液的浓度分别为0.75～1.8μg/ml，优选1.5μg/ml。
[0029]
作为优选技术方案，上述步骤(1)所用的溶剂为乙腈-磷酸盐缓冲液，体积比为70:30。其中磷酸盐缓冲液所用磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、磷酸氢二胺、磷酸二氢铵的一种或几种，优选0.025mol/l的磷酸二氢钾溶液(用磷酸或氢氧化钠溶液调节ph值到6.0)或0.025mol/l的磷酸二氢铵溶液 (用氨水调节ph值到6.0)，进一步优选0.025mol/l的磷酸二氢铵溶液(用氨水调节ph 值到6.0)。
[0030]
作为优选技术方案，上述步骤(2)中，高效液相色谱所用色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为150～250mm，优选250mm；内径为3.0～4.6mm，优选4.6mm；粒径为2.7～5μm，优选5μm；
[0031]
作为优选技术方案，上述步骤(2)中检测器为紫外检测器，检测波长为210nm。
[0032]
作为优选技术方案，上述步骤(2)中高效液相色谱法的流速为0.5～2.0ml/min/min，优选1.5ml/min；进样体积为10～100μl，优选20μl；色谱柱柱温为20～40℃。
[0033]
作为一个优选技术方案，上述步骤(2)中高效液相色谱检测方法的梯度洗脱方法如下：
[0034]
流动相a：乙腈
[0035]
流动相b：0.025mol/l的磷酸二氢钾溶液(用磷酸或氢氧化钠溶液调节ph值到6.0)
[0036]
梯度洗脱如下：
[0037][0038]
该技术方案进一步优选：流速为0.5～2.0ml/min，优选1.4-1.6ml/min，最优选1.5ml/min；进样体积为10～100μl，优选20μl；色谱柱柱温为20～40℃，优选20～30℃，最优选25℃。检测波长：210nm。溶剂优选0.025mol/l的磷酸二氢铵溶液(用氨水调节ph值到6.0)。
[0039]
上述依折麦布为依折麦布原料药及制剂，特别是针对依折麦布原料药，可以阻止不合格的原料药制成制剂，从源头阻止对患者的安全造成潜在危害。
[0040]
作为优选技术方案，所述基因毒性杂质的检测限和定量限均符合限度要求。
[0041]
本发明的检测方法取得了有益效果为：
[0042]
可以将含依折麦布药物中基因毒性杂质对氟硝基苯、对氟苯胺、对氯苯胺、对羟基苯甲醛与供试品中其他物质达到有效分离，具有灵敏度高、专属性强、准确度高、耐用性好
等优点，可以快速有效的检测依折麦布原料药及制剂中的基因毒性杂质，从而解决了基因毒性杂质分离和测定较为困难的问题，从而保证了依折麦布原料药及制剂的质量可控。
附图说明
[0043]
图1空白溶剂液相色谱图
[0044]
图2对照品溶液液相色谱图
[0045]
图3供试品溶液液相色谱图
[0046]
图4加标供试品溶液液相色谱图
具体实施方式
[0047]
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
[0048]
实施例1：包括以下步骤：
[0049]
1、配制磷酸盐缓冲液：
[0050]
取磷酸二氢钾3.4g，加水1000ml溶解，用磷酸或氢氧化钠溶液调节ph值至6.0，制得浓度为0.025mol/l的磷酸盐缓冲溶液。
[0051]
2、配制稀释剂溶液：
[0052]
取乙腈和上述磷酸盐缓冲液体积比为70:30比例，混合均匀，配制得到稀释剂溶液。
[0053]
3、配制对照品溶液：
[0054]
对氟苯胺对照品贮备液：取对氟苯胺对照品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对氟苯胺对照品贮备液。
[0055]
对羟基苯甲醛对照品贮备液：取对羟基苯甲醛对照品约15mg，精密称定，置100ml 量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对羟基苯甲醛对照品贮备液。
[0056]
对氟硝基苯对照品贮备液：取对氟硝基苯对照品约15mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对氟硝基苯对照品贮备液。
[0057]
对氯苯胺对照品贮备液：取对氯苯胺对照品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对氯苯胺对照品贮备液。
[0058]
分别取上述对照品贮备液适量，置同一100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成为约1.5μg/ml的溶液，作为对照品溶液。
[0059]
4、配制供试品溶液：
[0060]
取依折麦布原料药适量，置于容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释制成按照依折麦布计 10mg/ml浓度的溶液。
[0061]
5、色谱分析测定
[0062]
试验仪器：高效液相色谱仪
[0063]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5 μm)
[0064]
检测器：210nm
[0065]
流速：1.5ml/min
[0066]
柱温：25℃
[0067]
进样体积：20μl
[0068]
流动相a：乙腈
[0069]
流动相b：0.025mol/l的磷酸二氢钾溶液(用磷酸或氢氧化钠溶液调节ph值到6.0)
[0070][0071]
溶剂：乙腈-0.025mol/l的磷酸二氢铵溶液(用氨水调节ph值到6.0)(70：30)
[0072]
实验步骤
[0073]
分别取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行测定，结果见附图1-3。
[0074]
在供试品溶液中分别加入适量各杂质对照品贮备液，配制成含0.015％杂质的加标供试品溶液，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行测定，结果见附图4。
[0075]
方法学验证：
[0076]
专属性：分别测定空白溶液和对照品溶液、供试品溶液，考察空白溶液的干扰情况及各杂质间的分离情况，要求空白溶剂对基因毒性杂质的检查无干扰，各杂质间的分离度大于1.5，结果见表1。
[0077]
表1专属性试验结果
[0078]
名称对氯苯胺对氟苯胺对羟基苯甲醛对氟硝基苯保留时间(min)4.41311.85713.74120.043分离度
‑‑
10.13.26.7理论塔板数840350080005000
[0079]
由上表可见，空白溶液不干扰各个基因毒性杂质的检测，各个杂质间的分离度均大于1.5，供试品溶液中其他未知杂质峰不干扰基因毒性杂质的检测。
[0080]
检测限和定量限：采用信噪比法来确定检测限和定量限，以信噪比(s/n)不小于 3时的相应浓度确定检测限；信噪比(s/n)不小于10时的相应浓度确定定量限，在该浓度水平，重复考察6个测试溶液，要求6次所得的色谱峰中各基因毒性杂质的峰面积的相对标准偏差不得大于15％，来证实定量限测定结果具有一定的精密度。结果如下表：
[0081]
表2基因毒性杂质的定量限结果
[0082][0083][0084]
表3基因毒性杂质的检测限结果
[0085][0086]
由上表可知，对氯苯胺、对氟苯胺、对羟基苯甲醛和对氟硝基苯的定量限和检测限均低于限度(0.015％)要求。
[0087]
重复性：由一名分析人员，取同一批依折麦布样品，配制6份溶液，在供试品溶液中分别加入约各杂质对照品贮备液，配制成含0.015％杂质的加标供试品溶液，测定方法的重复性，要求测定测定结果的相对标准偏差不得大于15％，结果如下表：
[0088]
表4基因毒性杂质重复性实验结果
[0089]
序号对氯苯胺％对氟苯胺％对羟基苯甲醛％对氟硝基苯％10.0150.0150.0150.01520.0150.0140.0150.01330.0150.0150.0130.01540.0150.0140.0150.01550.0150.0140.0150.01560.0150.0140.0140.015平均值0.0150.0140.0150.015rsd％0.003.605.775.57
[0090]
由上表可见，在相同的条件下，配制6份加标供试品溶液，各个基因毒性杂质测定结果相对标准偏差均小于10％，本测定方法具有良好的重复性。
[0091]
中间精密度：有两名分析人员，在不同的时间分别配制6份加标供试品溶液，测定，
计算方法的中间精密度，要求测定结果的相对标准偏差不得大于15％，结果如下表：
[0092]
表5基因毒性杂质中间精密度实验结果
[0093][0094][0095]
由上表可见，两名分析人员，配制12份加标供试品溶液，各个基因毒性杂质测定结果相对标准偏差均小于10％，本测定方法具有良好的中间精密度。
[0096]
准确度：在限度浓度的50％～150％范围内，配制9份供试品溶液，测定回收率，要求回收率应在75％～125％之间；rsd应小于10％，检测结果见下表：
[0097]
表6准确度试验结果
[0098][0099]
由上表可见：对氯苯胺、对氟苯胺、对羟基苯甲醛、对氟硝基苯四个基因毒性杂质测定回收率均在80％～115％范围内，本法的准确度高。
[0100]
耐用性：适当改变色谱条件如流动相的ph值(
±
0.2)、流动相初始比例(
±
2％)、流
速(
±
0.1ml/min)及更换不同品牌的色谱柱，测定系统适用性溶液及供试品溶液，评估侧条件参数有微小的变动时，测定结果不受影响的程度，色谱条件参数见表7。
[0101]
表7色谱条件参数
[0102][0103]
色谱柱1：agelainnoval ods-2c18(250mm
×
4.6mm，5μm)
[0104]
色谱柱2：waterssymmetryc18柱(250mm
×
4.6mm，5μm)
[0105]
表8耐用性实验结果(分离度)
[0106][0107]
表9耐用性实验结果(理论塔板数)
[0108][0109]
结论：由上表可见，色谱条件微小变化，以及更换不同厂家同类型的色谱柱，各个杂质间的分离度均大于1.5，理论塔板数也没有明显变化，表明本法的耐用性好。