基于表面等离子共振成像检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法及其应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及基于表面等离子共振成像检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法及其应用。


背景技术：

2.近年来，大量研究表明，肿瘤细胞(比如非小细胞肺癌，nsclc)会向外周血分泌外泌体(lobb et al.，2017；wang et al.，2018)，它们携带肿瘤特异性分子。因此，在外周血中探测特定的肿瘤(比如非小细胞肺癌)来源的外泌体成为这些恶性癌症早期筛查与临床诊断的新方向。
3.传统的用于分析肿瘤来源外泌体的方法，如western blot、elisa和质谱分析，由于过程漫长和繁琐，限制了其临床应用。到目前为止，已经有一些用于测定肿瘤来源的外泌体的新方案(ferhan等人，2018；shao等人，2018)。例如，以前的研究报道了表面增强拉曼散射(sers)免疫分析，以高灵敏度特异性检测胰腺和乳腺肿瘤来源的外泌体(li等人，2018；kwizera等人，2018年)。这些基于sers的免疫分析由拉曼散射信号进行报告。此外，jiang等人采用适配体/金纳米的新型传感器，基于比色法通过表面蛋白分析四种肿瘤来源的外泌体(jiang等人，2017)。但是，上述方法存在灵敏度较差的问题。
4.近年来，非小细胞肺癌(nsclc)相关外泌体的高灵敏、高特异检测新策略、新方法在不断研究中。有研究报道已开发出微流控芯片法而分离和分析nsclc细胞中的外泌体，通过该方法能够评估外泌体的表型和磷酸化水平(he et al.，2014)。此外，yu等人基于cd63特异性适配体设计了荧光团标记的磁珠，以确定来自nsclc细胞的外泌体浓度(yu等人，2019)。上述两种方法能够检测到低至1.0-105粒子/μl的外泌体。然而，上述两种方法分析nsclc来源的外泌体的过程较为复杂，需要荧光标记。
5.因此，发展出一种高灵敏度、免标记和高通量筛选nsclc来源的外泌体的新型检测方法是非常重要的。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有技术的不足，本发明的目的在于提供基于表面等离子共振成像检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法及其应用，通过spri生物传感平台确定nsclc来源的外泌体的群体和亚型，在临床应用中具有高灵敏度、免标记和多组分检测的优势。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于表面等离子共振成像(spri)检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法，包括如下步骤：
8.将外泌体表面蛋白的特异性抗体与金纳米进行连接与修饰，制备得到抗体修饰的功能化金纳米(aunps)；
9.将非小细胞肺癌细胞外泌体注入双通道流动池中，与修饰非小细胞肺癌相关蛋白特异性抗体的spri芯片靶向识别与结合；随后加入抗体修饰的功能化金纳米，再特异性结
合spri芯片上吸附的外泌体，在芯片表面形成特异性抗体/外泌体/金纳米的“三明治”结构，通过spri检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的表达差异性。
10.进一步，所述外泌体表面蛋白为cd63和/或cd81。
11.进一步，所述外泌体表面蛋白的特异性抗体选自anti-cd63、anti-epcam和anti-egfr中的任意一种，优选为anti-cd63。
12.进一步，所述非小细胞肺癌细胞选自a549、h460和h1299中的任意一种。
13.进一步，所述非小细胞肺癌细胞相关蛋白为egfr和/或epcam。进一步，所述外泌体来源于肿瘤细胞或者肿瘤患者血液/血浆。
14.进一步，制备抗体修饰的功能化金纳米aunps时，抗体与金纳米的反应温度为25℃，反应时间为20min，反应ph为8.5。
15.进一步，所述功能化金纳米进行了封闭处理，封闭处理条件为：在5％bsa溶液中，25℃封闭20min。
16.进一步，将每种特异性抗体均匀分布在spri芯片的四个金点上，制得修饰特异性抗体的spri芯片。
17.进一步，修饰过特异性抗体的spri芯片在80％湿度环境下4℃孵育过夜，使特异性抗体与芯片表面金膜充分结合，然后分别用0.1
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pbs和超纯水漂洗去除未结合的抗体；随后用1％(w/v)bsa溶液封闭2小时，再用0.1
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pbs和超纯水漂洗干净；封闭之后，用氮气干燥修饰好的spri芯片。
18.进一步，所述芯片表面抗体浓度为20～100g/ml，优选为40～60g/ml，更优选为50g/ml。
19.进一步，功能化金纳米中抗体与金纳米的摩尔配比为1：(2～6)，优选为1：(2～3)，更优选为1:3。
20.进一步，外泌体和功能化金纳米的注入流速为5～15μl/min，优选为8～10μl/min，更优选为8μl/min。
21.本发明第二方面提供根据第一方面所述的方法在检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白上的应用。
22.本发明第三方面提供根据一种用于检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的spri生物传感器，采用第一方面所述的方法构建得到。
23.如上所述，本发明的基于表面等离子共振成像检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法及其应用，具有以下有益效果：
24.本发明通过特异性抗体修饰spri芯片与附加的功能化金纳米，构建了一种多组分、高灵敏、高通量检测肿瘤外泌体表面蛋白的spri传感新方法，具有免标记、实时检测的优势；本发明方法已成功应用于肿瘤患者临床血浆样品中提取的外泌体表面蛋白的识别与检测，在检验医学领域中具有良好的潜在价值。
附图说明
25.图1显示为本发明实施例中基于功能化金纳米的增强型spri平台对肿瘤外泌体表面蛋白的多组分检测原理示意图。
26.图2显示为外泌体的表征。(a)a549分泌的外泌体的透射电镜图；(b)外泌体进行纳
米粒子跟踪分析的粒径分布统计图和(c)典型外泌体蛋白的wb成像结果，细胞裂解物为阳性对照。
27.图3显示为功能化金纳米的表征。(a)金纳米的透射电镜图(粒径约15nm)；(b)金纳米与功能化金纳米的紫外吸收光谱图。
28.图4显示为实验参数的优化。(a)金膜表面修饰的抗-cd63浓度的优化；(b)spr信号响应与流速间相关性的优化；(c)功能化金纳米的稀释比率的优化。
29.图5显示为本发明实施例中检测肿瘤外泌体不同表面蛋白的特异性抗体修饰区标识与双通道检测的ccd成像。
30.图6显示为本发明实施例中基于spri传感新方法与免疫印迹法对多种外泌体表面蛋白的同时检测的比较。(a)通过多种特异性抗体(抗-cd63，抗-epcam与抗-egfr)修饰的spri芯片对比分析a549细胞与beas-2b细胞分泌的外泌体；不同的三维效果柱状图反映出各组的spri信号值(右上角为对应颜色的阈值)；(b)同样的两种外泌体上cd63,epcam与egfr蛋白的wb检测。
31.图7显示为(a)三种nsclc细胞(a549,h1299与h460)外泌体通过不同表面蛋白(cd63、epcam与egfr)多组分检测的spri传感图；(b)不同nsclc细胞外泌体上多重表面蛋白的spri响应信号的三维柱状统计图(右上角为对应颜色的阈值)。
32.图8显示为(a)检测外泌体浓度为0,3.125,6.25,12.5,25,50,100
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107微粒/ml时(特征曲线从1到7)对应的spr传感图；(b)不同外泌体浓度与相应spr信号间拟合的标准曲线。
33.图9显示为基于spri的新方法分析nsclc初诊患者、正在治疗nsclc患者及健康人的血浆标本中外泌体水平的统计图。p1～p4(黄色柱形图)、t1～t4(蓝色柱形图)与h1～h4(红色柱形图)分别为nsclc组、治疗组、正常组的血浆中外泌体检测的响应信号；所有数据都是检测三次的平均值，显著性判定采用非配对t检验，*p《0.5；**p《0.05。
具体实施方式
34.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
35.表面等离子共振成像(spri)，具有免标记、实时监测和高通量分析等优势，极好的解决了常规新型生物传感器在肿瘤外泌体表面蛋白多组分检测中的缺点。因此，基于表面等离子共振成像平台研发一种分析非小细胞肺癌外泌体多种表面蛋白的多组分检测的方法将具有极好的应用前景。但其在检测痕量靶标分子方面spri往往存在灵敏度不足的问题。因此，本发明方法还在spri检测芯片上修饰与特异性抗体的功能化金纳米，从而有效的增加本传感方法的灵敏度。
36.本发明的技术路线与原理如下：
37.本发明通过特异性抗体修饰spri芯片与附加的功能化金纳米aunps，构建了一种多组分、高灵敏检测肿瘤外泌体表面蛋白的spri传感新方法。检测原理图如图1所示。多种肿瘤细胞(不同非小细胞肺癌细胞)外泌体的分离与纯化由超速离心法获得，然后经双通道
流通池进入，与修饰在spri芯片上的特异性抗体相结合，进行筛选与相互反应；随后再向流通池中注射被cd63抗体修饰的功能化金纳米，引起结合在spri芯片上的肿瘤外泌体再结合aunps，形成spri信号的二次放大。由于不同抗体修饰spri芯片具有独立的10
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12个金点——理论上可结合120种潜在的外泌体表面蛋白，从而实现肿瘤外泌体外泌体表面蛋白的高通量检测。
38.本发明实施例所构建的多组分、高灵敏spri传感新方法主要使用了几种经典的肿瘤外泌体表面蛋白(cd63,epcam和egfr)，被研究用于不同非小细胞肺癌的细胞(a549，h1299和h460细胞株)的区分与检测，实现了免标记、实时检测。更为重要的是，本发明方法被成功应用于肿瘤患者临床血浆样品中提取的外泌体表面蛋白的识别与检测，表明其在检验医学领域中具有良好的潜在价值。
39.本发明的具体实施过程如下：
40.实施例1
41.1、材料与方法
42.1.1实验试剂
43.磷酸盐缓冲液(pbs)和牛血清白蛋白(bsa)，本实施例的spri芯片上修饰的抗体中的抗-cd63、抗-cd9为单克隆抗体，抗-egfr、抗-epcam与抗-cd81。这些抗体全部溶解于0.1％(w/v)的bsa溶液之中。
44.1.2细胞培养
45.本实施例实验所培养使用的三种非小细胞肺癌细胞株a549，h460与h1299，以及对照组的正产肺细胞株beas-2b均购自于美国典藏物保藏中心(american type culture collection，atcc)。培养这些细胞均使用含有10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素(双抗)的dmem培养基中，在含5％co2的细胞培养箱中37℃培养；所用细胞的培养过程中，平均每隔2～3天在无菌条件下进行传代培养1次。为了减少培养液内胎牛血清里细胞因子的干扰，当细胞贴壁培养至大约1.4*108/ml左右时，利用pbs洗涤两次，并在无血清培养基(100ml dmem，不含fbs)中培养48小时，然后再分离纯化这些细胞分泌的外泌体。
46.1.3外泌体的分离纯化与表征
47.从培养细胞后的细胞培养液中分离外泌体，首先使用高速离心(10,000
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g,30min,4℃)将细胞培养上清中残留的完整细胞、细胞碎片和较大的微泡去除；然后将这些上清收集后，使用超速离心(100,000
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g,70min,4℃)来沉积包含有外泌体的较小细胞囊泡；这些外泌体沉淀物又被大量的pbs溶液漂洗2次(100,000
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g,70min,4℃)——用离心除去蛋白质杂质。这些纳米囊泡(主要是外泌体)用100μlpbs溶液重选后储存在-80℃以备使用。分离获得的外泌体使用纳米粒子跟踪分析(nta)技术进行浓度测定与粒径分布监测。
48.分泌于培养细胞的上清中而分离获得的外泌体，首先需要经过粒径大小与纯度的表征。由细胞培养上清中经过超速离心法获得微小囊泡(以a549细胞株分泌的外泌体为例)在tem下显示为直径大小为100nm左右的、典型的囊泡膜状结构(图2(a))；nta的结果也同样揭示出：这些分离获得的外泌体粒径大小分布在50～150nm之间(图2(b))。为了进一步核实分离获得的这些囊泡确实为细胞分泌的外泌体，又进行了免疫印迹(wb)实验。结果如图2(c)显示，相比于普通细胞囊泡或细胞碎片中，外泌体特异性蛋白cd9、cd63与cd81在分离纯化的微小囊泡(即外泌体)的总蛋白中均表现出更高的丰度——这也进一步证实了超速离
心法可以良好地制备较高纯度的外泌体，并且多种nsclc细胞(a549、h460、h1299细胞株等)分泌的外泌体表面总是包含了四跨膜蛋白家族成员(cd9、cd63与cd81)。
49.为了从肿瘤(nsclc)患者血浆中提取外泌体：用pbs稀释1.5ml血浆，首先高速离心(12,000g,45min,4℃)，收集上清于超速离心管中；然后进行超速离心(110,000g,2h,4℃)；弃超速离心上清后，将剩余的外泌体重悬于8ml的pbs溶液中，用0.22μm过滤器过滤以去除纳米级杂质；滤液经超速离心(110000g，70min，4℃)2次以去除蛋白杂质。最终使用100μlpbs溶液重悬沉淀中的外泌体，在-80c保存，以待进一步检测。
50.在本实施例构建的基于spri的新方法的检测中，每次需要2.5μl外泌体，按1:50比例由pbs溶液稀释后注入spri分析仪。
51.1.4功能化金纳米的制备
52.金纳米颗粒(aunps)合成主要是参照了costa团队曾报道的经典方法(maltez-da costa等人，2012)，但是做了适当的修改：总计50ml的浓度为0.01％的haucl4.4h2o在剧烈搅拌下被不断加热；当温度达到98℃时，滴加1％柠檬酸三钠1.2m——此时该混合物变成深红色，并在搅拌下冷却，形成预期的金纳米颗粒(aunps)。
53.而特异性抗体修饰的功能化aunps的制备具体方法则如下：1)抗体修饰的功能化金纳米的制备：将外泌体表面蛋白cd63的特异性抗体(抗-cd63)与合成后的金纳米颗粒(aunps)进行连接与修饰；2)1ml前期制备好的金纳米溶液与100μl的浓度为100μg/ml的抗-cd63溶液在25℃下搅拌混匀20min(ph 8.5溶液环境下)；抗体修饰的金纳米被5％bsa溶液在25℃封闭20min，随后离心2次；最后，抗-cd63与金纳米共价连接产物被pbs溶液重悬，并短期储存于4℃备用；3)合成的金纳米颗粒与制备好的功能化金纳米都需要进一步被透射电镜(tem)与紫外-可见光分光光度计进行表征。
54.制备好的金纳米(aunps)与功能化金纳米tem与紫外表征结果如图3(a)所示，tem图像证实了本实施例合成aunps为均匀分布的、粒径尺寸大约为15nm的球形金属颗粒；紫外吸收光谱结果显示，aunps在520nm处都有金的特异吸收峰；而功能化金纳米在生物功能化后其特异吸收峰移至540nm，并且由于修饰有抗-cd63，其在280nm处出现了典型的蛋白吸收峰(见图3(b)中的曲线2)
55.1.5修饰特异性抗体的spri芯片的制备
56.spri芯片预处理参照了zhu所在科研团队曾报道的经典方法(zhu等人，2014)，但是做了适当的修改：首先用新鲜食人鱼溶液(70％h2so4,30％h2o2)清洗spri芯片金膜表面10min，去除吸附的有机杂质；随后用超纯水冲洗干净并彻底处理，氮气干燥。抗-cd63,抗-cd81,抗-egfr与抗-epcam等抗体(包括阴性对照实验的抗兔igg)被用pbs溶液稀释到终浓度50μg/ml，并且每种抗体被均匀分布在芯片的四个金点上。修饰过的spri芯片在80％湿度环境下4℃孵育过夜——使特异性抗体与芯片表面金膜充分结合，然后分别用0.1
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pbs和超纯水漂洗三次(去除未结合的抗体)；随后，该传感芯片被1％(w/v)bsa溶液封闭2小时，再用0.1
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pbs和超纯水漂洗三次；封闭之后，用氮气干燥修饰好的spri芯片。
57.1.6spri检测
58.将构建的基于功能化金纳米增强的spri平台用于多组分检测肿瘤外泌体表达蛋白的研究，主体实验进行的就是表面等离子共振成像(spri)检测。对于每一次测试，pbs溶液在最初都以10μl/min的恒定速率被注入在双通道流动池中(25℃下恒温恒湿环境)以实
现spr的传感图达到稳定状态(基线稳定)。随后，不同非小细胞肺癌细胞分泌的外泌体被限定浓度后，以8μl/min的流速注入双通道流动池中，与修饰特异性抗体的spri芯片特异识别与结合；紧接着功能化金纳米溶液也被以8μl/min的流速注入双通道流动池，靶向结合spri芯片上吸附的外泌体，从而在芯片表面形成众多的特异性抗体/外泌体/金纳米的“三明治”结构。ccd相机被用于检测镜面角度改变的反射光并将信号转化为图像。每一轮检测之后，spri芯片表面的再生：只需要50mm naoh溶液以20μl/min流速流经2min即可。分析结果时，选择芯片表面被特异性抗体修饰的位点区进行spri信号与图形分析，并绘制了所选区域的平均反射率随时间的变化曲线——数据分析模块实时记录信号变化(以ru为单位)作为检测值。在所有spri检测实验中，每一次都需进行三次重复试验，并计算平均值为检测结果。
59.2、实验参数条件优化
60.为了提高本研究所构建的基于spri检测外泌体新方法的分析性能，本实施例系统地摸索了影响实验结果最主要的三种实验参数条件，包括芯片表面修饰抗体(抗-cd63)的浓度，反应的流速和aunps的稀释比率。
61.结果显示，当芯片表面抗体浓度为50g/ml之后，观察到spr信号达到平台期(图4(a))，这提示抗体浓度只要达到50g/ml即可达到峰值(过多抗体并不会引起更高的spr信号)。而当流速为8μl/min时，spri信号增加到最高值，之后随流速增加反应信号反而逐渐降低(图4(b))——该流速可能是表面芯片表面抗体与外泌体特异识别/结合与样本流动相之间达到平衡时的最佳速率。此外，随着功能化aunps浓度的增加，反应信号强烈增强：最佳spr信号出现在aunps的稀释比率为1:3时(图4(c))，因此选择“1:3”的稀释比作为功能化aunps的最佳生物传感配比。
62.3、高通量
63.3.1多种外泌体表面蛋白的同时检测
64.在明确所构建的基于spri平台检测外泌体的分析性能后，本发明的研究重点在于探讨多种外泌体表面蛋白的同时检测。本实施例主要利用肿瘤(本发明以非小细胞肺癌为例)外泌体不同表面蛋白的特异性抗体修饰在同一块spri芯片上(多组分抗体修饰见图5)，以实现多重外泌体蛋白的表达差异性的分析。
65.将不同的特异性抗体(anti-cd63、anti-epcam和anti-egfr)修饰在spri芯片上，用于特异识别与结合肿瘤外泌体表面蛋白，以期从分子水平筛选与鉴别源于a549细胞(典型的nsclc细胞)和beas-2b细胞(正常肺细胞)的外泌体。结果显示，这两种细胞分泌的外泌体，其表面蛋白cd63,epcam与egfr的spri检测信号出现了明显的差异性(见图6(a))。肺癌细胞株a549分泌的外泌体经过spri分析仪后，检测的三种表面蛋白的表达量均高于正常肺细胞beas-2b分泌的外泌体的——表明在外泌体上样浓度基本一致的情况下(均为130μl的4
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108微粒/ml的外泌体)，肿瘤细胞外泌体特异蛋白表达量相对更高；同时，也显示出本发明所构建基于spri双通道流通池的检测新方法可以同时分析两种不同类型的外泌体。具体而言，对于a549细胞的外泌体，cd63蛋白的spri信号维持在较低水平(26.0ru)，而epcam蛋白的响应量也较低(25.4ru)，反映出这两种表面蛋白在a549细胞的外泌体上的表达量较低；但是，a549细胞外泌体的egfr蛋白引发的spri检测信号却远远高于前两个蛋白的响应(43.2ru)——可能由于这种胞内蛋白在外泌体膜上的过表达促进了非小细胞肺癌母细胞的异常生长和分裂。而对于beas-2b细胞的外泌体，cd63蛋白的spri信号依然很低
(23.2ru)，甚至低于a549细胞外泌体的cd63响应量；但是，值得注意的是，其epcam和egfr的spri水平在所有这些表面蛋白中却是最低的(低于17.5ru)——这同样提示出这两种肿瘤相关蛋白在正常肺细胞中表达量极少。
66.为了进一步核实本发明提供的新方法(基于spri检测外泌体蛋白表达水平)的有效性，这两类细胞外泌体的三种不同表面蛋白又同时进行了wb验证。结果如图6(b)所示，a549细胞外泌体中egfr的表达量明显高于其他蛋白表达水平，而cd63与epcam的表达相对偏低(尽管也明显高于beas-2b细胞外泌体的这两种蛋白)。同时，本发明构建的spri-based方法和western blot方法均表明a549细胞的外泌体表面蛋白的表达要高于beas-2b细胞外泌体的——提示出肿瘤细胞的侵染周围细胞的生物学活性与大量异常蛋白的分泌有关。通过比较上述两种方法，还可以发现：新构建的spri-based方法和western blot法得到的蛋白表达差异水平是高度相关的(部分蛋白高度一致)；而且新方法在检测外泌体蛋白方面比wb实验更方便、更省时。
67.3.2不同非小细胞肺癌外泌体的表面蛋白多组分检测
68.在成功利用新方法检测肿瘤细胞与正常细胞分泌外泌体的多种表面蛋白的基础上，进一步探究该方法能否有效鉴别不同非小细胞肺癌母细胞的外泌体表面蛋白，以期实现这些biomarkers的多组分同时检测。
69.本研究仍以外泌体上的cd63,egfr与epcam为靶标分子，检测源于三种不同的nsclc细胞株(h460,h1299与a549)分泌的外泌体。不出所料，这三种肿瘤外泌体表面蛋白在三种不同的nsclc外泌体上表现出了极大地差异性，结果如图7(a)/(b)所示。当h460细胞株分泌的外泌体被注入spri流通池后，三种靶标蛋白结合各自抗体显示出不同的spr响应：egfr的spri信号最高，cd63的响应较低，反而是epcam的反应信号最低(只有23.2ru)。而当a549细胞的外泌体被注入时，egfr表达量显著增加，信号更是增至40.0ru以上；而其余的cd63与epcam蛋白的反应信号虽然也比h460外泌体上的同在蛋白有所提高，但总体维持在较低水平(24～25ru)。有趣的是，当h1299的外泌体与spri芯片上特异抗体发生反应后，不仅egfr的响应信号而且还有epcam的spri信号也大幅增加至50.0ru以上；尽管其cd63水平还保持在25ru左右——这一现象应归因于h1299细胞过表达egfr和epcam调节微环境中细胞间的相互作用。这些实验结果还表明，egfr蛋白在这些待测的非小细胞肺癌外泌体中都大量表达，其可能与非小细胞肺癌的肿瘤生长、侵袭和转移有关。而cd63作为各种外泌体中最典型的生物标志物之一，在所有选择的nsclc细胞外泌体中始终保持恒定水平的事实，又进一步说明cd63应作为定量外泌体的理想生物标志物，而非鉴定不同肿瘤细胞的特征性跨膜蛋白。这些发现突出了本发明所开发的基于spri的生物传感方法在多组分检测不同肿瘤细胞来源外泌体的表面蛋白的实际能力——其可能为肿瘤外泌体及其生物标志物的诊断、监测和治疗方面提供有力的帮助。
70.4、线性检测范围宽以及极低的检测限
71.本发明构建的新方法通过cd63蛋白检测肿瘤细胞外泌体的分析性能被逐一评价。
72.首先，不同浓度的外泌体被逐渐加入反应流通池中，以期明确新方法检测外泌体的现象范围。结果如图8(a)所示，当外泌体浓度在3.125
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107～100
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107微粒/ml的范围内，spr信号逐渐增加；通过线性回归分析与计算(见图8(b))，表明这些逐渐增加的spri信号与外泌体浓度之间呈现良好的线性关系：这些外泌体浓度范围内的线性拟合方程为y＝
0.5429x-2.482，相关系数r2＝0.9923；因此，本发明开发基于spri检测外泌体新方法的线性范围是3.125
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107～100
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107微粒/ml。此外，通过计算得到本发明新方法检测肿瘤外泌体的最低检测限(lod)为1.105
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107微粒/ml。
73.5、临床实际样本检测
74.分别从健康志愿者(正常人对照组)、初步确诊为nsclc患者(nsclc组)与得到治疗后缓解的nsclc患者(治疗组)的血浆中提取外泌体，用于测试了本发明新方法的实用性。
75.通过检测相对恒定的cd63响应信号的差异性来分析不同组血浆外泌体含量的变化，srpi结果进行对比分析，统计图如图9所示：nsclc患者组血浆中外泌体水平最高(尽管个体差异性较大，但是外泌体平均含量最高)；治疗组血浆中外泌体含量大幅下降，平均水平与患者组的外泌体含量之间存在极显著差异(p《0.01)；而健康组血浆中外泌体水平在这三个组中最低，即使与患者组的外泌体含量之间也存在显著性差异(p《0.05)。值得注意的是，非小细胞肺癌组的所有样本的外泌体浓度都明显高于正常组——这很可能是由于肿瘤组织比正常组织会分泌更多的外泌体以便参与其恶性肿瘤的侵染活性。而对于治疗组，其外泌体含量介于nsclc组与正常组之间，反映出经过治疗后，肿瘤的侵染等特征的有所消退。
76.因此，本发明所构建的外泌体检测新方法不仅在区分癌症患者样本与正常样本的外泌体的差异性上具有潜力，而且通过测量血浆外泌体的丰度来评估治疗效果，提示出其具有临床筛选外泌体的能力。
77.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。