一种β-氯代苯丙酮中3-氯丙酰氯的痕量检测方法与流程

一种
β-氯代苯丙酮中3-氯丙酰氯的痕量检测方法
1、技术领域
1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种β-氯代苯丙酮中遗传毒性杂质3-氯丙酰氯的痕量检测方法。
2、

背景技术：

2.盐酸达泊西汀(dapoxetine hydrochloride)是一种新型快速的选择性5-羟色胺再吸收抑制剂(ssri)，半衰期短，用于治疗男性早泄和勃起功能障碍，有效率高。达泊西汀片于2009年2月首先在芬兰及瑞典两国获得上市许可，随后在全球几十个国家获得批准。盐酸达泊西汀化学名为(+)-(s)-n,n-二甲基-(α)-[2-(1-萘氧基)乙基]苯甲胺盐酸盐，结构式如下：
[0003][0004]
β-氯代苯丙酮，cas号为936-59-4，是合成盐酸达泊西汀的重要中间体，结构式如下：
[0005][0006]
3-氯丙酰氯，又称作β-氯丙酰氯，cas号为625-36-5，是合成达泊西汀中间体β-氯代苯丙酮的物料，结构式如下：
[0007][0008]
3-氯丙酰氯为卤代烷类结构。欧盟化学品管理署(echa)文件显示在细菌回复突变试验(ames)中，无论有无代谢激活，3-氯丙酰氯均被证明具有诱变作用，因此3-氯丙酰氯可能有致突变性，属于遗传毒性杂质。
[0009]
遗传毒性杂质的特点是在很低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤发生。因其毒性较强，对用药的安全性产生了强烈的威胁，近年来也越来越多的出现因为在已上市药品中存在痕量的遗传毒性杂质残留导致大范围的医疗事故而被fda强行召回的案例，给人们的用药安全带来较大的风险。
[0010]
根据国际人用药注册技术要求协调会ich协调指导原则《评估和控制药物中dna反应性(致突变)杂质以限制潜在致癌风险》(ich m7)的相关要求，3-氯丙酰氯属于第三类遗传毒性杂质，其被允许的可接受摄入量仅为1.5μg/天。盐酸达泊西汀最大用药量为68mg(以盐酸达泊西汀计)，故3-氯丙酰氯的控制限度需达到1.5μg/天
÷
68mg/天＝22ppm，即百万分之二十二。
[0011]
由于3-氯丙酰氯活性较高，遇水会发生反应，不能直接测定。目前尚未检索到痕量3-氯丙酰氯的检测方法。仅检索到《一种3-氯丙酰氯的气相色谱分析方法》的发明专利(cn202011427130.5)，该专利主要是将3-氯丙酰氯作为供试品，加甲醇稀释摇匀进行甲酯化后，使用面积归一化法，测定其本身纯度。该方法仅能粗略考察3-氯丙酰氯本身的质量情况，未考虑到3-氯丙酰氯作为遗传毒性杂质在其他化合物中痕量水平的定量检测情况，无法确定加甲醇后仅摇匀是否能使其甲酯化完全，且无法确定其他化合物中的杂质对3-氯丙酰氯的检测是否存在干扰。
[0012]
因此，需建立一种适用于盐酸达泊西汀工艺的有效的、灵敏的、且准确的痕量3-氯丙酰氯的测定方法，以实现盐酸达泊西汀终产品中遗传毒性杂质3-氯丙酰氯的有效控制。
3、

技术实现要素：

[0013]
本发明解决了现有技术中存在的不足，提供了一种β-氯代苯丙酮中遗传毒性杂质3-氯丙酰氯的痕量检测方法，控制3-氯代苯丙酮中3-氯丙酰氯残留量不得过百万分之二十二(22ppm)，可用于β-氯代苯丙酮的质量控制，满足工艺需要，从而确保了终产品盐酸达泊西汀的质量安全。
[0014]
本发明提供了一种β-氯代苯丙酮中3-氯丙酰氯的痕量检测方法，包括以下步骤：
[0015]
(1)供试品溶液的配制：取β-氯代苯丙酮适量，加甲醇使溶解并稀释制成溶液；
[0016]
(2)对照品溶液的配制：取3-氯丙酰氯适量，加甲醇溶解并稀释制成溶液；
[0017]
(3)衍生化：取对照品溶液和供试品溶液，密封，置35～55℃加热10～40分钟，放冷至室温，摇匀；
[0018]
(4)色谱实验：取衍生后的对照品溶液和供试品溶液各适量，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
[0019]
步骤(3)中，衍生化条件优选45℃加热20分钟；
[0020]
步骤(4)中，所述气相色谱条件为：
[0021]
检测器：fid检测器；
[0022]
色谱柱：6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷(或极性相近)为固定液的毛细管柱；db-624，30m
×
0.32mm，1.8μm；
[0023]
柱温：起始温度70～90℃，维持5分钟，以每分钟20～40℃的速率升温至220℃，维持12分钟；优选的，起始温度为80℃，维持5分钟，以每分钟30℃的速率升温至220℃，维持12分钟；
[0024]
流速：1ml/min；
[0025]
进样量：对照品进样量≥1.6ng，供试品进样量≥80μg；
[0026]
进样口温度：200℃；
[0027]
检测器温度：250℃。
[0028]
本发明提供了一种β-氯代苯丙酮中3-氯丙酰氯的痕量检测方法，包括以下步骤：
[0029]
(1)供试品溶液的配制：取β-氯代苯丙酮约1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成溶液，摇匀；
[0030]
(2)对照品溶液的配制：取3-氯丙酰氯适量，精密称定，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含2.2μg的溶液；
[0031]
(3)衍生化：取对照品溶液和供试品溶液，密封，置35～55℃加热10～40分钟，放冷至室温，摇匀；
[0032]
(4)色谱实验：取衍生后的对照品溶液和供试品溶液各适量，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
[0033]
步骤(3)中，衍生化条件优选45℃加热20分钟；
[0034]
步骤(4)中，所述气相色谱条件为：
[0035]
检测器：fid检测器；
[0036]
色谱柱：6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷(或极性相近)为固定液的毛细管柱；db-624，30m
×
0.32mm，1.8μm；
[0037]
柱温：起始温度70～90℃，维持5分钟，以每分钟20～40℃的速率升温至220℃，维持12分钟；优选的，起始温度为80℃，维持5分钟，以每分钟30℃的速率升温至220℃，维持12分钟；
[0038]
流速：1ml/min；
[0039]
进样量：2μl；
[0040]
进样口温度：200℃；
[0041]
检测器温度：250℃。
[0042]
本发明的有益技术效果为：
[0043]
(1)以甲醇为衍生溶剂，通过控制衍生温度和时间，实现低浓度下3-氯丙酰氯的完全甲酯化，将其完全转化为3-氯丙酸甲酯进行检测，同时也避免了产物的降解；
[0044]
(2)使用气相色谱仪进行溶液检测，操作简便；提供了一种专属性好的色谱条件，有效地避免了β-氯代苯丙酮中其他杂质对3-氯代苯丙酮衍生物3-氯丙酸甲酯峰的干扰。通过优化色谱条件，实现目标峰与其他杂峰的分离，避免干扰，专属性、灵敏度好；
[0045]
(3)采用外标法进行β-氯代苯丙酮中3-氯丙酰氯的定量测定，线性、检测灵敏度、精密度、准确度及耐用性等均良好，实现了痕量浓度的3-氯丙酰氯的检测，定量限可达百万分之四，可以较好地满足盐酸达泊西汀中间体β-氯代苯丙酮对遗传毒性杂质3-氯丙酰氯的控制需求。
4、附图说明
[0046]
图1为实施例2中的定位溶液色谱图。
[0047]
图2为实施例2中的对照品溶液色谱图。
[0048]
图3为实施例2中的甲醇色谱图。
[0049]
图4为实施例2中的干扰溶液色谱图。
[0050]
图5为实施例2中的供试品溶液色谱图。
[0051]
图6为实施例2中的分离度溶液色谱图。
[0052]
图7为实施例2中的加标溶液色谱图。
[0053]
图8为实施例3中的对照品溶液色谱图。
[0054]
图9为实施例4中的定量限色谱图。
[0055]
图10为实施例4中的检测限色谱图。
[0056]
图11为实施例5中3-氯丙酰氯的线性图。
5、具体实施方式
[0057]
下面详细描述本发明的具体实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0058]
仪器及色谱条件
[0059]
仪器：agilent 7890b气相色谱仪，fid检测器；
[0060]
色谱柱：以6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷(或极性相近)为固定液的毛细管柱为色谱柱，db-624(30m
×
0.32mm
×
1.8μm)；
[0061]
流速：1.0ml/ml；
[0062]
进样口温度：200℃；检测器温度：250℃；
[0063]
进样体积：2μl。
[0064]
溶液的配制
[0065]
供试品溶液的配制：取β-氯代苯丙酮约1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0066]
对照品贮备液的制备：取3-氯丙酰氯适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含22μg的溶液。
[0067]
对照品溶液的配制：精密量取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0068]
实施例1衍生温度与时间试验
[0069]
仪器及色谱条件同上。
[0070]
将7份对照品溶液，密封，于五个不同的条件进行衍生反应，放至室温后，分别精密量取上述溶液2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图，分析比较衍生物峰的峰面积，结果如表1所示，室温条件下放置，难以使目标物衍生完全；于40℃加热10分钟，反应基本达到平衡；温度升高至60℃，衍生产物峰面积随时间延长有降低趋势，说明目标物发生了降解；确定最佳衍生条件为45℃加热20分钟。
[0071]
表1不同衍生温度和时间考察结果
[0072][0073]
实施例2专属性试验
[0074]
仪器及色谱条件同上，柱温：起始温度为80℃，维持5分钟，以每分钟30℃的速率升温至220℃，维持12分钟。
[0075]
定位溶液的制备：取3-氯丙酰氯适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含0.22mg的溶液。
[0076]
干扰贮备液的制备：取β-氯代苯丙酮制备工艺中用到的溶剂苯与石油醚各适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中分别约含20μg与10mg的混合溶液。
[0077]
干扰溶液的制备：量取干扰贮备液0.1ml，置同一10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0078]
分离度溶液的制备：量取定位溶液0.1ml与干扰贮备液0.1ml，置同一10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0079]
加标溶液的制备：取β-氯代苯丙酮约1.0g，置10ml量瓶，加定位溶液0.1ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0080]
取定位溶液、对照品溶液、甲醇、干扰溶液、供试品溶液、分离度溶液和加标溶液，密封，置45℃加热20分钟，放冷至室温，摇匀，量取各2μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，见附图1～附图7。
[0081]
结果：定位溶液和对照品溶液色谱图中衍生产物目标峰保留时间为8.147分钟和8.146分钟，溶剂甲醇、干扰溶液和供试品溶液色谱图中在此处均无干扰峰，分离度溶液和加标溶液色谱图中目标峰与相邻色谱峰均分离良好。
[0082]
实施例3系统适用性试验
[0083]
仪器及色谱条件同上，柱温：起始温度为100℃，维持3分钟，以每分钟30℃的速率升温至220℃，维持13分钟。
[0084]
取对照品溶液，密封，置45℃加热20分钟，放冷至室温，摇匀，精密量取各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见附图8。
[0085]
结果表明：在上述条件下，对照品溶液色谱图中衍生产物目标峰保留时间为4.785，相邻有其他杂峰，目标峰峰高较低，说明此条件下灵敏度较差，且易受相邻峰干扰。
[0086]
实施例4灵敏度试验
[0087]
定量限溶液的制备：精密量取对照品贮备液0.2ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0088]
检测限溶液的制备：精密量取定量限溶液5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0089]
取定量限溶液和检测限溶液，密封，置45℃加热20分钟，放冷至室温，摇匀，精密量取各2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。结果见表2及附图9、附图10。
[0090]
表2灵敏度试验结果
[0091]
名称浓度(μg/ml)信噪比(s/n)与供试品溶液浓度比(％)定量限0.44290.00044检测限0.22150.00022
[0092]
实施例5线性试验
[0093]
线性溶液的制备：精密量取对照品贮备液0.2ml、0.6ml、1.0ml、1.4ml、1.8ml，分别置5个10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，依次作为线性溶液1～线性溶液5溶液。
[0094]
取线性溶液1～线性溶液5溶液，密封，置45℃加热20分钟，放冷至室温，摇匀，精密量取各2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。以各溶液中3-氯丙酰氯的峰面积对浓度作曲线，用最小二乘法计算回归方程和相关系数，结果见表3和图11。结果表明：3-氯丙酰氯线性试验结果良好。
[0095]
表3线性试验结果表
[0096]
浓度范围(μg/ml)线性方程相关系数截距(％)0.44～3.97y＝1.0870x-0.01580.99970.67
[0097]
实施例6精密度试验
[0098]
取各对照品溶液，密封，置45℃加热20分钟，放冷至室温，摇匀，精密量取各2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。计算6个溶液色谱图中目标峰面积的相对标准偏差，结果见表
4。结果表明：精密度试验结果良好。
[0099]
表4精密度试验结果
[0100]
序号123456rsd(％)峰面积2.4482.3392.3952.5412.3872.4372.85
[0101]
实施例7溶液稳定性试验
[0102]
稳定性试验溶液的制备：取β-氯代苯丙酮约1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，加适量甲醇使溶解，再精密加入对照品贮备液1ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0103]
取稳定性试验溶液，密封，置45℃加热20分钟，放冷至室温，摇匀，室温放置，分别于0、2、4、6、8、24小时各精密量取2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图，计算目标峰面积的相对标准偏差，结果见表5。结果表明：衍生后溶液在室温条件下24小时内稳定。
[0104]
表5溶液稳定性试验结果
[0105]
时间(小时)0246824rsd(％)峰面积2.4712.5572.3912.4392.3752.2394.43
[0106]
实施例8准确度试验
[0107]
回收率溶液的制备：取β-氯代苯丙酮约1.0g，精密称定，共12分，分别置10ml量瓶中，加适量甲醇使溶解，再分别依次精密加入对照品贮备液0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml，各三份，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
[0108]
回收率空白溶液的制备：取β-氯代苯丙酮约1.0g，精密称定，置10ml量瓶，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0109]
取对照品溶液、回收率溶液和回收率空白溶液，密封，置45℃加热20分钟，放冷至室温，摇匀，精密量取各2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算回收率，结果见表6。结果表明：3-氯丙酰氯在定量限浓度、限度浓度50％、限度浓度100％、限度浓度150％四个浓度下，回收率结果均良好。
[0110]
表6遗传毒性杂质3-氯丙酰氯检查回收率试验结果
[0111][0112][0113]
实施例9多批供试品的检测
[0114]
取不同批次β-氯代苯丙酮制备所得的对照品溶液和供试品溶液，密封，置45℃加热20分钟，放冷至室温，摇匀，精密量取各2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，结果见表7。结果表明：三批β-氯代苯丙酮中3-氯丙酰氯的含量均小于22ppm，符合质量控制需求。
[0115]
表7供试品检测结果
[0116]
批号db0-200901db0-210201db0-2105013-氯丙酰氯含量小于检测限10.9ppm4.7ppm