一种同时检测胆木叶中10种活性成分含量的方法

1.本发明涉及化学分析及检测技术领域，特别涉及一种同时检测胆木叶中10种活性成分含量的方法。


背景技术：

2.胆木nauclea officinalis为茜草科(rubiaceae)乌檀属nauclea l.多年生木本植物，又名山熊胆、熊胆树、乌檀，是我国重点保护的珍稀野生植物物种之一。胆木浑身是宝，其干燥的树干、树枝、树皮、树叶和树根均可入药，性寒味苦，具清热解毒、消肿止痛之效。近年来，针对胆木资源的研究和开发主要集中于胆木树干部分中生物碱类活性成分的分析检测、分离鉴定以及药理活性测定，而对于胆木叶的研究与价值开发是较为匮乏的。
3.相关药理研究发现，胆木叶提取物具有抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性及抗氧化、抗炎和镇痛作用。胆木叶活性成分复杂，含有生物碱类化合物、酚酸类化合物、黄酮类化合物等具有药理作用的活性成分。胆木叶作为胆木植物的可再生资源，对其成分的检测分析、挖掘利用，将有可能使胆木叶替代胆木树干部分成为新的可再生药用资源，对深入开发胆木的药用价值，保护胆木植物资源具有巨大的意义。
4.目前，关于胆木叶活性成分的定量分析相关报道较少，且相关报道存在检测时间长，操作复杂、有机溶剂消耗大等缺点。此外，对于胆木叶质量控制相关报道中仅仅以异长春花苷内酰胺作为评价指标，其他酚酸类和黄酮类药效成分往往被大多数人或企业所忽视。事实上，酚酸类和黄酮类化合物也具有抗氧化、抗菌抗病毒、保肝利胆等多种药理活性。因此，为了提高和完善胆木叶药材的质量标准，对除异长春花苷内酰胺成分之外的酚酸类和黄酮类活性成分进行研究，显得尤为重要。
5.对于药材中活性成分定量分析的技术和手段主要有：薄层色谱法(tlc)、质谱法(ms)、高效液相色谱法(hplc)、液-质联用技术(lc-ms)等，其中以hplc法最为谱级。超高效液相色谱法(uplc)是采用小颗粒填料色谱柱(粒径一般小于2μm)和超高压(压力大于105kpa)系统的一种分离技术，相对于hplc，它更能显著改善色谱峰的分离度和灵敏度，同时可以缩短检测时间、减少有机溶剂的使用等，目前以广泛用于药材的成分分析上。uplc在胆木药材及其制剂中活性成分分析检测虽已报道，但检测的活性成分种类较少，检测时间较长，且在胆木叶活性成分的研究中未曾报道。因此如何快速、准确地同时测定胆木叶中的多种活性成分的含量，弥补现有胆木叶质量控制技术不够完善和科学的不足，准确、全面地控制胆木叶药材的质量，具有重要的意义。


技术实现要素：

6.鉴于此，本发明的目的在于提出一种同时检测胆木叶中10种活性成分含量的方法，该方法能够实现同时测定胆木叶中酚酸、黄酮及生物碱3类活性成分含量的测定，弥补现有药材质量控制技术不够完善，准确、全面地控制胆木叶药材的质量。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.一种同时检测胆木叶中10种活性成分含量的方法，包括以下步骤：
9.(1)样品溶液的制备：称取胆木叶加入乙醇溶液制备样品溶液；
10.(2)标准品溶液的制备：称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺的标准品，甲醇溶液溶解，分别制备不同浓度的标准品溶液；
11.(3)uplc-pda分析：
12.超高效液相色谱条件为：
13.流动相：流动相a为乙腈溶液，流动相b为体积浓度0.35-0.45％磷酸水溶液；
14.采用梯度洗脱方式为：
[0015][0016][0017]
检测波长：210-400nm。
[0018]
进一步说明，步骤(1)中，按料液比为1：45-55，称取胆木叶加入乙醇溶液进行提取，提取液抽滤，滤液过孔径0.22μm微孔滤膜，制备样品溶液。
[0019]
进一步说明，所述乙醇溶液的质量浓度为75-85％；所述提取为涡旋提取，涡旋转速为1800-2000rpm，提取时间为15-25min。
[0020]
进一步说明，步骤(3)中，色谱柱为waters acquity uplc beh c
18
。
[0021]
进一步说明，步骤(3)中，所述磷酸水溶液体积浓度为0.4％。
[0022]
进一步说明，步骤(3)中，柱温为33-37℃；进样量为0.8-1.2μl；流速为0.18-0.22ml/min。
[0023]
更进一步说明，柱温为35℃；进样量为2μl；流速为0.2ml/min。
[0024]
更进一步说明，步骤(3)中，检测波长为226nm/260nm/325nm。
[0025]
本发明具有以下优点和积极效果：
[0026]
本发明所述的同时测定胆木叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺10种活性成分含量的方法，利用uplc法，超高效液相色谱法(uplc)是采用小颗粒填料色谱柱(粒径一般小于2μm)和超高压(压力大于105kpa)系统的一种分离技术，相对于hplc，它更能显著改善色谱峰的分离度，同时可以缩短检测时间、减少有机试剂的使用等优势。
[0027]
本发明的检测方法操作简单，具有高灵敏度和精密度、重现性好、稳定性高、回收率好，可实现同时测定胆木叶中所含的酚酸、黄酮和生物碱3类活性成分，弥补了胆木叶药材质量控制技术不够完善和科学的不足，能准确、快速、全面地控制胆木叶药材的质量。
附图说明
[0028]
图1为实施例2同时测定胆木叶中酚酸、黄酮及生物碱3类活性成分的样品色谱图(a)和混合对照品色谱图(b)。
具体实施方式
[0029]
以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明。
[0030]
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031]
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到本发明所述同时测定胆木叶中10种活性成分含量的方法，包括以下步骤：
[0032]
(1)样品溶液的制备：精确称取干燥的胆木叶0.5g，放入50ml离心管中，精密加入25ml80％的乙醇，涡旋转速2000rpm条件下处理20min，抽滤，收集滤液，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤，即可。
[0033]
(2)标准品溶液的制备：精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺的标准品各2mg，分别溶于2ml色谱级甲醇溶液中，作为储备液，其他不同浓度的标准品溶液由储备液稀释即可得到。
[0034]
(3)混合对照品溶液的制备：选择一定的浓度的步骤(2)制备好的10种活性成分的标准品溶液，每个化合物的供试品溶液各吸取100μl置于2ml进样瓶中，摇匀，待用。
[0035]
(4)uplc检测：色谱柱为waters acquity uplc beh c
18
(100mm
×
2.1mm，1.7μm)；流动相：乙腈：0.4％磷酸水溶液，采用梯度洗脱方式为：
[0036][0037]
流速：0.2ml/min；检测波长：226nm(生物碱类化合物)/260nm(黄酮类化合物)/325nm(酚酸类化合物)；柱温：35℃；进样量：1μl。
[0038]
下面结合实施例对本发明提供的胆木叶活性成分含量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为本发明保护范围的限定。
[0039]
实施例1
[0040]
一种同时测定胆木叶中10种活性成分含量的方法，采用的仪器与材料：
[0041]
仪器：waters h-class型超高效液相色谱仪(美国waters公司)包括四元泵、真空在线脱气机、自动进样器、pda检测器、empower工作站；涡旋混合器(澳大利亚瑞德科仪器有限公司)，bsa224s-cw万分之一电子天平(上海托利多有限公司)，400a型多功能粉碎机(上海拜杰实业有限公司)。
[0042]
材料：胆木叶采自海南省琼中县；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺(成都钠钶锂生物科技有限公司)；色谱级甲醇、色谱级乙腈(德国默克公司)；色谱级磷酸(上海麦克林生化科技有限公司)无水乙醇(西陇科学股份有限公司)。
[0043]
实施例2
[0044]
一种同时测定胆木叶中10种活性成分含量的方法，包括如下步骤：
[0045]
(1)样品溶液的制备：精确称取干燥的胆木叶0.5g，放入50ml离心管中，精密加入25ml80％的乙醇，涡旋转速2000rpm条件下处理20min，抽滤，收集滤液，取滤液适量，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤，即可。
[0046]
(2)标准品溶液的制备：精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺的标准品各2mg，分别溶于2ml色谱级甲醇溶液中，作为储备液，其他不同浓度的标准品溶液由储备液稀释即可得到。
[0047]
(3)混合对照品溶液的制备：选择一定的浓度的步骤(2)制备好的10种活性成分的标准品溶液，每个化合物的供试品溶液各吸取100μl置于2ml进样瓶中，摇匀，待用。
[0048]
(4)uplc检测：色谱柱为waters acquity uplc beh c
18
(100mm
×
2.1mm，1.7μm)；流动相：乙腈：0.4％磷酸水溶液，采用梯度洗脱方式为：
[0049][0050][0051]
流速：0.2ml/min；检测波长：226nm(生物碱类化合物)/260nm(黄酮类化合物)/325nm(酚酸类化合物)；柱温：35℃；进样量：1μl。
[0052]
检测结果：此时待测组分的色谱峰能够达到很好的分离，峰形对称。在上述色谱条件下，样品溶液的色谱图为图1(a)，混合对照品溶液的色谱图为图1(b)。其中，1：新绿原酸；2：绿原酸；3：隐绿原酸；4：芦丁；5：短小蛇根草苷；6：山奈酚-3-o芸香糖苷；7：异绿原酸b；8：异绿原酸a；9：异绿原酸c；10：异长春花苷内酰胺的保留时间分别为2.307min、3.542min、4.038min、7.550min、7.779min、8.127min、8.370min、8.586min、9.034min、12.015min。
[0053]
由图1可知，采用本发明的方法，能够同时测定酚酸、黄酮及生物碱3类活性成分的含量。
[0054]
实施例3
[0055]
线性关系测定：精确称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺各2mg分别置于2ml试管中，用色谱甲醇依次稀释配制成一系列浓度的对照品测试溶液，依次进样进行uplc测定，每个浓度样品重复进样3次，计算峰面积的平均值。以对照品浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，建立线性回归方程。
[0056]
其中，检测信号高度与基线噪音高度的比值(信噪比)为3:1时的浓度为检出限(lod)，比值10:1时的浓度为定量限(loq)，各组分线性回归方程结果见表1。
[0057]
由表1可知，各回归方程线性关系良好(r2≥0.999)，且该方法具有相对较低的检出限及定量限，充分证明该方法具有较高的灵敏性。
[0058]
表1胆木叶中10种活性成分的线性范围、线性方程、相关系数、lod和loq
[0059]
[0060][0061]
a:六个不同浓度(n＝3)
[0062]
y:平均峰面积
[0063]
x:标准品浓度(μg/ml)
[0064]
实施例4
[0065]
精密度实验：准确吸取混合对照品溶液，分别在24h内连续重复进样6次，以及连续72h内每24h连续重复进样3次，每次进样20μl，根据色谱图中的峰面积的相对标准偏差(rsd)值来考察日内及日间精密度，结果见表2。
[0066]
由表2可知，胆木叶3类活性成分的日内精密度的rsd范围在0.34％～0.88％之间，日间精密度的rsd范围在1.30％～3.13％之间，均小于5％，说明该方法的精密度良好。
[0067]
表2胆木叶中10种活性成分的精密度测定结果。
[0068][0069][0070]
实施例5
[0071]
重现性实验：准确吸取混合对照品溶液连续重复进样检测6次，根据色谱图中的峰
面积计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺的相对标准偏差(rsd)，结果见表3。
[0072]
由表3可知，胆木叶3类活性成分的峰面积的rsd范围在0.34％～0.65％之间，均小于5％，说明该方法重现性较好。
[0073]
表3胆木叶中10种活性成分的重复性测定结果
[0074]
化合物平均峰面积标准偏差rsd(％)新绿原酸764721.333564.530.47绿原酸802103.335093.230.63隐绿原酸468389.502133.950.46芦丁570989.501956.700.34短小蛇根草苷7213496.3339526.010.55山奈酚-3-o芸香糖苷474847.001645.980.35异绿原酸b4496373.3329252.210.65异绿原酸a4882213.0028793.360.59异绿原酸c5065515.5029512.520.58异长春花苷内酰胺1087910.173628.190.33
[0075]
实施例6
[0076]
稳定性实验：取已制备好的样品溶液适量，在48h内，每隔6h对样品溶液进行一次测定，并对其峰面积的相对标准偏差(rsd)进行计算，结果见表4。
[0077]
由表4可知，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺的rsd分别为1.94％、2.81％、2.71％、0.67％、2.11％、1.66％、1.80％、1.80％、2.02％、2.17％，均小于5％，结果表明样品溶液在48h内基本稳定。
[0078]
表4胆木叶中10种活性成分的样品稳定性测定结果
[0079][0080][0081]
实施例7
[0082]
加样回收率实验：取适量的样品溶液，分别精密加入甲醇溶解的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、短小蛇根草苷、山奈酚-3-o芸香糖苷、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c以及异长春花苷内酰胺对照品溶液，进行3次平行测定，按下列公式分别计算胆木叶样品平均回收率及相对标准偏差(rsd)，结果见表5。
[0083]
加样回收率＝(c
1-c2)/m*100％，其中，c1为测得的目标成分总量，c2为胆木叶样品中目标成分的量，m为加入的胆木叶标准品量。
[0084]
结果表明，样品的加标回收率在96.32％～105.50％之间，相对标准偏差小于0.95％，说明该方法回收率良好。
[0085]
表5胆木叶中10种活性成分的加样回收率测定结果
[0086]
化合物对照品加入量(μg)平均回收量(μg)平均回收率(％)rsd(％)新绿原酸55.20104.080.58绿原酸55.28105.500.95隐绿原酸54.9999.780.89芦丁55.10102.050.79短小蛇根草苷55.20104.010.12山奈酚-3-o芸香糖苷54.8296.320.58异绿原酸b55.18103.600.21异绿原酸a55.00100.090.79异绿原酸c54.9097.930.20异长春花苷内酰胺55.13102.540.12
[0087]
综上，本发明所建立的胆木叶中10种活性成分的检测方法具有操作简单、检测快速、灵敏度高、精密度好、重现性好、稳定性高、回收率好的特点，可以实现同时测定胆木叶中所含的酚酸、黄酮及生物碱3类活性成分，弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足，能准确、全面地控制胆木叶药材的质量。
[0088]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。