骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用与流程

1.本发明涉及骨髓涂片染色技术领域，具体涉及骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用。


背景技术：

2.骨髓增生异常综合征(mds)是一组起源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，其特点是髓系细胞发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，高风险向急性髓系白血病(aml)转化。mds主要表现为粒、红和巨核三系病态造血，而巨核系病态主要表现为明显增多的微小巨核细胞，尤其是淋巴样小巨核细胞。
3.微小巨核细胞是一类形态异常的小型巨核细胞，见于多种血液病，是骨髓病态造血的特征之一。目前病态小巨核细胞已被列为mds的诊断指标之一。由于其体积较小，形态多样，临床上靠形态学常规瑞氏-姬姆萨染色，常常难以识别和认定这种小巨核细胞，易与淋巴细胞、幼稚红细胞等相混淆，漏检率高。因此用特殊的染色方法或巨核细胞免疫组化的染色方法，将小型巨核细胞着色，小核型巨核细胞阳性，对骨髓增生异常综合征的诊断、分型有重要意义。
4.骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南(2019年版)中明确提到：怀疑为mds的患者应行gomori银染色和原位免疫组化(immunohistochemistry，ihc)，常用的检测标志包括cd34、mpo、gpa、cd61、cd42、cd68、cd20和cd3。细胞形态学检查结果提示巨核细胞病态造血，免疫细胞化学染色检测发现一定比例的小、微巨核细胞。2010年国际mds血液病理学工作会议建议，骨髓石蜡切片选择1～2个巨核细胞标志物，包括cd42b、cd61、cd31及cd41。
5.目前，市面上采用的骨髓涂片染色方法包括sp法、sap染色法、apaap染色法、亲和素-生物素-过氧化物酶技术等，这些方法均存在一定缺陷，如步骤繁琐、需要多步抗体孵育、操作时间长、与内源性生物素结合的问题、增强阳性信号的同时也增加了非特异性背景染色等。
6.cn104865377a提供了一种用cd41和cd61抗体联合标记的骨髓涂片微小巨核细胞染色试剂盒。该方法存在以下缺陷：
①
cd41、cd61两种抗体鸡尾酒方式联合标记进行免疫组化染色，步骤繁琐，灵敏度和特异性难以兼得；
②
制备好的骨髓血涂片样本没有经过固定，细胞固有形态及结构难以更好的维持，且抗原有可能弥散或失活；
③
采用抗原修复液对骨髓血涂片样本进行抗原热修复，一方面本来就没有经过固定的骨髓血涂片样本，高温热修复极易破坏细胞形态，且导致细胞脱片，另一方面，加热及降温时间长且需要加热设备，过程繁琐；
④
采用辣根过氧化物酶标记的dab显色系统，3％过氧化氢封闭处理不能完全消除内源性过氧化物酶，导致最终染色结果出现中性粒细胞非特异性染色，影响结果的准确判读。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种骨髓涂片小巨核细胞染色试剂
盒、染色方法及应用，本发明提供了检测灵敏度高，特异性好，操作简单同时避免了背景非特异性染色问题的染色试剂盒及染色方法。
8.本发明提供了骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒，包括：一抗试剂、二抗试剂和染色剂；
9.所述一抗试剂包括抗体和抗体稀释剂，所述抗体选自cd41单克隆抗体、cd42b单克隆抗体或cd61单克隆抗体中至少一种；
10.所述二抗试剂包括碱性磷酸酶标记的二抗聚合物；
11.所述染色剂包括快红显色剂和苏木素复染试剂。
12.cd41单克隆抗体、cd42b单克隆抗体或cd61单克隆抗体有助于巨核细胞的识别，配合碱性磷酸酶(ap)标记的二抗试剂、快红染色试剂和苏木素复染试剂，可以明显提高微小巨核细胞的检出率，对于mds的早期诊断及鉴别诊断具有重要的临床价值。
13.本发明实施例中，所述试剂盒中试剂组成如下表：
[0014][0015]
本发明中，所述抗体稀释剂包含水、tris-hcl、牛血清白蛋白、氯化钠、非离子表面活性剂、果绿色素和抑菌剂。相比其他抗体稀释剂，本发明提供的所述抗体稀释剂为所述抗体提供了更加稳定的工作环境，可以更长时间的保证抗体的稳定性及抗体特异性，从而获得更准确的技术效果。
[0016]
在一些具体实施例中，所述非离子表面活性剂为tween-20，所述抑菌剂为proclin 950。相比较其他试剂，tween-20和proclin 950分别作为表面活性剂与抑菌剂应用于抗体稀释剂中，与抗体的兼容性好，能够更有效的配合抗体和其他试剂完成检测，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
[0017]
进一步优选的，所述抗体稀释剂由水和6g/l tris-hcl、15g/l牛血清白蛋白、8.5g/l氯化钠、0.1vol％的tween-20、0.01wt％的果绿色素和0.15wt％的proclin 950组成，所述抗体稀释剂的ph为7.60
±
0.05。实验表明，在此浓度及ph下，所述抗体稀释剂与抗体的兼容性最高。
[0018]
本发明中，所述二抗试剂包含水、碱性磷酸酶标记的二抗聚合物、tris、蛋白保护剂、氯化钠、tween-20、抑菌剂、酶保护剂和稳定剂ⅳ。相比其他试剂，本发明所述的二抗试剂能够更特异、稳定的与所述一抗试剂及其他试剂配合使用，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
[0019]
在一些具体实施例中，所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白，所述酶保护剂为金属离子，所述酶保护剂包括锌离子、镁离子、钙离子中的一种或多种混合物，所述稳定剂ⅳ为甘油，所述抑菌剂为proclin 950。相比较其他试剂，牛血清白蛋白、甘油和proclin 950分别作为蛋白保护剂、稳定剂与抑菌剂应用于所述二抗试剂中，与抗体的兼容性好，能够更有效的配合抗体和其他试剂完成检测，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
[0020]
进一步优选的，所述二抗试剂由水和8～12μg/ml碱性磷酸酶标记的抗兔聚合物、6g/l tris、10g/l牛血清白蛋白、8.5g/l氯化钠、3g/l tween-20、0.1wt％的proclin 950、0.1～1mm酶保护剂和40vol％的甘油，所述酶保护剂为金属离子，所述酶保护剂包括锌离子、镁离子、钙离子中的一种或多种混合物，所述二抗试剂的ph为7.20
±
0.05。实验表明，在此浓度及ph下，所述二抗试剂与所述一抗试剂的特异性结合效果最佳。
[0021]
更进一步的优选的，所述锌离子来自氯化锌，所述镁离子来自氯化镁。
[0022]
本发明中，所述快红染色试剂包括：快红显色剂、快红活化剂和快红缓冲液；
[0023]
所述快红显色剂包括芳伯胺类化合物和无机强酸，所述芳伯胺类化合物为碱性品红、新品红、3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺中的任意一种，所述无机强酸为盐酸、氢溴酸、氟硼酸、硫酸、硝酸中的任意一种；
[0024]
所述快红活化剂为硝基试剂；
[0025]
所述快红缓冲液包括萘酚磷酸盐、tris、氯化钠、镁离子激活剂、内源性碱性磷酸酶抑制剂、除垢剂、抑菌剂。
[0026]
与其他试剂相比，本发明提供的所述快红显色剂，与所述一抗试剂、二抗试剂以及其他试剂联合使用，能够更有效的配合抗体实现染色；所述快红活化剂和所述快红缓冲液，为所述一抗试剂、二抗试剂以及所述染色剂提供了稳定的染色环境。以上各组分之间的配合染色获得更准确、更灵敏以及背景染色问题小的技术效果。
[0027]
在一些具体实施例中，所述快红显色剂中，所述芳伯胺类化合物为3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺，所述无机强酸为盐酸；
[0028]
所述快红活化剂为亚硝酸钠，与其他试剂相比，亚硝酸钠参与快红显色剂的活化效果更显著；
[0029]
所述快红缓冲液中，所述镁离子激活剂为mgcl2·
6h2o，所述内源性碱性磷酸酶抑制剂为盐酸左旋咪唑，所述除垢剂为tween-20，所述抑菌剂为proclin 950，相比其他试剂，mgcl2·
6h2o、盐酸左旋咪唑、tween-20和proclin 950参与快红缓冲液，染色环境更稳定，与抗体的兼容性好，能够更有效的配合抗体和其他试剂完成检测，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
[0030]
进一步优选的，所述快红显色剂包括20.0～40.0g/l芳伯胺类化合物和0.5～1m无机强酸，所述芳伯胺类化合物为碱性品红、新品红、3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺中的任意一种，所述无机强酸为盐酸、氢溴酸、氟硼酸、硫酸、硝酸中的任意一种；
[0031]
所述亚硝酸钠浓度为8.28～16.56g/l。
[0032]
所述快红缓冲液包括2～3m萘酚磷酸盐、12.1g/l tris、5.85g/l氯化钠、2.03g/l mgcl2·
6h2o、0.24g/l盐酸左旋咪唑、0.3vol％的tween-20和0.5wt％的proclin 950，所述萘酚磷酸盐为萘酚as-tr磷酸酯、萘酚as-tr磷酸二钠盐、萘酚as-bi磷酸盐二钠盐水合物中的任意一种。
[0033]
实验表明，在此浓度下，所述快红染色试剂的染色效果最佳。
[0034]
本发明中，所述苏木素复染试剂包括苏木精、硫酸铝钾、氧化剂ⅱ和稳定剂v。与其他试剂相比，本发明提供的所述苏木素复染试剂，与所述一抗试剂、二抗试剂以及其他试剂联合使用，最终获得的细胞核复染效果好，从而获得更准确、更灵敏以及背景染色问题小的技术效果。
[0035]
在一些具体实施例中，所述氧化剂ⅱ为碘酸钠，所述稳定剂v为甘油。相比较其他试剂，碘酸钠与甘油作为氧化剂和稳定剂应用于苏木素复染试剂中，染色灵敏度更高，染色的着色效果更清晰、鲜明。
[0036]
进一步优选的，所述苏木素复染试剂包括5g/l苏木精、50g/l硫酸铝钾、0.5g/l碘酸钠和5vol％的甘油。实验表明，在此浓度下，所述苏木素复染试剂的核染效果最佳。
[0037]
本发明提供的骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒中还包括固定剂和清洗液，其中：
[0038]
所述固定液包括甲醇和丙酮；
[0039]
所述清洗液包括水、tris、氯化钠、表面活性剂和防腐剂。
[0040]
与其他试剂相比，本发明提供的所述固定液对骨髓细胞的固定效果好，与所述快红染色试剂配合使用，经所述固定液固定后的骨髓细胞结构更清晰，染色更鲜艳；本发明提供的所述清洗液对所述一抗试剂和所述二抗试剂的清洗效果好，能够有效的降低不必要的背景染色问题，增强信噪比。
[0041]
在一些具体的实施例中，所述清洗液中，所述表面活性剂为tween-20，所述防腐剂为proclin950。
[0042]
进一步优选的，所述固定液包括体积比为1:1的甲醇和丙酮；所述清洗液中，各组分浓度为60g/l tris，87g/l氯化钠、0.25vol％的tween-20和0.4wt％的proclin950。实验表明，在此浓度下，所述固定液的固定效果最好，所述清洗液在具体实验中稀释10倍使用时清洁能力最佳。
[0043]
本发明中，所述一抗试剂与所述二抗试剂的体积比为1:1，在此体积比下，骨髓细胞、所述一抗试剂和所述二抗试剂的结合能力最好，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
[0044]
本发明中，所述快红染色试剂中，所述快红显色剂、快红活化剂和快红缓冲液的体积比为1:1:20，在此体积比下的快红染色试剂能够更加快速的形成红色沉淀。
[0045]
本发明中，本发明还提供了骨髓涂片小巨核细胞染色方法，其采用上述骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒对细胞进行染色。
[0046]
优选的，所述染色方法包括以下步骤：
[0047]
步骤1、制备骨髓血涂片并固定；
[0048]
步骤2、采用所述一抗试剂孵育；
[0049]
步骤3、采用所述二抗试剂孵育；
[0050]
步骤4、采用所述快红染色试剂染色；
[0051]
步骤5、采用所述苏木素复染试剂复染。
[0052]
更优选的，所述骨髓血涂片采用所述固定剂进行固定。
[0053]
更优选的，所述一抗试剂80～150μl，孵育时间为30～60min。
[0054]
更优选的，所述二抗试剂80～150μl，孵育时间为20～30min。
[0055]
更优选的，所述快红染色试剂中，所述快红显色剂、快红活化剂和快红缓冲液的体积比为1:1:20，所述快红染色试剂80～150μl，染色时间为8～15min。
[0056]
更优选的，所述苏木素复染试剂80～150μl，复染时间为3～5min。
[0057]
更优选的，所述一抗试剂与二抗试剂的加样体积为1:1。
[0058]
进一步优选的，所述染色方法包括以下步骤：
[0059]
步骤1、采用所述固定剂进行骨髓血涂片固定，所述固定液包括体积比为1:1的甲醇和丙酮；
[0060]
步骤2、采用所述一抗试剂80μl，35℃孵育60min，并采用所述清洗液进行清洗；
[0061]
步骤3、采用所述二抗试剂80μl，35℃孵育30min，并采用所述清洗液进行清洗；
[0062]
步骤4、采用所述快红染色试剂80μl，室温孵育8min，并进行水洗；
[0063]
步骤5、采用所述苏木素复染试剂80μl，室温复染3min，并进行水洗。
[0064]
本发明还提供了骨髓增生异常综合征的诊断方法，包括：采用本发明的骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒或骨髓涂片小巨核细胞染色方法对样本进行检测。
[0065]
本发明分别采用cd41单克隆抗体、cd42b单克隆抗体和cd61单克隆抗体联合碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物，并采用快红染色试剂与苏木素复染试剂进行骨髓细胞染色。与现有技术相比，本发明提供的染色试剂盒染色结果特异性强，信号表达准确且清晰，无背景非特异染色问题，染色方法方便快捷。本发明的试剂盒搭载全自动免疫组化染色仪，无需人工干预，操作简单便捷，染色稳定性好，极大的提高了染色效率和实验室标准化水平
附图说明
[0066]
图1为实施例1中巨核细胞系染色结果图；
[0067]
图2为实施例2中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0068]
图3为实施例3中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0069]
图4为实施例4中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0070]
图5为实施例5中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0071]
图6为实施例6中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0072]
图7为对比例1中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0073]
图8为对比例2中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0074]
图9为对比例3中骨髓血涂片样本染色结果图，其中a为低倍镜(10
×
)下观察的染色结果，b为高倍镜(20
×
)下观察的染色结果；
[0075]
图10为对比例4中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0076]
图11为对比例5中骨髓血涂片样本染色结果图；
[0077]
图12为对比例6中骨髓血涂片样本染色结果图，其中骨髓血涂片样本与对比例3来源相同；
[0078]
图13为试验例1中骨髓血涂片cd41 hrp-aec染色结果图，不同浓度过氧化氢封闭剂和封闭时间对骨髓血涂片cd41 hrp-aec染色结果与此相似，其中，a是巨核细胞染色示意
图，b是粒细胞非特异性染色示意图；
[0079]
图14为试验例2中不加辣根过氧化物酶标记的二抗聚合物时骨髓血涂片cd41hrp-aec染色结果图，不同浓度过氧化氢封闭剂和封闭时间对骨髓血涂片cd41 hrp-aec染色结果与此相似。
具体实施方式
[0080]
本发明提供了骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0081]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中：
[0082]
ap-抗兔聚合物(河南赛诺特生物技术有限公司，浓度为8～12μg/ml)。
[0083]
cd41兔抗人单克隆抗体(abcam，克隆号：epr4330，抗体效价1：250)
[0084]
cd42b兔抗人单克隆抗体(河南赛诺特生物技术有限公司，克隆号：ep409，抗体效价1：250)
[0085]
cd61兔抗人单克隆抗体(abcam，克隆号：erp17507，抗体效价1:800)
[0086]
本发明提供的骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒具体组分如下所示：
[0087][0088]
其中，抗体稀释剂包含水、tris-hcl、牛血清白蛋白、氯化钠、非离子表面活性剂、果绿色素和抑菌剂，非离子表面活性剂为tween-20，抑菌剂为proclin 950；
[0089]
二抗试剂中，碱性磷酸酶标记的二抗聚合物具体为ap-抗兔聚合物，蛋白保护剂为牛血清白蛋白，酶保护剂为金属离子，锌离子、镁离子、钙离子中的一种或多种混合物，稳定
剂ⅳ为甘油，抑菌剂为proclin 950；
[0090]
快红显色剂中，芳伯胺类化合物为碱性品红、新品红、3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺中的任意一种，无机强酸为盐酸、氢溴酸、氟硼酸、硫酸、硝酸中的任意一种；
[0091]
快红活化剂中，硝基试剂为亚硝酸钠；
[0092]
快红缓冲液中，萘酚磷酸盐为萘酚as-tr磷酸酯、萘酚as-tr磷酸二钠盐、萘酚as-bi磷酸盐二钠盐水合物中的任意一种，镁离子激活剂为mgcl2·
6h2o，内源性碱性磷酸酶抑制剂为盐酸左旋咪唑，除垢剂为tween-20，抑菌剂为proclin 950；
[0093]
苏木素复染试剂中，氧化剂ⅱ为碘酸钠，稳定剂v为甘油。
[0094]
清洗液中，表明活性剂为tween-20，防腐剂为proclin950。
[0095]
本发明还提供了一种搭载全自动免疫组化染色仪使用的染色方法，包括以下步骤：
[0096]
1)样本制备
[0097]
制备骨髓细胞或外周血涂片。
[0098]
2)固定
[0099]
采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0100]
3)一抗孵育
[0101]
加一抗试剂，其中一抗试剂与二抗试剂体积比1:1，35℃孵育30～60min，与组织切片内抗原蛋白结合。
[0102]
注：一抗试剂中包括cd41兔抗人单克隆抗体、cd42b兔抗人单克隆抗体、cd61兔抗人单克隆抗体。
[0103]
4)二抗孵育
[0104]
加入二抗试剂，35℃孵育20～30min，使一抗与二抗特异性结合。
[0105]
注：所述碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物为：聚合物ap-gar(羊抗兔igg)，第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，同时二抗被标记了碱性磷酸酶(ap)，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号，并引入显色系统。
[0106]
5)快红显色
[0107]
加入快红染色试剂100μl，室温孵育8～15min，以红色沉淀的形式呈现。
[0108]
注：快红染色试剂中，快红显色剂、快红活化剂和快红缓冲液的体积比为1:1:20。另，本技术中所指室温可以为18～30℃，具体实验中优选25℃。
[0109]
6)苏木素复染
[0110]
加入苏木素复染试剂室温复染3～5min，衬染细胞核。
[0111]
通过骨髓血涂片进行免疫细胞化学染色的方法可以进一步标记巨核细胞。定性异常包括核不分叶/低分叶且大小正常的巨核细胞、核不分叶或无分叶的小巨核细胞、微巨核细胞、多核巨核细胞、核高分叶的大巨核细胞、细胞质异常的巨核细胞和受损的巨核细胞。cd41、cd42b、cd61免疫染色对于鉴别不同形式的巨核细胞异常具有重要的临床价值。在本研究中还检测到其他异常巨核细胞模式，但微巨核细胞与mds有明显关联。因此，cd41、cd42b、cd61免疫染色是巨核细胞分析的良好辅助工具。
[0112]
cd41、cd42b、cd61标记染色阳性细胞形态：巨核细胞、血小板的胞膜及胞浆显示红色，阳性定位准确，信号表达清晰，染色结果鲜艳明亮，无背景染色。
[0113]
本技术方案搭载赛诺特自研cnt330全自动免疫组化染色仪，支持连续上机，三个独立玻片架，同时加载30张玻片，玻片可连续更换，于一个批次完成后便可立即执行下一批次实验，并可随意编辑各种不同的免疫组化染色程序，共有3个工作平台可使用。低至80μl的试剂加样量，减少试剂消耗。可实现包括一抗孵育、二抗孵育、快红显色、苏木素复染等免疫组化步骤在内的全流程全自动系统，无需人工干预，操作简单便捷，极大的提高了染色效率和实验室标准化水平。有害废液和无害废液分开处理，符合有毒废弃物分开处理原则，有助于实验室评鉴认证。
[0114]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0115]
实施例1：
[0116]
1、试剂配制
[0117]
1.1、一抗试剂：由纯水和以下组分组成：cd41兔抗人单克隆抗体(克隆号：epr4330，抗体效价1：250)，cd42b兔抗人单克隆抗体(克隆号：ep409，抗体效价1：250)，cd61兔抗人单克隆抗体(克隆号：erp17507，抗体效价1:800)，6g/l tris-hcl、15g/l牛血清白蛋白、8.5g/l氯化钠、0.1vol％的tween-20、0.01wt％的果绿色素和0.15wt％的proclin950，ph＝(7.60
±
0.05)；
[0118]
1.2、二抗试剂：由纯水和以下组分组成：8μg/ml ap-抗兔聚合物、6g/l tris、10g/l牛血清白蛋白、8.5g/l氯化钠、3g/l tween-20、0.1wt％proclin的950、1mm氯化镁、0.1mm氯化锌(酶保护剂)和40vol％的甘油，ph＝(7.20
±
0.05)；
[0119]
1.3、快红显色剂：由纯水和以下组分组成：20.0g/l 3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺，0.5m盐酸；
[0120]
1.4、快红活化剂：由纯水和以下组分组成：8.28g/l亚硝酸钠；
[0121]
1.5、快红缓冲液：由纯水和以下组分组成：12.1g/l tris、5.85g/l氯化钠、2.03g/l mgcl2·
6h2o、0.24g/l盐酸左旋咪唑、0.3vol％的tween-20、0.5wt％的proclin 950和2m萘酚as-tr磷酸酯；
[0122]
1.6、苏木素复染试剂：由纯水和以下组分组成：5g/l苏木精、50g/l硫酸铝钾、0.5g/l碘酸钠和5％甘油；
[0123]
1.7、清洗液：由纯水和以下组分组成：60g/l tris，87g/l氯化钠、0.25vol％的tween-20和0.4wt％的proclin950，具体实验时用纯水稀释10倍使用。
[0124]
2、该实施例提供了一种搭载全自动免疫组化染色仪使用的染色方法，包括以下步骤：
[0125]
1)样本制备
[0126]
采用购买的巨核细胞系制备涂片样本。
[0127]
该巨核细胞系来自bncc北纳生物人巨核细胞白血病细胞，编号bncc359444。
[0128]
2)固定
[0129]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0130]
3)一抗孵育
[0131]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂，80μl，35℃孵育60min。清洗液冲洗5次，2min/次。
[0132]
4)二抗孵育
[0133]
加入碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物80μl，35℃孵育30min，使一抗与二抗特异性结合；清洗液冲洗5次，2min/次。
[0134]
5)快红显色
[0135]
加入快红染色试剂80μl(其中快红显色剂：快红活化剂：快红缓冲液＝1:1:20稀释比)，室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗5次，1min/次。
[0136]
6)苏木素复染
[0137]
加入苏木素80μl，室温复染3min，衬染细胞核；纯化水冲洗5次，2s/次。晾干，显微镜下观察。
[0138]
实施例2：
[0139]
试剂配制同实施例1，其中：
[0140]
二抗试剂中，ap-抗兔聚合物浓度为10μg/ml，酶保护剂为0.1mm氯化锌；
[0141]
快红显色剂：由纯水和以下组分组成：40.0g/l3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺，1m盐酸；
[0142]
快红活化剂：由纯水和以下组分组成：16.56g/l亚硝酸钠；
[0143]
快红缓冲液：由纯水和以下组分组成：12.1g/l tris、5.85g/l氯化钠、2.03g/l mgcl2·
6h2o、0.24g/l盐酸左旋咪唑、0.3vol％的tween-20、0.5wt％的proclin 950和3m萘酚as-tr二钠盐。
[0144]
该实施例提供了一种搭载全自动免疫组化染色仪使用的染色方法，包括以下步骤：
[0145]
1)样本制备
[0146]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0147]
2)固定
[0148]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0149]
3)一抗孵育
[0150]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂100μl，35℃孵育60min。清洗液冲洗5次，2min/次。
[0151]
4)二抗孵育
[0152]
加入碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物100μl，35℃孵育30min，使一抗与二抗特异性结合；清洗液冲洗5次，2min/次。
[0153]
5)快红显色
[0154]
加入快红染色试剂100μl(快红显色剂：快红活化剂：快红缓冲液＝1:1:20稀释比)，室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗5次，1min/次。
[0155]
苏木素复染
[0156]
加入苏木素100μl，室温复染3min，衬染细胞核；纯化水冲洗5次，2s/次。晾干，显微镜下观察。
[0157]
图2所示为骨髓增生异常综合征(mds)病例中的淋巴样微小巨核细胞cd41染色结果。mds见淋巴样小巨核细胞是mds与其他贫血性疾病的重要区别。
[0158]
实施例3：
[0159]
试剂配制同实施例1，其中：
[0160]
二抗试剂中，ap-抗兔聚合物浓度为12μg/ml，酶保护剂为1mm氯化镁；
[0161]
快红显色剂：由纯水和以下组分组成：40.0g/l 3-氨基-4-甲氧基苯甲酰胺，1m盐酸；
[0162]
快红活化剂：由纯水和以下组分组成：16.56g/l亚硝酸钠；
[0163]
快红缓冲液：由纯水和以下组分组成：12.1g/l tris、5.85g/l氯化钠、2.03g/l mgcl2·
6h2o、0.24g/l盐酸左旋咪唑、0.3vol％的tween-20、0.5wt％的proclin 950，3m萘酚as-bi磷酸盐二钠盐水合物。
[0164]
该实施例提供了一种搭载全自动免疫组化染色仪使用的染色方法，包括以下步骤：
[0165]
1)样本制备
[0166]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0167]
2)固定
[0168]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0169]
3)一抗孵育
[0170]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂150μl，35℃孵育40min。清洗液冲洗5次，2min/次。
[0171]
4)二抗孵育
[0172]
加入碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物150μl，35℃孵育30min，使一抗与二抗特异性结合；清洗液冲洗5次，2min/次。
[0173]
5)快红显色
[0174]
加入快红染色试剂150μl(快红显色剂：快红活化剂：快红缓冲液＝1:1:20稀释比)，室温孵育10min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗5次，1min/次。
[0175]
6)苏木素复染
[0176]
加入苏木素150μl，室温复染4min，衬染细胞核；纯化水冲洗5次，2s/次。晾干，显微镜下观察。
[0177]
实施例4：
[0178]
试剂配制同实施例1，其中：
[0179]
二抗试剂中，ap-抗兔聚合物浓度为8μg/ml，酶保护剂为1mm氯化镁、0.1mm氯化锌；
[0180]
快红显色剂：由纯水和以下组分组成：40.0g/l新品红，1m盐酸；
[0181]
快红活化剂：由纯水和以下组分组成：16.56g/l亚硝酸钠；
[0182]
快红缓冲液：由纯水和以下组分组成：12.1g/l tris、5.85g/l氯化钠、2.03g/l mgcl2·
6h2o、0.24g/l盐酸左旋咪唑、0.3vol％的tween-20、0.5wt％的proclin 950和3m萘酚as-tr二钠盐。
[0183]
该实施例提供了一种搭载全自动免疫组化染色仪使用的染色方法，包括以下步骤：
[0184]
1)样本制备
[0185]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0186]
2)固定
[0187]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾
干，得到待染色的涂片。
[0188]
3)一抗孵育
[0189]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂150μl，35℃孵育30min。清洗液冲洗5次，2min/次。
[0190]
4)二抗孵育
[0191]
加入碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物150μl，35℃孵育20min，使一抗与二抗特异性结合；清洗液冲洗5次，2min/次。
[0192]
5)快红显色
[0193]
加入快红染色试剂150μl(快红显色剂：快红活化剂：快红缓冲液＝1:1:20稀释比)，室温孵育15min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗5次，1min/次。
[0194]
6)苏木素复染
[0195]
加入苏木素150μl，室温复染5min，衬染细胞核；纯化水冲洗5次，2s/次。晾干，显微镜下观察。
[0196]
实施例5：
[0197]
试剂配制同实施例1，其中：
[0198]
二抗试剂中，ap-抗兔聚合物浓度为8μg/ml，酶保护剂为1mm氯化镁；
[0199]
快红显色剂：由纯水和以下组分组成：20.0g/l新品红，1m盐酸；
[0200]
快红活化剂：由纯水和以下组分组成：8.28g/l亚硝酸钠；
[0201]
快红缓冲液：由纯水和以下组分组成：12.1g/l tris、5.85g/l氯化钠、2.03g/l mgcl2·
6h2o、0.24g/l盐酸左旋咪唑、0.3vol％的tween-20、0.5wt％的proclin 950和2m萘酚as-tr磷酸酯。
[0202]
该实施例提供了一种搭载全自动免疫组化染色仪使用的染色方法，包括以下步骤：
[0203]
1)样本制备
[0204]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0205]
2)固定
[0206]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0207]
3)一抗孵育
[0208]
加cd42b兔抗人单克隆抗体试剂100μl，35℃孵育60min。清洗液冲洗5次，2min/次。
[0209]
4)二抗孵育
[0210]
加入碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物100μl，35℃孵育30min，使一抗与二抗特异性结合；清洗液冲洗5次，2min/次。
[0211]
5)快红显色
[0212]
加入快红染色试剂100μl(快红显色剂：快红活化剂：快红缓冲液＝1:1:20稀释比)，室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗5次，1min/次。
[0213]
6)苏木素复染
[0214]
加入苏木素100μl，室温复染3min，衬染细胞核；纯化水冲洗5次，2s/次。晾干，显微镜下观察。
[0215]
实施例6：
[0216]
试剂配制同实施例1，其中：
[0217]
二抗试剂中，ap-抗兔聚合物浓度为10μg/ml，酶保护剂为0.1mm氯化锌；
[0218]
快红显色剂：由纯水和以下组分组成：40.0g/l新品红，1m盐酸；
[0219]
快红活化剂：由纯水和以下组分组成：16.56g/l亚硝酸钠；
[0220]
快红缓冲液：由纯水和以下组分组成：12.1g/l tris、5.85g/l氯化钠、2.03g/l mgcl2·
6h2o、0.24g/l盐酸左旋咪唑、0.3vol％的tween-20、0.5wt％的proclin 950和3m萘酚as-tr磷酸酯。
[0221]
该实施例提供了一种搭载全自动免疫组化染色仪使用的染色方法，包括以下步骤：
[0222]
1)样本制备
[0223]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0224]
2)固定
[0225]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0226]
3)一抗孵育
[0227]
加cd61兔抗人单克隆抗体试剂80μl，35℃孵育60min。清洗液冲洗5次，前两次0min/次，后三次1min/次。
[0228]
4)二抗孵育
[0229]
加入碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物80μl，35℃孵育30min，使一抗与二抗特异性结合；清洗液冲洗5次，前两次0min/次，后三次1min/次。
[0230]
5)快红显色
[0231]
加入快红染色试剂80μl(快红显色剂：快红活化剂：快红缓冲液＝1:1:20稀释比)，室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗5次，前两次0min/次，后三次1min/次。
[0232]
6)苏木素复染
[0233]
加入苏木素80μl，室温复染3min，衬染细胞核；纯化水冲洗5次，2s/次。晾干，显微镜下观察。
[0234]
实施例1～6染色结果总结如下表所示。
[0235]
[0236][0237]
对比例1：
[0238]
该对比例提供了传统瑞氏-姬姆萨染色方法，包括如下步骤：
[0239]
该对比例中所用瑞氏-姬姆萨染色液购买自河南赛诺特生物技术有限公司。
[0240]
1)样本制备
[0241]
骨髓血涂片制成后，在空气中快速摇动或扇干。
[0242]
2)滴加瑞氏-姬姆萨a液
[0243]
滴加瑞氏-姬姆萨a液约0.5～0.8ml于涂片上，并让染液覆盖整个标本染色1min。
[0244]
3)滴加瑞氏-姬姆萨b液
[0245]
将瑞氏-姬姆萨b液滴加于a液上面(滴加量为a液的2～3倍)，以嘴或洗耳球吹出威风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色8min。
[0246]
4)水洗
[0247]
冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉渣在标本，干燥，镜检。
[0248]
图7为对比例1中骨髓血涂片瑞氏-姬姆萨染色结果图，图中双核巨核细胞，细胞核蓝色深染。
[0249]
对比例2：
[0250]
该对比例采用市售的中杉通用sp试剂盒(链酶卵白素-生物素法检测系统，货号：sp-9000)，采用hrp-dab显色系统，对骨髓血涂片进行cd41染色，手工操作步骤如下：
[0251]
1)样本制备
[0252]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0253]
2)固定
[0254]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0255]
3)阻断内源性过氧化物酶
[0256]
加入内源性过氧化物酶封闭剂100μl，室温孵育10min，清洗液冲洗3次，3min/次。
[0257]
4)滴加封闭用正常山羊血清工作液
[0258]
加入封闭用正常山羊血清工作液100μl，37℃孵育10min，倾去血清，勿洗。
[0259]
5)一抗孵育
[0260]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂100μl，37℃孵育60min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0261]
6)滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔igg
[0262]
加生物素标记山羊抗小鼠/兔igg 100μl，37℃孵育10min，清洗液冲洗3次，3min/次。
[0263]
7)滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液
[0264]
加入辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液100μl，37℃孵育10min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0265]
8)dab显色
[0266]
dab底物：dab缓冲液＝1:20稀释比，室温孵育8min，以棕色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗3次，3min/次。
[0267]
9)苏木素复染
[0268]
室温复染3min，衬染细胞核，纯化水冲洗，晾干，显微镜下观察。
[0269]
图8为对比例2中骨髓血涂片样本染色结果图，结果表明市售sp试剂盒(链酶卵白素-生物素法检测系统)低倍镜下可见巨核细胞胞膜和胞质阳性部位被染成棕色，但胞核蓝色不清晰，dab棕色阳性细胞不易与红细胞区分，不如ap红染时对比更为鲜明，这种现象在涂片较厚、样本边缘部位、红细胞堆叠时更为明显。另该视野下可见较多点状棕色着色，为中性粒细胞非特异性染色，高倍镜下更为明显。
[0270]
对比例3：
[0271]
该对比例采用市售的中杉通用sp试剂盒(链酶卵白素-生物素法检测系统，货号：sp-9000)，采用hrp-aec显色系统，对骨髓血涂片进行cd41染色，手工操作步骤如下：
[0272]
1)样本制备
[0273]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0274]
2)固定
[0275]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0276]
3)阻断内源性过氧化物酶
[0277]
加入内源性过氧化物酶封闭剂100μl，室温孵育10min，清洗液冲洗3次，3min/次。
[0278]
4)滴加封闭用正常山羊血清工作液
[0279]
加入封闭用正常山羊血清工作液100μl，37℃孵育10min，倾去血清，勿洗。
[0280]
5)一抗孵育
[0281]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂100μl，37℃孵育60min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0282]
6)滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔igg
[0283]
加生物素标记山羊抗小鼠/兔igg 100μl，37℃孵育10min，清洗液冲洗3次，3min/次。
[0284]
7)滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液
[0285]
加入辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液100μl，37℃孵育10min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0286]
8)aec显色
[0287]
在小试管中先加入850μl去离子水，再分别加入50μl aec缓冲液、50μl aec底物、50μl aec色原，混匀得到1ml的aec显色工作液。室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗3次，3min/次。
[0288]
9)苏木素复染
[0289]
室温复染3min，衬染细胞核，纯化水冲洗，晾干，显微镜下观察。
[0290]
图9为对比例3中骨髓血涂片样本染色结果图，a所示为低倍镜下(10
×
)肉眼可见巨核细胞hrp-aec着色，另可见较多点状分布的粒细胞非特异性染色。b为高倍镜(20
×
)下粒细胞非特异性染色。
[0291]
对比例4：
[0292]
该对比例采用市售的中杉通用sp试剂盒(链酶卵白素-生物素法检测系统，货号：sp-9000)，采用hrp-aec显色系统，对骨髓血涂片进行cd41染色，该实施例不加二抗，手工操作步骤如下：
[0293]
1)样本制备
[0294]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0295]
2)固定
[0296]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0297]
3)阻断内源性过氧化物酶
[0298]
加入内源性过氧化物酶封闭剂100μl，室温孵育10min，清洗液冲洗3次，3min/次。
[0299]
4)滴加封闭用正常山羊血清工作液
[0300]
加入封闭用正常山羊血清工作液100μl，37℃孵育10min，倾去血清，勿洗。
[0301]
5)一抗孵育
[0302]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂100μl，37℃孵育60min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0303]
6)aec显色
[0304]
在小试管中先加入850μl去离子水，再分别加入50μl aec缓冲液、50μl aec底物、50μl aec色原，混匀得到1ml的aec显色工作液。室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗3次，3min/次。
[0305]
7)苏木素复染
[0306]
室温复染3min，衬染细胞核，纯化水冲洗，晾干，显微镜下观察。
[0307]
对比例2、对比例3、对比例4采用市售sp试剂盒(链酶卵白素-生物素法检测系统)hrp染色系统进行cd41免疫细胞化学染色，分别为hrp-dab显色、hrp-aec显色、在不添加二抗时的hrp-aec显色，结果如图8、图9、图10所示，均存在粒细胞非特异性染色对于骨髓血涂片样本来说，因为红细胞、粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞中富含内源性过氧化物酶，完全封闭血及骨髓涂片中髓样白细胞的内源性过氧化物酶非常困难。因此均存在粒细胞非特异性染色，胞质异形、胞核皱缩变小。血膜较厚、边缘部位红细胞量较大时，内源性过氧化物酶封闭不彻底，红细胞背景与cd41阳性表达颜色接近，不易区分。
[0308]
对比例5：
[0309]
该对比例采用市售的天津矿博同生生物技术有限公司cd41抗体检测试剂盒(链酶卵白素-生物素法检测系统)，对骨髓血涂片进行免疫组化染色，手工操作步骤如下：
[0310]
1)样本制备
[0311]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0312]
2)固定
[0313]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0314]
3)一抗孵育
[0315]
加生物素化cd41抗体试剂50μl(覆盖面积约1.5cm
×
1.5cm～1.5cm
×
3.0cm)，室温孵育50min。清洗液冲洗2次，5min/次。
[0316]
4)二抗孵育
[0317]
滴加碱性磷酸酶标记的链酶卵白素工作液50μl，室温孵育40min。清洗液冲洗2次，5min/次。
[0318]
5)坚固红显色
[0319]
取1ml快红缓冲液溶解2mg坚固红(现用现配，10min内有效)，滴加300μl于标本上显色20分钟。去离子水冲洗3次，3min/次。
[0320]
6)苏木素复染
[0321]
滴加苏木素100μl，室温复染30min，衬染细胞核，清水冲洗。
[0322]
7)返蓝
[0323]
用150μl返蓝液返蓝5～10s，清水冲洗，晾干，显微镜下观察。
[0324]
图11为对比例5中骨髓血涂片样本染色结果图，结果表明手工染色前需要划定区域面积约1.5cm
×
1.5cm～1.5cm
×
3.0cm，抗体试剂添加量少，对于较少细胞条件下微巨核细胞极易漏检，因此可能出现假阴性。生物素化的cd41一抗(30～50)μl，碱性磷酸酶标记的链酶卵白素二抗(30～50)μl，坚固红显色液300μl，苏木素100μl，返蓝液150μl，添加量各不相同，脱离说明书不便于记忆。且坚固红粉体2mg溶于1ml，称取溶解易有误差，重复性差，无法保证每次染色时配液浓度完全一致，因此染色稳定性难以保证。显色时间相对较长，苏木素复染时间更长，且苏木素复染后，蓝色较深，红细胞也被染成蓝灰色。返蓝液返蓝后稍有改善，但效果甚微。尤其对于一些骨髓血涂片相对较厚的样本，隐藏在堆叠的红细胞下的阳性巨核细胞较难识别，易出现假阴性。总体步骤繁琐，操作复杂，时间较长，染色结果一致性难以保证。
[0325]
对比例6：
[0326]
采用同对比例3同一来源的骨髓血涂片样本，采用本发明中河南赛诺特生物技术有限公司ap二抗聚合物进行cd41手工染色，所用试剂同实施例2，具体方法如下：
[0327]
1)样本制备
[0328]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0329]
2)固定
[0330]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0331]
3)一抗孵育
[0332]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂100μl，室温孵育60min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0333]
4)二抗孵育
[0334]
加入碱性磷酸酶(ap)标记的二抗聚合物100μl，室温孵育30min，使一抗与二抗特异性结合；清洗液冲洗3次，3min/次。
[0335]
5)快红显色
[0336]
快红显色剂：快红活化剂：快红缓冲液＝1:1:20稀释比，室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗3次，3min/次。
[0337]
6)苏木素复染
[0338]
室温复染3min，衬染细胞核；去离子水冲洗3次，3min/次。晾干，显微镜下观察。
[0339]
图12为对比例6中骨髓血涂片样本染色结果图，其中骨髓血涂片样本与对比例3来源相同，骨髓血涂片cd41免疫细胞化学采用ap红染对巨核细胞阳性表达清晰，定位准确。碱
性磷酸酶底物产生的鲜红色阳性信号比传统的过氧化物酶dab、aec染色更清晰明亮，且没有中性粒细胞非特异性染色现象。该操作程序简单，使用方便，染色稳定性好。巨核细胞阳性染色与苏木素胞核复染对比分明，无需返蓝处理；
[0340]
其中，对比例2～6染色结果总结如下表所示。
[0341][0342]
试验例1和试验例2是进一步解释说明了常规选择辣根过氧化物酶染色系统进行骨髓血涂片免疫组化染色时的缺陷，以及本技术选择非生物素法碱性磷酸酶染色系统的优势。
[0343]
试验例1：
[0344]
该试验例采用赛诺特自研辣根过氧化物酶标记的羊抗兔聚合物aec显色系统，对比分析80％甲醇水溶液配制不同浓度过氧化氢封闭剂、封闭时间对骨髓血涂片hrp-aec染色效果。cd41染色手工操作步骤如下：
[0345]
1)样本制备
[0346]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0347]
2)固定
[0348]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0349]
3)阻断内源性过氧化物酶
[0350]
加入不同浓度的过氧化氢封闭剂(80％甲醇溶液配制，如下表所示)100μl，室温孵育10min/20min/30min，清洗液冲洗3次，3min/次。
[0351]
4)一抗孵育
[0352]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂100μl，室温孵育60min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0353]
5)二抗孵育
[0354]
加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔聚合物100μl，室温孵育30min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0355]
6)aec显色
[0356]
在小试管中先加入850μl去离子水，再分别加入50μl aec缓冲液、50μl aec底物、50μl aec色原，混匀得到1ml的aec显色工作液。室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去
离子水冲洗3次，3min/次。
[0357]
7)苏木素复染
[0358]
室温复染3min，衬染细胞核，纯化水冲洗，晾干，显微镜下观察。
[0359]
试验例2：
[0360]
该试验例不添加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔聚合物二抗，cd41染色手工操作步骤如下。
[0361]
1)样本制备
[0362]
骨髓血涂片后充分干燥，制备好的涂片在一个月内完成检测。
[0363]
2)固定
[0364]
固定剂为现配现用的体积比1:1的甲醇-丙酮溶液。采用固定剂固定90秒，自然晾干，得到待染色的涂片。
[0365]
3)阻断内源性过氧化物酶
[0366]
加入不同浓度的过氧化氢封闭剂100μl(80％甲醇溶液配制，如下表所示)，室温分别孵育10min/20min/30min，清洗液冲洗3次，3min/次。
[0367]
4)一抗孵育
[0368]
加cd41兔抗人单克隆抗体试剂100μl，室温孵育60min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0369]
5)空白对照(tbs清洗液代替hrp标记二抗聚合物)
[0370]
滴加tbs清洗液100μl，室温孵育30min。清洗液冲洗3次，3min/次。
[0371]
6)aec显色
[0372]
在小试管中先加入850μl去离子水，再分别加入50μl aec缓冲液、50μl aec底物、50μl aec色原，混匀得到1ml的aec显色工作液。室温孵育8min，以红色沉淀的形式呈现；去离子水冲洗3次，3min/次。
[0373]
7)苏木素复染
[0374]
室温复染3min，衬染细胞核，纯化水冲洗，晾干，显微镜下观察。
[0375]
图13中a、b为试验例1的染色结果，图14为试验例2的染色结果，试验例1和2中不同浓度过氧化氢封闭剂和封闭时间对骨髓血涂片cd41 hrp-aec染色结果与图13和图14结果相似。图13中的a说明，采用hrp-aec染色能够将巨核细胞cd41阳性标记出来，巨核细胞被染成砖红色，但仍存在中性粒细胞非特异性染色，如图13中的b。图14说明，当tbs清洗液代替辣根过氧化物酶标记的二抗聚合物(空白对照)，本应该无任何细胞有cd41阳性着色，但出现了如图14所示的中性粒细胞非特异性染色，说明虽然采用不同浓度过氧化氢封了不同时间，但无法将骨髓血涂片中内源性过氧化物酶彻底封闭。
[0376]
下表所示为过氧化物酶封闭剂浓度及封闭时间对cd41染色结果的影响。由下表可知，30％过氧化氢封闭剂封闭内源性过氧化物酶时间更短，室温3min内即可基本完成封闭，但浓度过高实用性不强，最终染色效果与3％过氧化氢封闭剂无明显差异。
[0377]
a)过氧化氢封闭剂浓度为0.3％～2％时，封闭处理10～30min，不加二抗时，低倍镜下即可见较多粒细胞非特异性染色。过氧化氢封闭剂浓度为3％时，封闭处理10～20min，不加二抗时，高倍镜下粒细胞非特异性染色仍明显可见，低倍镜下不明显。说明骨髓血涂片中内源性过氧化物酶仍旧难以彻底封闭。
[0378]
b)因为骨髓血涂片样本个体差异性较大，有的血膜较薄，有的较厚。对于血膜较薄
的骨髓血涂片，较高浓度的封闭剂封闭时反应速度过快难以把控，而且易造成脱片、细胞团聚变形。因此过氧化氢封闭剂浓度不能过高。
[0379]
c)对比例1-5以及试验例1-2的染色结果证实：骨髓血涂片hrp-dab、hrp-aec染色时虽然巨核细胞能正常着色，但粒细胞非特异性着色现象无法避免，从而影响结果判读。ap碱性磷酸酶染色对巨核细胞阳性表达清晰，定位准确，特异性更好，本发明骨髓血涂片小巨核细胞染色试剂盒的首选ap红染。
[0380][0381]
内源性过氧化物酶广泛存在于红细胞的血红蛋白、中性粒细胞的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mpd)、单核细胞、嗜酸性粒细胞。骨髓血涂片的红细胞、粒细胞中内源性过氧化物酶的含量尤其高，完全封闭这些内源性过氧化物酶非常困难，同时封闭可引起一些抗原决定簇变性。常规采用的辣根过氧化物酶dab染色系统，骨髓血涂片经过3％甚至高达10％过氧化氢(80％甲醇溶液配制)的封闭处理，细胞堆叠成簇，脱片率高，而且不能完全消除内源性过氧化物酶，导致最终染色结果出现中性粒细胞非特异性染色，影响结果的准确判读。而且有研究者认为甲醇-h2o2封闭处理方法太强烈，可能会引起一些抗原变性。因此对于骨髓血涂片，最好采用非过氧化物酶标记的抗体，如碱性磷酸酶。碱性磷酸酶底物产生的鲜红色阳性信号比传统的过氧化物酶dab染色更清晰明亮。
[0382]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。